Giáo trình Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử

I. Dụng cụ và hóa chất
1. Dụng cụ
Nhìn chung, các phòng thí nghiệm thực hiện các thí nghiệm sinh
học phân tử và chuyển gen (di nạp gen) không có dụng cụ gì đặc biệt so
với các phòng thí nghiệm sinh học khác. Tuy nhiên, so với các thí nghiệm
sinh hóa vẫn thường được tiến hành trước đây thì các loại hóa chất thường
dùng với lượng ít hơn, do DNA và RNA nếu lẫn với nuclease thì dễ dàng
bị phân giải và các chất thường hấp phụ lên bề mặt thủy tinh nên thường
phải sử dụng các ống chất dẻo nhỏ. Hơn nữa, sự tạp nhiễm DNA thường
làm hỏng các thí nghiệm nên tốt hơn hết là sử dụng dụng cụ một lần trong
chừng mực kinh tế còn cho phép. Dụng cụ thường dùng trong các phòng
thí nghiệm sinh học phân tử có thể là:
1.1. Các loại ống (tubes) gồm các loại ống Eppendorf 1,5 ml, 0,5 ml (hãng
Eppendorf, hãng BioRad...) dùng cho hầu hết các phản ứng như các phản
ứng enzyme các loại như phản ứng enzyme hạn chế, chiết xuất nucleic
acid (NA) bằng phenol, kết tủa nucleic acid bằng ethanol... và sau đó cũng
với những ống này có thể quay li tâm trong những máy li tâm chuyên
dụng. Các loại ống nghiệm dùng một lần như ống Falcon 2059, ống
Corning 25216 P loại 4 ml thì không chịu được li tâm với vận tốc cao. Các
loại ống nghiệm 12 ml có thể li tâm trong máy li tâm lạnh có ống lót
(adaptor) đến 10.000 vòng/phút (v/ph) và cũng có thể sử dụng cho việc kết
tủa bằng ethanol. Các loại ống nghiệm chất dẻo nắp vặn có đáy nhọn có
thể dùng để tập trung vi khuẩn nhưng không được quay li tâm ngoài phạm
vi 3.000 v/ph. Các loại ống nghiệm polyethylene cỡ 50 ml được sử dụng
rộng rãi trong việc đựng hóa chất, chiết xuất nucleic acid bằng phenol với
lượng lớn. Một số ống nghiệm chất dẻo không thể sử dụng với chloroform,
một số khác có thể hấp cao áp tiệt trùng, đa số các loại ống nghiệm chất
dẻo được bán ở dạng đã khử trùng (thường bằng tia gamma, trừ các ống
Eppendorf).
1.2. Máy li tâm thường sử dụng là loại có gắn đầu rotor cho ống nghiệm
Eppendorf với tốc độ 13.000 đến 15.000 v/ph, thường để tập trung các hợp
chất thí nghiệm xuống đáy ống nghiệm như trong thí nghiệm kết tủa
nucleic acid bằng ethanol, chloroform hoặc trong quá trình chiết xuất bằng
3
phenol...
1.3. Các loại pipet (ống hút) và pipetor (ống hút điện động) có các loại đầu
(tip) cho micropipet tự động sử dụng một lần. Thường phân chia thành một
số loại theo dung lượng, hình thức và thiết kế tùy hãng: 0,1 µl ~ 5 µl, 1 ~
20 µl, 20 ~ 200 µl, 200 ~ 1.000 µl... Dù dung lượng nhỏ cũng thường có
sai số ít nhiều, vì vậy trong đa số các thí nghiệm đòi hỏi lượng chính xác
cần tuân thủ nguyên tắc không đổi loại pipet một khi không thật cần thiết.
Các đầu pipet (tip, còn gọi là "đầu côn") cần cho vào hộp giá (rack), đậy
nắp và hấp cao áp tiệt trùng. 
pdf 170 trang thiennv 11/11/2022 4800
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên.

File đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_ky_thuat_co_ban_trong_sinh_hoc_phan_tu.pdf

Nội dung text: Giáo trình Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử

  1. 11 ngoại cũng có thể phát hiện được các băng DNA trong quá trình điện di cũng như sau khi điện di. Kiểu dạng (pattern) các băng phụ thuộc vào thành phần DNA có trong mẫu cần điện di. 2) Nếu không cho trước ethidium bromide thì sau khi điện di cần ngâm gel 30 - 60 phút trong dung dịch thuốc nhuộm này ở nồng độ 0,5 μg/ml. 3) Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu thì có thể dùng máy ảnh pollaroid với ống kính có phin lọc ánh sáng thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiết bị phân tích gel số hóa (gel documentation system). Chú ý: Đèn tử ngoại (UV) có hai loại bức xạ với bước sóng 254 nm (UV sóng ngắn) và 366 nm (UV sóng dài). UV sóng ngắn giúp quan sát rõ DNA nhưng làm tổn hại cấu trúc chất này, cho nên nếu cần thu hồi DNA từ gel thì không nên áp dụng. 2. Điện di polyacrylamide 2.1. Chế gel polyacrylamide Gel polyacrylamide thường đặt đứng, để chế gel cần sử dụng các tấm thủy tinh có kết cấu chuyên dụng để làm khuôn. Hình 3: Sơ đồ một mẫu khuôn bản gel polyacrylamide đơn giản. Trước khi đổ dịch tạo gel cần dán các mép bằng băng keo dán và kẹp chặt (hoặc kẹp trong giá chuyên dụng) cho kín các mép hai bên và đáy. Về nguyên tắc để phân li DNA (cũng như các chất khác như protein) thường cần bản gel polyacrylamide gồm hai thành phần: gel phân tách (separating gel) có nồng độ tương đối cao và lớp gel tập trung có nồng độ thấp. Gel tập trung (stacking gel) có tác dụng làm nguyên liệu tập trung
  2. 12 tạo nên một băng mẫu vật gọn, mảnh (các thành phần của mẫu nằm sát nhau nên có cùng điểm xuất phát), trước khi chúng đi vào lớp gel phân tách. Tuy nhiên, nhiều khi do lượng mẫu cần điện di rất nhỏ, không cần lớp gel tập trung này. Dưới đây cách chế bản gel chỉ gồm gel polyacrylamide phân tách thường dùng trong điện di DNA. Khuôn gel thường làm từ hai tấm thủy tinh khác nhau: một tấm hình chữ nhật, tấm khác có kích thước hoàn toàn tương tự nhưng được cắt bớt một phần ở một cạnh trừ hai góc, hai phần chừa lại này làm thành hai "tai" ("rabbit ear"). Phần cắt bớt của tấm kính là nơi ráp "lược" tạo các lỗ tải mẫu và sau đó, trong quá trình điện di, là nơi dung dịch đệm điện di kết nối với gel duy trì dòng điện giữa hai đầu (đầu có tai và đầu đáy) của bản gel. Để chế gel polyacrylamide phân tách DNA cần thực hiện các bước sau: 1) Rửa sạch các tấm thủy tinh kỹ bằng nước sạch, để khô rồi lau lại bằng ethanol. Ráp các tấm thủy tinh theo hướng dẫn của hãng sản xuất sao cho tạo được khoảng hở giữa hai tấm thủy tinh được bịt kín ba phía để không làm chảy nguyên liệu tạo gel khi rót vào. Trước tiên đặt tấm thủy tinh nguyên, đặt các thanh cách dọc theo mép tấm thủy tinh đó, rồi đặt tấm thủy tinh có "tai" lên trên sao cho các cạnh của hai tấm thủy tinh trùng khít nhau. Trong một số trường hợp, tùy thiết kế, có thể cần dán các mép bên và khe hở đáy bản gel bằng băng keo rồi dùng kẹp để kẹp các tấm thủy tinh (kẹp trước để các tấm thủy tinh ổn định, dán từng cạnh rồi thay kẹp). Tuy nhiên, cũng có thiết kế gài vào khuôn ngoài không cần kẹp. 2) Chế gel theo nồng độ thích hợp cho việc phân tách DNA như trình bày trong bảng sau (pha 100 ml): Nồng độ gel PA Dung dịch 30% Dung dịch 10% Dung dịch đệm (%) (và DNA có acrylamide ammonium TBE 20× (ml) thể phân li) (29+1)* (ml) persulfate (ml) 4 (100 - 1.000 bp) 13,3 0,5 5 6 (80 - 500 bp) 20 0,5 5 8 (60 - 400 bp) 26,7 0,5 5 12 (40 - 200 bp) 40 0,5 5 16 (10 - 100 bp) 53,3 0,5 5 * Acrylamide 29 g, N,N'-methylene-bis-acrylamide 1 g, thêm nước cất cho đủ 100 ml, bảo quản ở 4 °C được mấy tháng. 3) Bổ sung vào dung dịch này 15 µl TEMED (N,N,N',N'-tetramethyl- ethylenediamine) lắc nhẹ cho đều rồi rót vào giữa khuôn thủy tinh sao cho
  3. 13 không hình thành bọt khí trong gel. Thông thường, nên rót gel từ một mép trong khuôn. Trong quá trình này, nếu bản gel không được cố định trước (như gel dùng cho việc giải trình DNA) thì cần nâng dần miệng bản khuôn gel từ thế nằm ngang lên cao dần để gel không bị chảy ra ngoài còn bọt khí (nếu có) cũng từ từ thoát lên trên mà ra khỏi gel. Bọt khí thường gây biến dạng các băng sản phẩm nhưng điều quan trọng là ôxy làm giảm khả năng polymer hóa của acrylamide. Khi gel lỏng đã đầy khuôn bản gel, cắm lược vào đầu khuôn gel (khoảng giữa hai tai) rồi kẹp chặt (chú ý chỉ nên kẹp lược với bản thủy tinh nguyên, không kẹp cả hai tấm thủy tinh để không tạo khe hở giữa gel và hai tấm thủy tinh sau khi bỏ kẹp khỏi khuôn bản gel, do có sự đàn hồi các tấm thủy tinh bị ép vào nhau thẳng trở lại sau khi bỏ kẹp). Trong trường hợp cần bổ sung lớp gel tập trung ở trên thì khuôn bản gel phải cố định theo đúng phương thẳng đứng (kiểm tra bằng thủy bình kế), sau khi rót đủ lượng gel phân tách (chừa lại một khoảng ở trên) cần bổ sung lớp nước cất ở phía trên mà không cần cài lược. Chờ đến khi gel phân tách hóa rắn thì rót bỏ lớp nước này, thay bằng gel tập trung (gel nồng độ thấp) rồi ráp lược lên trên để tạo các lỗ giếng tải mẫu điện di. Thông thường gel cứng trong vòng 30 phút. Tuy nhiên, thời gian hóa rắn của gel tăng khi nhiệt độ hạ cũng như khi nồng độ TEMED và ammonium persulfate tăng.
  4. 14 2.2. Điện di gel polyacrylamide 1) Sau khi gel cứng lấy lược ra khỏi khuôn bản gel, tháo khuôn bản gel khỏi khuôn ngoài hoặc kẹp cũng như vật chắn khác sao cho gel có hai đầu (trên và dưới) thông với bên ngoài. Gắn khuôn bản gel vào chậu điện di. 2) Gắn điện cực vào chậu điện di sao cho cực âm (cathode) ở trên còn cực dương (anode) ở dưới. (Các cặp dây dẫn và ổ cắm trên máy có màu tương phản, thường là đỏ và đen; trong khi thực hiện không làm giao chéo). 3) Điện di tiền khởi bằng điện áp 20 V trong 30 - 60 phút. 4) Trộn 0,1 - 1 µg DNA với dung dịch màu tải mẫu điện di 6×, cho vào mỗi lỗ răng lược khoảng 20 µl (với lỗ 0,5 cm). 5) Điện di với 100 - 200 V điện một chiều trong khoảng 1 - 3 giờ, có thể quan sát thấy vị trí của dịch màu trong gel để quyết định dừng điện di.
  5. 15 Hình 4: Sơ đồ ráp bản gel vào bể điện di đứng với trường hợp chạy một bản gel. Bên trái đã ráp gel điện di, bên phải không điện di nhưng cần ráp một tấm thủy tinh để giữ nước cho bể dung dịch đệm ở cathode. Nếu điện di hai gel thì ráp đối xứng. Bảng dưới chỉ mối quan hệ giữa độ lớn của DNA với dịch màu BPB và XC khi dịch chuyển trong gel agarose. Trong quá trình điện di vệt cần theo dõi băng màu lam dịch chuyển, dừng nguồn điện khi băng này cách mép dưới của bản gel khoảng 0,5 - 1 cm. Nồng độ gel agarose (%) BPB (màu lam) XC (màu lục) 3,5 ~100 bp ~460 bp 5,0 65 260 8,0 45 160 12,0 20 70 20 12 45
  6. 16 6) Sau khi điện di tháo gel khỏi khuôn, nhỏ lên bề mặt gel dung dịch ethidium bromide 5 µg/ml, để 15 - 30 phút cho ngấm, rửa gel rồi soi UV để quan sát các băng DNA. Hình 5: Kết quả điện di trong gel polyacrylamide DNA để giải trình. Các làn có các băng tách biệt là kết quả của quá trình dịch chuyển từ một điểm (giếng tải mẫu) với vận tốc khác nhau phụ thuộc độ lớn của các DNA. 3. Thu hồi đoạn DNA từ gel điện di Nếu có nhu cầu sử dụng các phân đoạn DNA đã được phân li và tinh chế nhờ điện di cho các thí nghiệm tiếp theo thì thao tác để thu hồi DNA từ gel là cần thiết. Có một số phương pháp thu hồi DNA được trình bày và chúng có những ưu điểm và nhược điểm nhất định như thời gian thao tác, độ phức tạp và tỷ lệ thu hồi, cũng như khả năng lẫn các polymer hòa tan hoặc các chất hỗn tạp có trong gel agarose và gel polyacrylamide làm cản trở đến các phản ứng sẽ thực hiện trong thí nghiệm sau đó. Phương pháp dùng giấy DEAE cần thời gian ngắn và lượng chất hỗn tạp tương đối ít nhưng từ gel polyacrylamide tỷ lệ thu hồi các đoạn DNA dài hoặc DNA một sợi thường thấp. Phương pháp thu hồi nhờ điện di có thể thực hiện để thu hồi DNA từ gel agarose cũng như polyacrylamide nhưng lượng thu hồi được dưới dạng dung dịch với lượng tương đối lớn cần phải cô đặc, cho nên chất hỗn tạp lẫn nhiều. Hơn nữa, từ gel agarose việc thu hồi thường khó khăn. Phương pháp hồi thu từ agarose tan chảy nhiệt độ thấp có thể thu hồi DNA trong thời gian ngắn thao tác cũng đơn giản, tỷ lệ thu hồi cao không phụ thuộc vào độ lớn của các đoạn DNA nhưng hỗn tạp nhiều.
  7. 17 3.1. Phương pháp sử dụng giấy DEAE (DE 81) 1) Trong khi điện di DNA trong gel agarose (có ethidium bromide trong gel hoặc pha trong dịch đệm điện di), quan sát các băng DNA đích dưới UV khi thấy băng đó đã phân li hoàn toàn thì dùng dao cắt thành rãnh ở trước và sau băng DNA rồi chèn giấy Whatman DE 81 vào đó. 2) Tiếp tục điện di cho đến khi băng DNA bám hết vào giấy DE 81 thì cắt điện. 3) Lấy giấy DE 81 ra khỏi gel, cho vào ống Eppendorf 0,5 ml đã được chọc thủng ở đáy (hoặc ống bơm tiêm 1 ml) rồi lắp vào trong một ống li tâm lớn hơn (như ống Eppendorf 1,5 ml đối với ống 0,5 ml, hoặc ống li tâm 10 ml đối với bơm tiêm 1 ml) rồi cho vào đó một lượng dung dịch đệm TAE có 50 mM NaCl, quay li tâm và lặp lại 3 lần như vậy để rửa sạch. Dung dịch đệm TAE có 50 mM NaCl chứa Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, NaCl 50mM (không hòa tan DNA). 4) Thêm 100 µl TE chứa NaCl 1M, quay li tâm nhẹ rồi để yên cho ngấm đều vào giấy DE khoảng 5 phút, sau đó li tâm lại làm cho dung dịch đệm thoát xuống hết. Lặp lại ba lần để cho DNA thoát hết khỏi giấy DE theo dung dịch đệm. 5) Chiết xuất bằng phenol và bằng chloroform mỗi thứ một lần để loại bỏ tạp chất rồi kết tủa bằng ethanol ba lần mỗi lần đều kết tủa ở nhiệt độ −70 °C rồi quay li tâm thu hồi. 3.2. Phương pháp thu hồi bằng điện di 1) Xác nhận các băng DNA (bằng UV với gel đã nhuộm ethidium bromide) rồi cắt băng DNA đích đã hoàn toàn phân li khỏi gel. Cho mẫu gel đó vào túi thẩm tích đã buộc kỹ một đầu, để cho dung dịch đệm ngấm đều rồi kẹp đầu còn lại. 2) Đặt túi thẩm tích vào chậu điện di nằm ngang sao cho hướng điện di vuông góc với túi thẩm tích. 3) Cứ để vậy mà điện di với điện áp 100 - 200 V, soi dưới UV xác nhận băng DNA đã thoát hết ra khỏi gel. Để tăng độ thu hồi cần điện di ngược chiều vài phút (cho DNA đã bám vào túi thoát ngược trở lại dung dịch) rồi mở túi hút hết dịch ra (nhưng cần tránh hút gel) cho vào ống nghiệm, chiết xuất bằng phenol và chloroform rồi kết tủa bằng ethanol để thu hồi DNA.
  8. 18 3.3. Phương pháp chiết xuất DNA từ gel nghiền (từ gel polyacrylamide) 1) Xác nhận (bằng UV) vị trí DNA đã phân li cần thu hồi, cắt thu lấy gel. 2) Cho mẫu gel vào ống 1 ml, nghiền nát, hoặc cho vào ống Eppendorf rồi dùng đũa thủy tinh nghiền nát. 3) Cho gel nát vào ống nghiệm rồi cho vào đó dung dịch đệm dung xuất (thường là lượng ngập không quá 2 lần lượng gel, nhiều hay ít tùy nồng độ của DNA trong gel), ủ mấy giờ cho đến qua đêm ở 37 °C (nếu cần, khi lượng nhỏ DNA khó tạo kết tủa thì thêm RNA nấm men đến nồng độ 10 µ g/ml). Dung dịch đệm dung xuất chứa ammonium acetate ở nồng độ 500mM, MgCl2 10mM, EDTA 1mM và SDS 1%. 4) Li tâm nhẹ rồi thu lấy nước mặt, dùng cột DEAE cellulose để tinh chế, cô đặc (xem phần sau). Chiết xuất bằng phenol-chloroform rồi chloroform và sau đó kết tủa bằng ethanol để thu hồi DNA. 3.4. Thu hồi từ gel agarose tan chảy nhiệt độ thấp Gel agarose tan chảy nhiệt độ thấp có nhiệt tan chảy 60 °C và gel hóa ở 30 °C do một số hãng (như BioRad, Takara ) sản xuất và phát mại. 1) Chế gel nêu trên bằng cách pha vào dung dịch đệm, làm tan chảy ở khoảng 70 °C, pha ethidium bromide ở khoảng 37 °C rồi đổ bản gel, hạ nhiệt cho gel trở nên cứng. 2) Điện di với điện áp thấp để tránh tăng nhiệt độ làm tan chảy gel. 3) Soi UV với sự trợ giúp của ethidium bromide, cắt băng DNA đích đã phân li. 4) Thêm vào 5 lần TE, ủ ở 65 °C cho gel tan chảy. 5) Thêm một lượng tương đương phenol-chloroform, trộn đều rồi quay li tâm thu lấy nước mặt rồi chiết xuất bằng chloroform lần nữa. 6) Kết tủa bằng ethanol để thu hồi DNA. Chú ý: một số hãng đã sản xuất và phát mại kit thu hồi DNA bằng cách nghiền và làm tan gel agarose thông thường. Chẳng hạn "QIAquick Gel Extraction Kit" của hãng QIAGEN Co. dùng máy li tâm cỡ nhỏ cao tốc, có thể chiết xuất và làm sạch các đoạn DNA dài từ 70 bp đến 10 kb từ gel (thông thường cũng như nóng chảy thấp) điện di trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE. Bộ kit này gồm dung dịch QG (màu vàng), dung dịch PE,
  9. 19 dung dịch đệm EB, ethanol, các cột hấp phụ (QIAquick spin column) và ống chứa 2 ml, Các bước thu hồi DNA như sau. 1) Cắt băng DNA khỏi gel bằng một lưỡi dao sắc (trong khi soi dưới đèn UV năng lượng thấp). Bỏ phần gel dư thừa đến mức tối đa. 2) Cân lát gel trong ống Eppendorf 1,5 ml (không màu). Thêm vào đó 3 lần thể tích đệm QG (lọ màu vàng của kit). 3) Ủ ở 50 °C khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn. Thỉnh thoảng trộn xoáy cho gel tan dễ dàng hơn. 4) Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch, màu vàng như màu dung dịch QG nguyên gốc là được. Nếu màu hỗn hợp da cam hoặc tím thì thêm 10 μl (cho trường hợp 100 mg gel) sodium acetate pH 5,0, màu sẽ chuyển lại sang màu vàng. 5) Thêm 1 thể tích isopropanol bằng lượng gel ban đầu vào và trộn đều hỗn hợp giúp tăng khả năng thu hồi DNA nhỏ hơn 500 bp hoặc lớn hơn 4 kb. 6) Đặt một QIAquick spin column (cột) vào một ống thu hồi (đều có sẵn). 7) Rót hỗn hợp vào cột và quay li tâm 1 phút cho DNA hấp phụ vào cột. Chú ý thể tích tối đa của ống chứa là 800 μl, nếu dịch thừa thì tải lên cột lần nữa rồi lại li tâm thêm 1 phút. 8) Bỏ dịch qua cột rồi đặt cột lại vào ống chứa. 9) Thêm ethanol (96 - 100%) vào dung dịch PE có sẵn trước khi dùng. Cho 0,75 ml PE này vào cột, để 2 - 5 phút, quay li tâm 1 phút để rửa. 10) Bỏ nước thoát qua, lắp cột lại vào ống chứa và li tâm thêm 1 phút ở 10.000 ×g để loại bỏ hoàn toàn ethanol. 11) Đặt cột vào một ống li tâm 1,5 ml sạch. 12) Để trích li DNA, thêm 50 μl dung dịch đệm EB (Tris.HCl, 10mM) hoặc nước cất vào giữa cột, hoặc nếu cần tăng nồng độ DNA thì cho 30 μl dịch dung xuất (elution solution) để yên 1 phút, rồi quay li tâm 1 phút ở tốc độ tối đa (thường 10.000 ×g hay 13.000 v/ph). Chú ý: dung dịch DNA trong nước cần ở pH 7,0 - 8,0, và dễ bị phân hủy hơn trong dung dịch đệm nên cần bảo quản ở −20 °C. Dùng TE để dung xuất cũng được nhưng EDTA (trong thành phần của TE) có thể gây trở ngại cho các phản ứng enzyme. Cũng có thể sử dụng Prep-A-Gene DNA Purification System (hãng
  10. 20 BioRad) với những hạt hấp phụ Prep-A-Gene matrix tinh chế DNA từ băng agarose gel thông thường.
  11. 21 III. Chiết xuất bằng phenol Trong các phương pháp chiết xuất và tinh chế DNA thì phương pháp chiết xuất bằng phenol và chloroform là những phương pháp cơ bản. Nguyên lý của việc sử dụng phenol trong chiết xuất DNA như sau. Tuy ở nhiệt độ thường phenol ở dạng tinh thể rắn (tan chảy ở 80 °C) nhưng khi lẫn với khoảng 20% nước (v/v) thì phenol ở dạng nhũ tương gồm các phân tử phenol ở giữa với các phân tử nước vây quanh. Khi pha hỗn hợp này vào dịch tế bào, các phân tử phenol có tính kị thủy nên có khuynh hướng liên kết vào vùng kị thủy của protein ở bên trong cấu trúc của các phân tử này, kết cục làm protein trương phồng lên và lộ xuất nhóm bên kị thủy (của gốc amino acid) ra ngoài. Các nhóm kị thủy này của protein khi đó kết hợp với nhau tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein khác nhau. Trong khi đó DNA vẫn tiếp tục là chất tan trong nước và có thể hút sang ống chứa khác. Thao tác loại bỏ protein, lipid và các chất khác tan trong dung dịch DNA là chiết xuất bằng phenol rồi bằng phenol-chloroform sau đó bằng chloroform hoặc chloroform-isoamyl alcohol (24:1). Sử dụng cả hai loại dung môi hữu cơ thường cho hiệu quả cao nhưng cũng có thể dùng chỉ một loại. Tuy nhiên, nhiều khi cần phải loại bỏ hoàn toàn phenol khỏi dung dịch, khi đó cần phải lặp lại việc chiết xuất bằng chloroform hoặc ether. Phenol có ưu điểm có thể tan trong nước (ở mức độ nhất định) nên không cần khuấy trộn nhiều cũng có thể làm biến tính protein tan trong nước, trong khi đó sử dụng chloroform hay chloroform-isoamyl alcohol thì phải trộn đảo kỹ vì các chất này không tan trong nước. Pha thêm chloroform vào phenol làm tính kị thủy của phenol tăng nên làm tăng hiệu quả biến tính protein. 1. Chế phenol 1) Đun nóng (cách thủy) phenol tinh thể đông cứng (loại đặc biệt) ở 68 - 80°C để làm tan chảy. Thêm oxine (8-hydroxyquinoline) ở 0,05 - 0,1% (có tác dụng phòng ngừa ôxy hóa phenol). 2) Thêm lượng khoảng 1/2 ~ 1/3 dung dịch Tris 1M (pH 8,0), trộn đều rồi để yên, loại bỏ lớp nước mặt rồi lặp lại thao tác một lần nữa. Tris có tác dụng làm phenol bão hòa trở nên trung tính. Khi đó, dưới lớp dung dịch đệm là lớp phenol, mỗi lần cần sử dụng phenol thì cho pipet (bịt đầu trên) xuống lớp phenol và hút lượng phenol cần dùng.
  12. 22 3) Bảo quản ở 4 ºC, có thể để đến mấy tháng. 2. Chiết xuất phenol và chloroform 1) Thêm vào dung dịch DNA một lượng tương đương phenol hoặc phenol- chloroform. 2) Trộn đều để tạo dạng huyền dịch. Nếu cần chiết xuất DNA phân tử lượng lớn cần tránh trộn mạnh, cần thêm thời gian chiết xuất. 3) Li tâm ở nhiệt độ phòng khoảng 3 phút ở 2.000 v/ph (1.600 ×g) hoặc ít phút với ống Eppendorf ở tốc độ cao. 4) Hút lấy lớp nước (lớp trên nếu nồng độ muối NaCl của dung dịch thấp hơn 1,5M) chuyển sang lọ mới. 5) Nếu cần thì chiết xuất lặp lại với phenol-chloroform và chloroform. Chú ý: Với DNA phân tử lượng thấp nên dùng phương pháp chiết xuất phenol-chloroform và chloroform với NaCl lớn hơn 0,1M vì DNA nhỏ có thể hòa tan trong phenol.
  13. 23 IV. Cô đặc và thẩm tích nucleic acid Thông thường trong các trường hợp cô đặc, loại bỏ muối và đổi dịch đệm của nucleic acid (DNA, RNA) người ta vận dụng phương pháp kết tủa bằng ethanol. Tuy nhiên, tùy trường hợp có khi không thể sử dụng được phương pháp này người ta có thể vận dụng phương pháp khác. Khi sử dụng phương pháp kết tủa ethanol nếu thu được sản phẩm chứa nhiều tạp chất (như khi dung xuất DNA từ gel polyacrylamide) người ta phải dùng phương pháp hấp phụ bằng cột nhựa/chất nhồi hấp phụ (thường gọi là "cột cao su hấp phụ" hay "cột chất nhồi hấp phụ", "absorbent resin column") trao đổi ion âm để vừa cô đặc vừa làm sạch DNA. 1. Cô đặc 1.1. Kết tủa bằng ethanol 1) Cho 2 đến 2,5 lần ethanol vào dịch DNA có chứa sodium acetate và NaCl nồng độ 0,2M trở lên, trộn đều rồi cho vào buồng lạnh −20 hoặc −70 °C để kết tủa. Có thể thay NaCl bằng sodium phosphate với lượng rất nhỏ cũng có tác dụng gây kết tủa DNA. Tuy nhiên, nếu dùng sodium phosphate thì sau đó cần thẩm tích để loại bỏ muối này. 2) Duy trì nhiệt độ thấp: khoảng 10 - 15 phút ở −70 ºC, hoặc khoảng 1 - 12 giờ ở −20 °C. 3) Quay li tâm 15 phút ở 4 °C với tốc độ 15.000 v/ph để tập trung kết tủa. Trước khi li tâm có thể thấy kết tủa trắng trong ống nghiệm, khi đó chỉ cần quay li tâm nhẹ 3.000 v/ph ở 4 °C trong vòng 10 phút cũng đủ để tập trung tủa. Thậm chí có thể dùng móc thủy tinh móc riêng phần tủa DNA dưới dạng sợi trắng khỏi dịch ethanol nếu hàm lượng DNA đủ lớn. 4) Bỏ nước mặt, để loại bỏ muối khỏi tủa cần thêm (khoảng hai lần thể tích mẫu) ethanol 70% vào ống, lại li tâm rót bỏ ethanol. Nếu nhiều DNA thì có thể nhúng móc mang DNA vào lọ chứa ethanol 70% một ít phút, lượng muối trong DNA sẽ giảm. 5) Sấy khô hoặc hong khô ống chứa DNA rồi thêm dung dịch đệm TE hoặc nước cất để có dung dịch DNA với nồng độ thích hợp. Chú ý: Có thể thay thế ethanol bằng isopropanol với lượng nhỏ hơn (lượng tương đương với dịch DNA) khi cần kết tủa DNA trong dịch khá lớn với ống không thể thêm 2,5 lần thể tích ethanol. Tuy nhiên, sau đó nên kết tủa lại với ethanol vì khó làm khô isopropanol, ít hòa tan muối và chỉ
  14. 24 dùng isopropanol khi thật cần thiết (do mùi khó chịu ). 1.2. Cô đặc bằng butanol 1) Thêm vào dịch DNA một lượng tương đương hoặc hơn chút ít n- butanol, trộn đều rồi li tâm nhẹ. 2) Hút bỏ butanol rồi thêm vào lượng butanol khác và lặp lại thao tác trên. 3) Hút bỏ butanol rồi thêm vào một lượng tương đương ethyl ether so với lượng dịch còn lại. 4) Quay li tâm rồi hút bỏ ether (ether sẽ chiết xuất butanol khỏi dịch). 5) Loại bỏ vết ether còn lại bằng cách bơm không khí (tốt hơn là khí nitơ) qua ống hút Pasteur vào trong ống nghiệm để làm khô mẫu. Cũng có thể dùng buồng áp suất thấp (buồng chân không) để làm bay hơi ether. 6) Hòa tan DNA vào TE hoặc nước cất. 1.3. Phương pháp sử dụng cột (DEAE-cellulose column) 1) Cột DEAE-cellulose có thể được chế từ ống pippet loại 1 ml hoặc ống hút Pasteur. Trước tiên lấy một ống sạch, nhét vào chỗ thắt của ống một lượng nhỏ bông đã loại dầu mỡ, hấp cao áp tiệt trùng. 2) Cho lên lớp bông khoảng 0,2 ml Sephadex 50 đã tiệt trùng, rồi cho lên đó khoảng 0,1 ml DE 52 cũng đã tiệt trùng (hai chất liệu được hòa riêng trong nước rồi hấp cao áp). 3) Cho mẫu dịch DNA chảy qua ống để hấp phụ DNA, dịch qua lần đầu được rót cho đi qua cột lần nữa. 4) Rửa cột bằng dung dịch đệm với một lượng gấp mấy lần thể tích cột, chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, NaCl 50mM và EDTA 1mM. 5) Dung xuất bằng dung dịch đệm nêu trên nhưng với nồng độ NaCl cao hơn, chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, NaCl 1,0M và EDTA 1mM. Kết tủa bằng ethanol. 2. Thẩm tích 1) Ngâm ống thẩm tích (túi thẩm tích, có thể mua được từ một số hãng) trong nước chứa EDTA khoảng 50mM rồi đun sôi trong 10 phút. 2) Thay nước cất mấy lần, quấy để rửa sạch. 3) Để nước cất vậy mà hấp cao áp tiệt trùng 10 phút, rồi bảo quản ở 4 ºC. Tuyệt đối không để màng (ống) thẩm tích bị khô nước.