Bài giảng Tế bào gốc - Bài 4: Các yếu tố điều hoà chu kì tế bào gốc tạo máu - Trần Hồng Diễm

Nội dung text: Bài giảng Tế bào gốc - Bài 4: Các yếu tố điều hoà chu kì tế bào gốc tạo máu - Trần Hồng Diễm

1. Cyclin D3 Chuột đột biến cyclin D3: • Sống, HSCs và TB tiền thân dòng tuỷ bình thường • Sự trưởng thành TB hạt,TB T và B bị khiếm khuyết -> cyclin D3 cần thiết ở giai đoạn muộn trong sự phát triển tạo máu Ewa Sicinska et al. Mol. Cell. Biol. 2006;26:8052-8060
2. • Chuột đột biến cyclin D2, D3 bị thiếu máu nguyên hồng cầu khổng lồ trầm trọng • Chuột đột biến cyclin D1, D3 cho thấy bất thường về thần kinh và khiếm khuyết trong sự phát triển cerebellum. • Chuột đột biến 3 loại cyclin D thể hiện sự giảm số lượng HSC và TB tiền thân tạo máu rõ rệt có liên quan đến sự mất khả năng khôi phục lại. Chuột thiếu máu trầm trọng và chết ở trong tử cung
3. Cyclin E • Có 2 loại cyclin E ở ĐVHN: E1, E2 đồng biểu hiện ở tất cả các TB tăng sinh • Chuột đột biến cyclin E1 có đời sống bình thường, không thể hiện rõ sự bất thường nào • Chuột đột biến cyclin E2 sống nhưng chuột đực giảm khả năng sinh sản do khiếm khuyết trong sự phát triển tinh hoàn • Chuột đột biến cyclin E1 và E2 sao chép bên trong TB Cyclin E Ablation in the Mouse nhân khổng lồ và TB433 khổng lồ trophoblast bị khiếm khuyết trầm trọng, sự tạo máu tương đối bình thường Cell. 2003 Aug 22;114(4):431-43. Figure 2. Testicular Abnormalities in Cyclin E-Deficient Mice (A) Histologic sections of testes from 2- to 3-month-old wild-type (WT), cyclin E1Ϫ/Ϫ, and cyclin E2Ϫ/Ϫ males, stained with hematoxylin and eosin. Note the paucity of cells in the seminiferous tubules of cyclin E2Ϫ/Ϫ animals and the presence of aberrant meiotic figures (arrow). Original magnification 20ϫ. The right panel shows higher magnification of the boxed region. (B) The mean testicular weight in 2- to 3-month-old WT (n ϭ 10), cyclin E1Ϫ/Ϫ (n ϭ 12), and cyclin E2Ϫ/Ϫ (n ϭ 12) males. Error bars denote standard errors. (C) Sperm counts in same experimental groups as in (B). in cyclin E1Ϫ/ϪE2Ϫ/Ϫ conceptuses suggested to us that of maternal blood flow, and production of angiogenic the mutant trophoblast cells might fail to undergo normal factors and hormones that influence placental function endoreplicative cycles. To verify this hypothesis, we (Cross, 2000; Cross et al., 2002), we hypothesized that quantitated the DNA content in trophoblast giant cells the placental dysfunction due to trophoblast cell defect of wild-type mice and in the corresponding trophoblast might be the cause of lethality in cyclin E1Ϫ/ϪE2Ϫ/Ϫ em- cells of cyclin E1Ϫ/ϪE2Ϫ/Ϫ animals by Feulgen staining. bryos. Diploid cells of the maternal decidua were used to stan- dardize our measurements. As expected, in wild-type E Type Cyclins Are Dispensable placentas, trophoblast giant cells contained up to 1000 for the Development of the Embryo Proper N of DNA, with the majority of cells containing over To verify this hypothesis, we turned to the tetraploid 100 N of DNA. In contrast, the DNA content of cyclin complementation rescue method (Eggan et al., 2001; E1Ϫ/ϪE2Ϫ/Ϫ trophoblast cells was greatly reduced, with Tanaka et al., 1997). In this technique, two-cell-stage virtually all cells containing less than 100 N DNA (Figure embryos are collected from pregnant wild-type females 3D). These findings suggest that E type cyclins are re- and fused by a pulse of an electric current, yielding one- quired for repeated rounds of endoreplication in tropho- cell tetraploid embryos. These embryos are then kept in blast giant cells, and consequently, in the absence of E vitro for 2 days and develop into tetraploid blastocysts. type cyclins, the trophoblast cells fail to undergo normal Mutant ES cells are then injected into tetraploid blasto- endoreplicative cycles. Given the critical central func- cysts and the chimeric embryos are implanted into foster tion of trophoblast giant cells in placental physiology, females for further development. Importantly, tetraploid including invasion into the maternal tissues, formation blastocysts cannot contribute to the embryo proper but of the blood vessels in the labyrinth layer, promotion can form normal placentas and other extraembryonic
4. Cyclin A • Tế bào ĐVHN có 2 loại cyclin A: A1 và A2 • Cyclin A1 hầu hết chỉ biểu hiện ở tinh hoàn, đặc biệt ở TB mầm SD đực trong giảm phân • Cyclin A2 biểu hiện ở tất cả các TB đang tăng sinh • Chuột đực đột biến cyclin A1 vô sinh, do chu kì TB mầm bị ngừng ở pha prophase giảm phân GĐ sợi kép, ngay trước giảm phân I -> Cyclin A1 cần thiết cho giảm phân ở chuột đực • Phôi chuột đực đột biến cyclin A2 chết nhanh chóng sau khi làm tổ. • cyclin A hoặc cyclin E có đủ khả năng để điều khiển fibroblast vào pha S và tiếp tục, điều khiển TB vào pha M • Cyclin A biểu hiện cao trong khi cyclin E không biểu hiện trong dòng TB tạo máu -> Cyclin A thiết yếu cho diễn tiến chu kì TB HSC và ESC
5. Cyclin B • Có 3 loại cyclin B ở ĐVHN: B1, B2, B3 • Chuột đột biến cyclin B2 phát triển bt, không thể hiện rõ bất thường • Chuột đột biến cyclin B1 chế trong tử cung GĐ phát triển sớm, lúc này HSC còn chưa điển hình
6. Yếu tố điều hoà bên trong Cyclin CDKs • Cyclin D • CD4 và CDK6 • Cyclin E • CDK2 • Cyclin A • CDK1 • Cyclin B E2F Rb family CKI • Ink4 family • Cip/Kip family
7. A. Matsumoto, K.I. Nakayama / Biochimica et Biophysica Acta xxx (2012) xxx–xxx 3 A Cyclin B + CDK1 M G2 Ink4 family Cyclin A + CDK1/2 Cell cycle G1 S Cyclin D + CDK4/6 Cyclin E + CDK2 Cip/Kip family B P P P Rb Phosphorylation of Rb Cyclin (Activation of E2F) Cell cycle CKI CDK E2F progression Matsumoto A1, Nakayama KI (2013) Role of key regulators of the cell cycle in Fig. 2. Molecular mechanisms of cell cycle regulation. (A) Cells undergo three major transitions during themaintenance cellcycle. of hematopoietic The beginning stem cells, Biochim of S phase Biophys Acta is marked., 1830(2):2335-44 by the onset of DNA replication, the start of mitosis is accompanied by breakdown of the nuclear envelope and chromosome condensation, and the metaphase-to-anaphase transition is characterized by the segregation of sister chromatids. Cyclin-dependent kinases (CDKs) trigger the transitions from G1 to S phase and from G2 to M phase by phosphorylating distinct sets of substrates. D-type cyclins complexed with CDK4 or CDK6 are thought to regulate events in early G1 phase; the cyclin E–CDK2 complex is required to initiate S phase; cyclin A, together with CDK1 or CDK2, is then responsible for the continuation of S phase and for entry into mitosis; and the B-type cyclins complexed with CDK1 promote entry into mitosis. (B) Cyclin–CDK complexes phosphor- ylate retinoblastoma protein (Rb) family members and thereby inactivate their transcriptional corepressor function. The resulting activation of E2F-dependent gene transcription leads to the production of proteins that are required for DNA replication and other aspects of cell cycle progression. CDK inhibitors (CKIs) inhibit the activity of cyclin–CDK complexes, resulting in suppression of the cell cycle. knockin mice, in which both degrons of cyclin E1 are mutated by re- inactivation of the cyclin A2 gene. The reconstitution ability of cyclin placement of threonine with alanine, exhibit abnormal accumulation A2‐deficient bone marrow (BM) cells is also markedly impaired [29]. of cyclin E1 in hematopoietic cells as well as aberrant erythropoiesis Cyclin A is expressed at particularly high levels, whereas cyclin E is vir- characterized by marked expansion of abnormally proliferating progen- tually absent in the hematopoietic lineage [29]. Therefore, cyclin A–Cdk itors, impaired differentiation, dysplasia, and anemia. The HSCs of these complex predominates over cyclin E–Cdk complex in HSCs to a great mice appear normal, however [22,23]. extent, and this renders these cells dependent on cyclin A for cell- cycle progression. 3.1.3. Cyclin A Mammalian cells express two A-type cyclins, A1 and A2 [24]. Cyclin A1 is expressed almost exclusively in the testes, specifically in the male 3.1.4. Cyclin B germ cells during meiosis, whereas cyclin A2 is ubiquitously expressed There are three B-type cyclins—cyclins B1, B2, and B3—in mamma- in all proliferating cells and is thought to function as an S-phase cyclin lian cells. The amino acid sequences of cyclins B1 and B2 show little [25]. similarity in the first 100 residues and share ~57% identity over the Male mice lacking cyclin A1 are sterile as a result of the arrest of remaining 300 residues [24]. Mice lacking cyclin B2 develop normally germ cells in meiotic prophase at the diplotene stage, immediately and do not manifest any obvious abnormalities [30]. In contrast, cy- prior to the first meiotic division [26,27]. Cyclin A2‐deficient mouse em- clin B1‐deficient mice die in utero at an early stage of development, bryos die shortly after implantation [28]. The numbers of HSCs as well although their HSCs remain largely uncharacterized. Cyclin B3‐null as common myeloid progenitors are decreased in mice with conditional mice have not been generated to date. Stemness Stemness Stemness Not tested Cyclin D1/2/3 TKO Cyclin E1T74A/T393A KI p16 KO Cyclin E KO Cyclin A2 KO CDK2 KO p18 KO Cyclin A1 KO CDK4/6 DKO E2F1/2/3 TKO Cyclin B KO Rb/p107/p130 TKO p15 KO CDK1 KO p57 KO p21 KO p19 KO p27 KO Fig. 3. Summary of analyses performed with HSCs lacking cell cycle regulators. Most of the key cell cycle regulators have now been analyzed in HSCs, with the stemness phenotypes associated with single (KO), double (DKO), or triple (TKO) knockout of these proteins in mice being indicated. Cyclin E1T74A/T393A KI denotes knockin mice in which both degrons of cyclin E1 are mutated by replacement of threonine with alanine. Please cite this article as: A. Matsumoto, K.I. Nakayama, Role of key regulators of the cell cycle in maintenance of hematopoietic stem cells, Biochim. Biophys. Acta (2012), doi:10.1016/j.bbagen.2012.07.004
8. CDK4 và CDK6 • Tác động của CDK lên chu kì tế bào có liên quan tới cyclin • CDK4 và CDK6 gắn và được hoạt hoá bởi cyclin D (D1, D2, D3) • Chuột đột biến CDK4 sống và thể hiện khiếm khuyết tăng trưởng chỉ ở TB nội tiết chuyên biệt (vd: TB đảo tuỵ β) • CDK6 cần thiết cho sự tăng sinh TB biệt hoá hơn là HSC hay TB tiền thân GĐ sớm • Chuột đột biến CDK4 và CDK6: • Phôi chết ở GĐ muộn do thiếu máu tràm trọng bổi dòng hồng cầu bị khiếm khuyết • SL HSC, TB tiền thân dòng bạch cầu, dòng tuỷ,TB hạt- ĐTB giảm ở gan chuộ thai • Phát triển cơ quan bình thường, sự tăng sinh TB bình thường ngoại trừ TB tạo máu
9. Cdk2 Knockout Mice Are Viable 1777 CDK2 • CDK2 đóng vai trò chủ chốt trong chu kì TB - điều khiển TB chuyển vị từ pha G1 sang pha S (phối hợp với cyclin E) - giúp TB tiếp tục pha S (phối hợp với cyclin A) • Chuột đột biến CDK2 - sống được ít nhất 2 năm, vô sinh -> CDK2 không cần thiết cho sự tăng sinh và sống sót của hầu hết các loại TB -> CDK2 cần thiết để hoàn tất prophase I trong giảm phân ở TB mầm SD đực và cái - không thấy rõ sự bất thường HSC -> phức hợp CDK1–cyclin E có khả năng bù đắp sự thiếu hụt CDK2 Current Biology 2003, Vol. 13, 1775–1785 -/- -/- Figure 1. GenerationChu of Cdk2ộϪt/Ϫ Cdk2Mice and Cdk2 Expression AnalysisBuồng trứng Cdk2 The Cdk2 gene was inactivated in ES cells via the targeting construct shown in (A). This strategy introduces a neomycin cassette in place of exons 4 and 5. The PGK-TK was inserted at the 3Ј end of the targeting vector. 5Ј and 3Ј probes, located outside of the targeting vector, were used for Southern blot analysis with a PstI digest. Southern blot analysis of recombined ES clones and offspring mice from a chimera is shown in (B). Northern blots ([C], left panel) were performed on RNA from wild-type or Cdk2Ϫ/Ϫ thymus with a Cdk2-5Ј probe (partial Cdk2 cDNA encoded by exon 1 to exon 3) and Cdc2 probe (full-length ORF). RT-PCR analyses ([C], right panel) were performed from RNA of MEFs with Cdk2- or Cdc2-specific oligonucleotides (Cdk2 amplification: exon 1 to exon 3, exon 1 to exon 4, or full ORF; Cdc2 amplification: full- length ORF). Cdk2Ϫ/Ϫ mice are viable and develop normally, although adult animals appear to be slightly smaller than their littermates ([D], left panel). Ovaries from wild-type and Cdk2Ϫ/Ϫ animals are shown in (D) (right panel).
10. LETTERS NATURE | Vol 448 | 16 August 2007 TKO MEFs exited quiescence when stimulated with serum, albeit (Fig. 2e). These observations indicate that, in the absence of inter- with significantly delayed (6–8 h) kinetics (Fig. 2a). However, most phase Cdks, Cdk1 can be activated by D-type and/or E-type cyclins to primary and immortal TKO MEFs entered the cell cycle (Fig. 2b) and phosphorylate pRb and bring cells out of quiescence. executed the molecular steps that are known to be required to pro- Finally, we investigated whether Cdk1 was essential for cell division. ceed into S phase, including pRb phosphorylation, E2F-dependent To this end, we generated mutant mice that were heterozygous for induction of cyclin A2 expression and degradation of the Cdk inhib- Cdc2a from two independent embryonic stem cells that carried b-geo itor Cdkn1b (Fig. 2c). In addition, Cdk1 formed complexes withCDK1cassette insertions within this locus19,20 (Fig. 3a). These integration • CDK1 cùng với cyclin B cần thiết cho TB nguyên phân cyclin D1 as early as 12 h after serum stimulation. These complexes events generate a Cdk1–b-geo fusion protein that contains only were observed only at• later Phôi time pointschuột (beyond đột 24bi h)ến in controlcác interphasethe 12 amino-terminal CDK (CDK2, residues ofCDK3, Cdk1 (Fig. 3b). Heterozygous MEFs (Fig. 2d). Thus, it isCDK4, tempting CDK6) to speculate that Cdk1–cyclin Cdc2a1/mut1 cells express about 50% as much Cdk1 as is present in 1/mut1 D complexes might be- functionallysinh tạo relevant cơ quan during và mitotic phát exit triểwild-typen đến cellsGĐ (Fig.giữa 3c). th Crossesời kì between thai heterozygous Cdc2a 1/mut2 and/or early G1 phase, a periodnghén when other cyclins are being actively or Cdc2a mice did not yield homozygous Cdc2a mutant animals targeted by the anaphase-promoting complex/cyclosome18. nor midgestation embryos (E10.5–E13.5) (Fig. 3d). Likewise, we could Next, we investigated- CDK1 whether gắ Cdk1–cyclinn với tất complexes cả các were cyclinnot identify-> phosphoryl E2.5 (morula stage)hoá orRb E1.5 và (2–4-cell) Cdc2amut1/mut1 or responsible for allowing TKOsự bi cellsểu to hi enterện Sgen phase. đượ Wec infectedđiều hoàCdc2a bởmut2/mut2i E2F embryos. Analysis of 23 morulae that were allowed to TKO MEFs with lentiviral- fibroblast vectors expressing có either chu control kì orTB short kéo growdài indo culture sự forb 5–6ất dayshoạ usingt protein nested primers also failed to identify mut1/mut1 hairpin RNAs (shRNAs) specifichọ Rb for khôngCdc2a , theđủ locusmạnh that encodes homozygous Cdc2a embryos (Fig. 3d). Moreover, the percent- Cdk1. Knockdown of Cdk1 had no effect on the ability of cells expres- age of wild-type and Cdc2a1/mut1 embryos were those expected if sing Cdk4 and Cdk2 to exit• Phôi G0 and chu enterột S phaseđột (Fig.biế 2e).n CDK1 However, homozygous embryos were not viable. Finally, crosses between wild- Cdk1 depletion completely- không abrogated th Sể phase phát entry tri in TKOển MEFs,đến angiaitype đo andạn Cdc2amorula1/mut1 vàmale blastocyst and female mice yielded the expected per- effect that correlated with- CDK1 the inhibition được cho of pRb là phosphorylation duy trì sự tcentageăng sinh of Cdc2a HSC1/mut1 offspring (data not shown), indicating that àCDK1 là CDK duy nhất thiết yếu cho chu kì TB Nature. 2007 16;448(7155):811-5 a Cdk4+/–; Cdk6–/–; Cdk2+/– Cdk4–/–; Cdk6–/–; Cdk2–/– Ki67 (proliferate marker) staining b c Cdk4: +/+ –/– –/– Cdk6: +/+ +/+ –/– Cdk4: +/+ –/– –/– –/– +/+ +/+ –/– +/+ Cdk2: +/+ –/– –/– St. Cdk6: +/+ –/– +/+ –/– +/+ +/+ +/+ –/– S608 Cdk2: +/+ –/– –/– +/+ +/– –/– +/+ +/+ S780 S807/811 Cdk4 β-Actin Cdk6 +/+–/– –/– –/– +/+–/– +/+ Cdk2 d Cdk4: Cdk6: +/+ –/– +/+ –/– +/++/+ –/– Cdk1 Cdk2: +/+ –/– –/– +/+ –/– +/+ +/+ MW Cdk7 Cdk1 Cdk9 CycD1 CycD1 IP: CycD1 CycD2 Cdk1 CycE1 CycD2 CycA2 IP: CycD2 CycB1 Cdk1 p21Cip1 IP: CycE1 p27Kip1 e Cdk4: +/+ –/– –/– p57Kip2 Cdk6: +/+ –/– +/+ Cdk2: +/+ –/– –/– M IP: pRb pRb-P CycD2 β-Actin pRb-P CycE1 Figure 1 | Characterization of embryos lacking all interphase Cdks. Cdk4–/–;Cdk6–/–;Cdk2–/– E12.5 embryos using antibodies specific for a, Embryos lacking all interphase Cdks undergo organogenesis and develop phosphorylated residues S608, S780 and S807/811. St.: pRb phosphorylation until midgestation. Left, Cdk41/–;Cdk6–/–;Cdk21/– E12.5 embryos. Right, at these residues in TKO serum-starved cells. d, Extracts from E12.5 embryos Cdk4–/–;Cdk6–/–;Cdk2–/– E12.5 embryos. In both cases, the left image depicts of the indicated genotype were immunoprecipitated with antibodies against a picture of the whole embryo and the right image depicts a Ki67- cyclin D1 (top), cyclin D2 (middle) and cyclin E1 (bottom) and analysed by immunostained sagittal section (312). Scale bar, 1mm. b, Expression of cell immunoblotting using antiserum against Cdk1, cyclin D1 and cyclin D2 as cycle regulators in independent E12.5 embryos of the indicated genotype. indicated. Results from two independent embryos are shown for wild-type, Results from TKO embryos are shown next to results from wild-type TKO and double mutant embryos. M, mock immunoprecipitate; W, whole embryos (left column). Protein extracts were analysed by immunoblotting cell extract at a 1:10 dilution before immunoprecipitation. e, In vitro kinase with antibodies elicited against the indicated proteins (see Methods). activity associated with cyclin D2 (top) and cyclin E1 (bottom) Expression of b-actin served as loading control. c, Analysis of pRb immunoprecipitates using pRb as substrate. M, mock immunoprecipitate. phosphorylation in wild-type, Cdk4–/–;Cdk61/1;Cdk2–/– and 812 © 2007 Nature Publishing Group
11. Yếu tố điều hoà bên trong Cyclin CDKs • Cyclin D • CD4 và CDK6 • Cyclin E • CDK2 • Cyclin A • CDK1 • Cyclin B E2F Rb family CKI • Ink4 family • Cip/Kip family
12. EF2F • Ở ĐVHN có 9 protein thuộc họ EF2F • E2F1, E2F2, E2F3A tương tác với Rb-> activator E2Fs -> hoạt hoá sự biểu hiện gen • E2F4 to E2F8 được biết như là repressor E2Fs -> kìm hãm sự biểu hiện gen - E2F4 và E2F5 kìm hãm sự biểu hiện gen theo cơ chế phụ thuộc họ Rb - E2F6, E2F7, E2F8 tăng cường sự biểu hiện gen theo cơ chế độc lập Rb
13. EF2F (tt) • Chuột đột biến E2F1 có số lượng TB T tăng nhẹ trong tuyến ức do apoptosis bị sai sót • Chuột đột biến E2F2 - sự trưởng thành TB hồng cầu bị khiếm khuyết - sau này phát triển bệnh tự miễn do tăng cường tăng trưởng TB T nhớ và T hỗ trợ • Chuột đột biến E2F1 và E2F2 - sự trưởng thành TB hồng cầu bị khiếm khuyết - bị thiếu máu nguyên HC khổng lồ - giảm khả năng biệt hoá thành TB B trong GĐ tiền TB B • Chuột đột biến E2F1, E2F2 và E2F3 - có số lượng TB tuỷ giảm - chức năng HSC vẫn duy trì bình thường
14. Yếu tố điều hoà bên trong Cyclin CDKs • Cyclin D • CD4 và CDK6 • Cyclin E • CDK2 • Cyclin A • CDK1 • Cyclin B E2F Rb family CKI • Ink4 family • Cip/Kip family
15. Rb family • Có 3 thành viên đóng vai trò yếu tố điều hoà phiên mã: Rb, p107, p130 kiểm soát sự tăng sinh và biệt hoá TB • Rb tương tác với activator E2Fs (E2F1, E2F2, E2F3) và cũng tương tác với repressor E2F4 • p107, p130 tương tác với repressor E2Fs (E2F4, E2F5). • Rb biểu hiện khá đều đặn trong suốt chu kì TB • p130 biểu hiện cao nhất khi chu kì TB ngừng • p107 biểu hiện cao nhất trong suốt pha S • Chuột đột biến p130 không thấy bất thường nào rõ ở TB máu • Chuột đột biến p107 chỉ ở chuột Balb/c có sự tăng sản dòng tuỷ nhẹ • Chuột đột biến Rb - không sống được - khiếm khuyết ở nhiều mô, gồm thành phần tạo máu với sự giảm hình thành đảo máu trong gan thai, tăng tỉ lệ TB HC chưa trưởng thành có nhân
16. Yếu tố điều hoà bên trong Cyclin CDKs • Cyclin D • CD4 và CDK6 • Cyclin E • CDK2 • Cyclin A • CDK1 • Cyclin B E2F Rb family CKI • Ink4 family • Cip/Kip family