Bài giảng Công nghệ di truyền - Chương 6: Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở E. coli - Nguyễn Vũ Phong
Vector biểu hiện
• Trình tự ori tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ.
• Gene chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo
duy trì vector trong tế bào.
• Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc
tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các
gene được tạo dòng.
• Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết
ribosome (rbs) được bố trí thích hợp và codon khởi
đầu AUG.
• Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào theo hướng
chính xác với promoter.
• Trình tự ori tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ.
• Gene chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo
duy trì vector trong tế bào.
• Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc
tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các
gene được tạo dòng.
• Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết
ribosome (rbs) được bố trí thích hợp và codon khởi
đầu AUG.
• Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào theo hướng
chính xác với promoter.
19 trang
10/11/2022
2660
Bạn đang xem tài liệu "Bài giảng Công nghệ di truyền - Chương 6: Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở E. coli - Nguyễn Vũ Phong", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên.
File đính kèm:
- bai_giang_cong_nghe_di_truyen_chuong_6_bieu_hien_cua_dna_tai.pdf
Nội dung text: Bài giảng Công nghệ di truyền - Chương 6: Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở E. coli - Nguyễn Vũ Phong
- Lợi thế của protein dung hợp • Không cần thiết kế rbs và codon khởi đầu dịch mã nếu dung hợp ở đầu N-ter • Tăng sự ổn định, khả năng hòa tan, gấp cuộn, tạo cầu nối disulphide • Sự sẵn có của các kháng thể của protein dung hợp dùng trong western blot/đánh giá sự biểu hiện của protein • Giúp tăng khả năng thu nhận tinh sạch
- Các thẻ (tag) đánh dấu • GST (glutathion-S-transferase): – Kết hợp và bảo vệ protein – Giúp dễ dàng tinh sạch bằng sắc ký ái lực • Maltose binding protein – Kết hợp với protein và vận chuyển ra ngoài periplasmic giúp dễ dàng tinh sạch – Tinh sạch bằng amylose (1 loại maltose) • Thioredoxin: • Histidin tag: 6H, tinh sạch bằng cột nickel
- Phát hiện protein dung hợp • Sàng lọc dòng vi khuẩn bằng enzyme cắt và điện di trên gel. • Sàng lọc dòng vi khuẩn biểu hiện protein dung hợp – Nuôi dòng vi khuẩn – Kích ứng biểu hiện (IPTG hoặc nhiệt độ) – Tách chiết dịch bằng SDS – Biến tính và điện di trên gel polyacrylamide (SDS PAGE) – Nhận biết bằng nhuộm màu hoặc Western blotting
- Protein Ladder 1 2 3 4
- Western blot (anti-His tag conjunged HRP) SP1 SP2 4oC 4oC 16oC 30oC 16oC - 30oC - 70kD 40kD
- Tinh sạch protein 1. Thể vùi (inclusion) 2. Hòa tan thể vùi - Phá tế bào - Tinh sạch thể vùi - Hòa tan thể vùi 3. Thu nhận protein
- Tinh sạch protein
