›
›

Bài giảng Công nghệ di truyền - Chương 6: Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở E. coli - Nguyễn Vũ Phong

Vector biểu hiện
• Trình tự ori tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ.
• Gene chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo
duy trì vector trong tế bào.
• Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc
tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các
gene được tạo dòng.
• Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết
ribosome (rbs) được bố trí thích hợp và codon khởi
đầu AUG.
• Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào theo hướng
chính xác với promoter. 
pdf 19 trang thiennv 19100 Free
Download
Bạn đang xem tài liệu "Bài giảng Công nghệ di truyền - Chương 6: Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở E. coli - Nguyễn Vũ Phong", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên.

File đính kèm:

  • pdfbai_giang_cong_nghe_di_truyen_chuong_6_bieu_hien_cua_dna_tai.pdf

Nội dung text: Bài giảng Công nghệ di truyền - Chương 6: Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở E. coli - Nguyễn Vũ Phong

  1. Lợi thế của protein dung hợp • Không cần thiết kế rbs và codon khởi đầu dịch mã nếu dung hợp ở đầu N-ter • Tăng sự ổn định, khả năng hòa tan, gấp cuộn, tạo cầu nối disulphide • Sự sẵn có của các kháng thể của protein dung hợp dùng trong western blot/đánh giá sự biểu hiện của protein • Giúp tăng khả năng thu nhận tinh sạch
  2. Các thẻ (tag) đánh dấu • GST (glutathion-S-transferase): – Kết hợp và bảo vệ protein – Giúp dễ dàng tinh sạch bằng sắc ký ái lực • Maltose binding protein – Kết hợp với protein và vận chuyển ra ngoài periplasmic giúp dễ dàng tinh sạch – Tinh sạch bằng amylose (1 loại maltose) • Thioredoxin: • Histidin tag: 6H, tinh sạch bằng cột nickel
  3. Phát hiện protein dung hợp • Sàng lọc dòng vi khuẩn bằng enzyme cắt và điện di trên gel. • Sàng lọc dòng vi khuẩn biểu hiện protein dung hợp – Nuôi dòng vi khuẩn – Kích ứng biểu hiện (IPTG hoặc nhiệt độ) – Tách chiết dịch bằng SDS – Biến tính và điện di trên gel polyacrylamide (SDS PAGE) – Nhận biết bằng nhuộm màu hoặc Western blotting
  4. Protein Ladder 1 2 3 4
  5. Western blot (anti-His tag conjunged HRP) SP1 SP2 4oC 4oC 16oC 30oC 16oC - 30oC - 70kD 40kD
  6. Tinh sạch protein 1. Thể vùi (inclusion) 2. Hòa tan thể vùi - Phá tế bào - Tinh sạch thể vùi - Hòa tan thể vùi 3. Thu nhận protein
  7. Tinh sạch protein