Giáo trình Vi sinh vật học thú y (Phần 1)

Chƣơng 1
TRỰC KHUẨN GRAM ÂM YẾM KHÍ TÙY TIỆN
A. HỌ TRỰC KHUẨN ĐƢỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE
I. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA HỌ ENTEROBACTERIACEAE
1. Phân loại
Họ Enterobacteriaceae (họ trực khuẩn đường ruột) có số lượng lớn chi khác
nhau. Cho đến năm nay (2001) đã xác nhận được 105 loài thuộc 30 chi, trong đó có 6 chi
vi khuẩn có ý nghĩa trong thú y và y học, Escherichia, Salmonella, Shigella,
Edwardsiella, Yersinia và Klebsiella (bảng I-1 đến bảng I-14). Bên cạnh đó còn có các
chi Buttiauxella (1 loài), Cedecea (3 loài), Citrobacter (3 loài), Enterobacter (8 loài),
Ewingella (1 loài), Kluyvera (2 loài), Koserella (1 loài), Leclercia (1 loài), Leminorella
(1 loài), Moelerella (1 loài), Morganella (1 loài), Proteus (3 loài), Providence (4 loài),
Raknella (1 loài), Serratia (7 loài), Tatumella (1 loài),...
2. Hình thái
Đây là những vi khuẩn hìmh que nhỏ (0,4 - 0,6 2 - 4 μm), hai đầu tròn, Gram âm,
tất cả, trừ Shigella và Klebsiella, do có lông roi (tiêm mao) và đều là chu mao khuẩn.
Một số vi khuẩn mất khả năng hình thành tiêm mao, như Salmonella pullorumgallinarum (cũng còn được coi là hai loài khác biệt Salmonella pullorum và Salmonella
gallinarum hay 2 dạng huyết thanh học - serovar). Các trực khuẩn đường ruột đều không
hình thành nha bào.
3. Tính trạng sinh hóa
Những tính trạng chung là yếm khí tùy tiện, lên men đường glucose, catalase
dương tính, oxidase âm tính, hoàn nguyên nitrate thành nitrite, hàm lượng
guanine+cytosine (G+C) (mol%) trong khoảng 39 đến 59%. Trong số các tính trạng trên
thì "oxidase âm tính" là tính trạng quan trọng trong việc phân loại. Dựa vào tính trạng
này, các trực khuẩn Gram âm được chia thành hai nhóm lớn. Tất cả các loài oxidase âm
tính được xếp vào họ Enterobacteriaceae. Các trực khuẩn Gram âm còn lại gồm nhiều họ
khác nhau được xếp chung vào nhóm "các vi khuẩn Gram âm hỗn hợp (miscellaneous
gram-negative bacteria)". Các tính trạng của các loài khác nhau thuộc họ này được liệt kê
ở bảng II-1, các biến thể trong một loài đồng nhất biểu hiện một số tính trạng khác biệt
được coi là các dạng sinh học (biovar) hoặc dạng hóa học (chemovar).
Phản ứng catalase xảy ra dễ dàng không cần có yếu tố hữu cơ nhận ôxy
(organic oxygen receptor) như trong phản ứng peroxidase, và rất đơn giản: Cho
H2O2 3% lên khuẩn lạc (tập lạc của vi khuẩn hoặc chân khuẩn) đã quệt trên phiến
kính hoặc giấy thấm, nếu thấy sủi bọt trong vòng 10 giây chứng tỏ phản ứng dương
tính.
Để kiểm tra phản ứng oxidase ta lấy khuẩn lạc quệt (bằng góc phiến kính
hay tăm tre hay tăm gỗ, không dùng que cấy kim loại vì có thể cho phản ứng dương
tính giả) lên giấy thấm đặt trên một phiến kính rồi làm ướt giấy đó bằng thuốc thử
oxidase chế bằng cách hòa 10 mg diethyl- (hoặc tetramethyl-) p-phenylenediamin
PGS. TS. Phạm Hồng Sơn *** Giáo trình Vi sinh vật học thú y *** Huế 2008
8
HCl vào 1 ml nước cất (tránh ánh sáng, có thể cất được 2 - 3 ngày). Có thể nhỏ
từng giọt thuốc thử này lên khuẩn lạc trong đĩa Petri hoặc tẩm thuốc thử vào giấy
thấm, sấy khô trong không khí ở chỗ tối, đậy kín, khi dùng thì bôi khuẩn lạc lên rồi
làm ướt giấy. Các trực khuẩn đường ruột có phản ứng oxidase âm tính: khuẩn lạc
không chuyển sang màu tím đen trong vòng 10 giây. 
pdf 114 trang thiennv 11/11/2022 2520
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Vi sinh vật học thú y (Phần 1)", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên.

File đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_vi_sinh_vat_hoc_thu_y_phan_1.pdf

Nội dung text: Giáo trình Vi sinh vật học thú y (Phần 1)

  1. 11 giờ nuôi cấy. Các vi khuẩn không lên men lactose có khuẩn lạc không màu. Vi khuẩn Gram dương không phát triển trên môi trường này. Để chế môi trƣờng thạch desoxycholate ta hòa 10 g peptone, 10 g lactose, 5,0 g NaCl, 2,0 g K2HSO4, 1,0 g citrate sắt II, 1,0 g citrate natri, 1,0 g desoxycholate natri, 16 g agar và 0,033 g neutral red vào 1 lít nước cất, chỉnh đến pH 7,3, đun cho tan chảy và trộn đều các thành phần, rót ra các đĩa lồng petri mà không cần hấp khử trùng cao áp. Khi phát triển, E. coli hình thành khuẩn lạc to, màu đỏ (trái với Shigella và Salmonella có các khuẩn lạc không màu). Môi trƣờng KIA (Kligler's iron agar: thạch sắt Kligler) và TSI (triple sugar iron: môi trường ba đường - sắt) là những môi trường thường dùng để cấy chuyển sau khi đã có lứa thuần khiết từ các môi trường thạch nêu trên. Để chế môi trường KIA, hòa 20 g peptone, 3 g cao thịt, 3 g cao men, 10 g lactose, 1 g glucose, 5 g NaCl, 0,5 g citrate sắt ammon, 0,5 g thiosulfate natri, 15 g agar và 0,025 g đỏ phenol (phenol red) vào 1 lít nước, đun cho tan đều, chỉnh (nếu cần) pH đến 7,4, rót vào các ống nghiệm nhỏ một lượng đủ lớn, hấp cao áp khử trùng ở 121 °C trong 15 phút, để nguội ở tư thế nghiêng ống sao cho khi thạch hóa rắn ta có phần nghiêng và phần đáy khá cao. Sau khi cấy vi khuẩn bằng cách chọc vào phần đáy và ria phết phần nghiêng và ủ một đêm có thể thấy một số tính trạng như sau: lên men lactose làm cả phần nghiêng lẫn phần đáy chuyển sang màu vàng (trường hợp VP dương tính thì phần nghiêng có thể trở lại màu hồng), nếu vi khuẩn chỉ lên men glucose thì chỉ phần đáy có màu vàng, nếu vi khuẩn sinh hơi thì lớp agar thường bị nứt nẻ và bị đẩy lên, nếu hình thành H2S thì phần đáy chuyển sang màu đen. Bảng I-2. Tính trạng giám biệt của các loài chủ yếu thuộc chi Escherichia Tính trạng ylase Tính gây bệnh Loài (gia súc, gia cầm và Indol người) Sorbit Citrate Adonit Mannit Lactose Di động Di Saccharose Glucose (hơi) Glucose Glucose (acid) Glucose KCN (0,0075%) KCN Sử dụng malonate dụng Sử Lysine decarboxylase Lysine Ornithine decarbox Ornithine E. coli + - + + V - - + + + V + - + Gây bệnh đường ruột Xâm nhập đường ruột Sinh độc tố đường ruột Sinh độc tố tế bào vero E. fergusoni + V + + + - V + + V - + + - Phân lập từ bệnh phẩm E. hermannii + V + - + + - + + V + V - - từ bệnh phẩm, thực phẩm E. vulneris + V + - + + - + + V V + - - từ bệnh phẩm, thực phẩm Ghi chú: V, phản ứng không ổn định. Tính trạng của E. coli là indol dương tính, methyl red (MR) dương tính, Voges- Proskauer (VP) âm tính, phản ứng sử dụng citrate âm tính, phản ứng sinh H2S âm tính, di động dương tính, lysine decarboxylase dương tính, lên men lactose và mannit. Hàm lượng G+C (mol%) là 50 - 51%. Hiện tại, kháng nguyên của chi Escherichia được biết gồm trên 167 loại kháng nguyên O, PGS. TS. Phạm Hồng Sơn Giáo trình Vi sinh vật học thú y Huế 2008
  2. 12 72 loại kháng nguyên K, 54 loại kháng nguyên H và 12 loại kháng nguyên F. Indol hình thành trong môi trường nhờ phân giải tryptophan (do thêm vào môi trường dưới dạng tinh chế hoặc do phân giải peptone) được phát hiện bằng thuốc thử Ehrlich (p-dimethyl aminobenzaldehyde) nhưng trong phương pháp tiêu chuẩn phải dùng thuốc thử Covač. Để có môi trường thử indol ta hòa 10 g peptone và 5 g NaCl vào 1.000 ml nước cất, chỉnh đến pH 7,2 - 7,4 rót vào ống hẹp rồi khử trùng ở 121 °C trong 20 phút. Để thử sự hiện diện của indol, ta cho 0,2 ml thuốc thử Covač (chế bằng cách hòa tan, nhờ hơ nóng nhẹ, 5 g p-dimethyl aminobenzaldehyde vào 75 ml isoamyl alcohol, sau đó cho thêm một lượng acid HCl đậm đặc bằng 1/3 thể tích dung dịch đó. Dung dịch này có thể bảo quản tránh ánh sáng được 2 tháng) rồi lắc đều với canh khuẩn. E. coli phát triển hình thành indol làm cho lớp thuốc thử có màu đỏ đậm (ngược với màu vàng nhạt trong phản ứng âm tính). Môi trƣờng thử MR-VP được chế bằng cách pha 7 g peptone, 5 g glucose và 5 g K2HPO4 vào 1 lít nước, chỉnh pH 7,5, rót vào ống hẹp 2 - 3 ml rồi hấp khử trùng dưới áp suất cao 115 °C trong vòng 20 phút. Thuốc thử MR được chế bằng cách hòa tan 0,25 g đỏ methyl (methyl red) vào 100 ml ethanol. Sau khi nuôi cấy vi khuẩn 2 ngày (thông dụng) hoặc 4 ngày (tiêu chuẩn) ở 37 °C, lấy ra nhỏ 1 giọt thuốc thử MR. E. coli có phản ứng MR dương tính làm ống có màu đỏ (pH duy trì dưới 4,5) sau và tiếp tục giữ màu đỏ đó sau một thời gian nuôi cấy nữa (trái với các vi khuẩn MR âm tính ống nghiệm có màu vàng, hoặc nếu đỏ thì cũng chuyển vàng sau khi nuôi cấy tiếp, ví dụ Serratia marcescens). Phản ứng VP được thực hiện sau khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MR-VP 2 (thông dụng) hoặc 4 (tiêu chuẩn) ngày, bằng cách nhỏ 0,6 ml dung dịch α-naphthol trong cồn tuyệt đối (5 g α-naphthol, 100 ml ethanol tuyệt đối [chế bằng cách cho sulfate đồng khan nhờ nung qua đêm ở 160 °C cho đến khi có màu trắng vào một lọ có nút kín rồi rót ethanol 95° hoặc 99° vào, chú ý tính sao cho lượng Cu(OH)2 dư để hút hết nước trong cồn và chuyển thành Cu(OH)2.5H2O có màu xanh], dung dịch có màu rơm đậm) và 0,2 ml dung dịch KOH (KOH 40 g, nước cất 100 ml). Đặt nghiêng ống rồi đọc kết quả sau 15 và 60 phút. E. coli có phản ứng VP âm tính: không có phản ứng màu, đôi khi có màu đồng hay hồng nhạt (trái với VP dương tính, màu ống chuyển sang đỏ đậm, ví dụ Enterobacter cloacae). Môi trƣờng citrate có hai loại nhưng thường dùng môi trường ammonium citrate của Simmon (Simmon's citrate). Môi trường này được chế bằng cách hòa 5 g NaCl, 1 g NH4H2PO4, 1 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4.7H2O, 2 g sodium citrate và 9 g agar vào 1 lít nước, thêm 40 ml dung dịch 0,2% bromothymol blue (xanh bromothymol, chế bằng cách hòa 2 g bromothymol blue vào 50 ml NaOH 0,1 N và 950 ml nước cất), chỉnh pH 6,8, rót ra ống rồi khử trùng ở 115 °C trong 20 phút, đặt nghiêng chờ nguội để có môi trường đặc với phần đáy ngắn và phần nghiêng dài. Cấy lượng nhỏ vi khuẩn và ủ đến 4 ngày. E. coli không mọc và không làm thay đổi màu xanh lục của môi trường (ngược với Citrobacter freundii, chẳng hạn, mọc và chuyển môi trường sang màu xanh dương). * Bệnh cảm nhiễm Escherichia coli: Vi khuẩn E. coli gây viêm ruột, tiêu chảy ở người và các loại động vật khác nhau được gọi là E. coli sinh tiêu chảy (diarrhogenic E. coli), ở người được chia thành 4 nhóm lớn: PGS. TS. Phạm Hồng Sơn Giáo trình Vi sinh vật học thú y Huế 2008
  3. 13 Bảng I-3. Các dạng huyết thanh, tính sinh độc tố và tính kháng nguyên của E. coli Độc tố Ký chủ Dạng huyết thanh học Bệnh trạng LT ST VT O8:K85:H-:F5 - + - O9:F5 - + - O20:K+:H-:F5 - + - O101:K28:H-:F5 - + - Bệnh do E. coli bê nghé sơ simh (tiêu chảy, viêm O115:F5 - + - Bò dạ dày - ruột, bệnh trúng độc huyết đường ruột O26 - - + (enterotoxemia), viêm vú O111 - - + O119 - - + O141:H4 - - + O157:H7 - - + O8:K87:H-:F4 + + - O149:H10:F4 + + - O149:F5 + + - O157:F4 + + - O78:F4 + - - Bệnh E. coli lợn con sơ sinh (tiêu chảy phân trắng) O101:F4 + - - Bệnh E. coli lợn sau cai sữa (viêm dạ dày - ruột, O149:H10:F4 + - - tiêu chảy) O9K103:H-:F5 - + - O9:K103:H-:F6 - + - O20:K101:H-:F6 - + - Lợn O101:F41 - + - O157:F4 - + - O138:H14 - - + O139:K82:H1 - - + Bệnh phù đầu, viêm huyết quản não tủy O141:H4:F4 - + + O2 - - - O8 - - - Nhiễm khuẩn máu, bại huyết (vi khuẩn phát triển O78 - - - trong máu) O114 - - - O137 - - - O1 - - - O2 - - - Bại huyết cấp tính, viêm tương mạc á cấp tính, u Gia O9 - - - thịt mãn tính (đôi khi, viêm ruột xuất huyết) cầm O26 - - - O78 - - - Chuột O115a,c:K(B) - - - Bệnh phì đại ruột (megaenteron) Ghi chú: Tính sinh độc tố LT: heat-labile enterotoxin (độc tố đường ruột không chịu nhiệt), ST: heat-stable enterotoxin (độc tố đường ruột chịu nhiệt), VT: verocytotoxin (độc tố [gây độc] tế bào vero). E. coli bệnh nguyên đường ruột (enteropathogenic E. coli - EPEC) thuộc vào một nhóm huyết thanh học riêng biệt, có tính kết bám (bám dính). E. coli xâm lấn đường ruột (enteroinvasive E. coli - EIEC) có khả năng xâm nhập đường ruột, do plasmid chi phối. E. coli độc tố nguyên đường ruột (enterotoxigenic E. coli - ETEC) có năng lực hình thành các kháng nguyên lông F2 (tên cũ CFA/I), F3 (CFA/II), F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) và các độc tố ruột (enterotoxin) do plasmid chi phối. E. coli sinh độc tố tế bào vero (verocytotoxin-producing E. coli - VTEC) hay E. PGS. TS. Phạm Hồng Sơn Giáo trình Vi sinh vật học thú y Huế 2008
  4. 14 coli xuất huyết ruột (enterohemorrhagic E. coli - EHEC) có năng lực sản sinh độc tố vero gây độc tế bào do bacteriophage chi phối. Tất cả các vi khuẩn trên đều gây bệnh cục bộ. Ngoài ra, đôi khi E. coli xâm nhập kết bám và phát bệnh ở các cơ quan khác nhau ngoài đường ruột. a. Tiêu chảy phân trắng do E. coli ở bê nghé (enteric colibacillosis in calves) Bệnh này do ETEC gây ra ở bê nghé một tuần sau sinh, nhờ có kháng nguyên lông (chủ yếu là kháng nguyên F5 - tức K99) mà vi khuẩn kết bám và sản sinh enterotoxin. b. Viêm vú do E. coli (coliform mastitis) Trong thời kỳ bò cho sữa E. coli trong môi trường có thể xâm nhập vào bên trong bầu vú, phát triển và phát bệnh. Tuy tần suất xuất hiện nhỏ nhưng cũng có nhiều trường hợp viêm vú hoại tử cấp tính và á cấp tính. Là chứng bệnh do nội độc tố vi khuẩn Gram âm (>107 pg/ml sữa), viêm vú hoại tử có thể gây ra bởi các vi khuẩn khác, bên cạnh E. coli, như Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae. c. Bệnh E. coli ở lợn (colibacillosis in pigs) Trong nhóm này gồm bệnh tiêu chảy phân trắng (bạch lỵ) ở lợn con, tiêu chảy (viêm dạ dày - ruột) hay phù mặt ở lợn sau cai sữa, bại huyết (vi sinh vật sinh sản phát triển trong máu), viêm huyết quản não tủy. Bệnh nguyên gây tiêu chảy là những ETEC khác nhau mang yếu tố kết bám là các kháng nguyên lông (kháng nguyên F4 - tức K88, F5 - K99, F6 - 987P, F41) cùng với các E. coli sản sinh các enterotoxin ST-I và ST-II chịu nhiệt, LT-I và LT-II không chịu nhiệt. d. Bệnh E. coli ở gà (colibacillosis in chicken) Bên cạnh nhiều bệnh trực khuẩn đại tràng ở gà không phải là bệnh ở đường ruột như bại huyết cấp tính, viêm tương mạc á cấp tính, u thịt mãn tính, đôi khi có bệnh viêm ruột xuất huyết. Bệnh đường ruột do E. coli ở gà thường đặc trưng bởi phân nhão, màu xanh thẫm, rất hôi thối ("cứt gà sáp"). e. Bệnh to ruột ở chuột (megaenteron of mice) Bệnh này do các E. coli thuộc dạng huyết thanh học O115a, c:K(B) gây ra ở chuột con cai sữa 2 - 3 tuần tuổi, đặc trưng bởi sự hình thành quá mức của tế bào thượng bì niêm mạc ruột, tiêu chảy dạng nước với tỷ lệ tử vong cao. 2. Escherichia coli và trúng độc thực phẩm Trúng độc (thực ra là chứng tiêu chảy) do E. coli khá phổ biến và thường xuất hiện ở tập đoàn người cùng sử dụng một loại thực phẩm nhiễm khuẩn. Trong đa số trường hợp, sau khi ăn thức ăn nhiễm E. coli gây tiêu chảy 10 - 15 giờ thì phát bệnh, đặc trưng bởi nôn mửa, đau bụng, tiêu chảy, phát sốt, hồi phục sau 2 - 3 ngày. Có khi tùy thuộc vào sự gia tăng số lượng vi khuẩn phát triển ở đường ruột và lượng độc tố khuyếch tán trong đường ruột mà trúng độc có thời kỳ tiềm ẩn khoảng 6 - 72 giờ, dạng này có thể phân biệt là trúng độc dạng cảm nhiễm. Còn các trường hợp khác sau khi ăn thức ăn nhiễm khuẩn trong cơ thể bắt đầu hình thành độc tố dẫn đến hiện PGS. TS. Phạm Hồng Sơn Giáo trình Vi sinh vật học thú y Huế 2008
  5. 15 tượng trúng độc thì gọi là trúng độc độc tố nội sinh. Các E. coli sinh bệnh đường ruột (EPEC) do có khả năng kết bám vào tế bào HeLa, cho nên có thể kiểm định E. coli kết bám đường ruột (enteroadherent E. coli - EAEC) hay E. coli liên quan đến tính gây bệnh đường ruột. Các E. coli có tính xâm nhập tổ chức đường ruột gây nên các triệu chứng giống bệnh lỵ (tức kiết lỵ, hay hồng lỵ) trực trùng thường không sản sinh lysine decarboxylase. Các E. coli sinh độc tố (ETEC) có các kháng nguyên lông (kháng nguyên F2 - CFA/I hoặc F3 - CFA/II) và sản sinh enterotoxin nhưng có ba loại là ETEC sản sinh chỉ LT, chỉ ST hoặc cả hai loại LT và ST. Triệu chứng luôn luôn là tiêu chảy như bệnh dịch tả (cholera) do Vibrio cholerae gây ra. Các triệu chứng trúng độc do VTEC thường là tiêu chảy ra máu dạng kiết lỵ và đau bụng dữ dội. 3. Salmonella và bệnh truyền nhiễm * Đặc điểm: Salmonella là một chi vi khuẩn lớn thuộc họ trực khuẩn đường ruột. Việc phân loại chi này không thống nhất giữa các nhà vi sinh vật học các khu vực khác nhau. Ở nhiều nước, các đại diện Salmonella có đặc tính khác nhau thường được coi là các loài khác nhau, và tên vi khuẩn này được viết theo quy tắc "nhị danh" (binomial name) in nghiêng gồm tên chi (có chữ cái đầu viết hoa) và tên xác định loài (viết thường). Chẳng hạn, Salmonella abortusequi. Nhưng với Hội sinh vật học một số nước khác thì chi này lại được coi chỉ gồm hai loài là S. choleraesuis và S. bongori (bảng I-3), trong đó loài đầu gồm 6 loài phụ (subspecies) khác nhau tương ứng với các dạng huyết thanh học khác nhau. Việc đặt tên, do vậy, cũng không thống nhất với danh pháp nói trên. Tên loài phụ in nghiêng gồm tên loài cộng thêm phần phụ sau chữ subsp. (viết tắt của chữ "subspecies") không in nghiêng, chẳng hạn, S. choleraesuis subsp. choleraesuis, còn tên gọi theo dạng huyết thanh học lại viết hoa chữ cái đầu và không in nghiêng đặt sau chữ Salmonella trực tiếp hoặc thêm chữ serovar không in nghiêng, ví dụ Salmonella serovar Typhi hoặc Salmonella Typhi. Ngoài S. choleraesuis subsp. choleraesuis ra, còn có các loài phụ khác như S. choleraesuis subsp. arizonae, S. choleraesuis subsp. diarizonae, S. choleraesuis subsp. salamae, S. choleraesuis subsp. houtenae và S. choleraesuis subsp. indica. S. choleraesuis subsp. choleraesuis (S. enterica), Chúng phát triển tốt trên môi trường thạch thường, ở 35 - 37 °C, sau 20 - 24 giờ hình thành khuẩn lạc tròn từ trong suốt không màu đến hơi đục, hơi lồi hoặc có dạng giọt sương, bóng láng. Để nuôi cấy phân lập thường dùng môi trường tuyển lựa như thạch MacConkey, SS, EMB, hoặc là sau khi nuôi cấy bồi dưỡng trong môi trường 50% dịch mật (bò, lợn, ) rồi dùng môi trường tuyển lựa để nuôi cấy khởi đầu để phân lập. Salmonella có phản ứng indol âm tính, MR âm tính, VP âm tính, sử dụng citrate dương tính, hoàn nguyên nitrate dương tính, di động, lysine decarboxylase dương tính, adonit âm tính, lên men mannit, thường không lên men lactose, saccharose trừ một số ngoại lệ dạng huyết thanh học, dạng sinh học nhất định. Hàm lượng C+G (mol%) là 50 - 53. Môi trƣờng SS được chế bằng cách hòa 5 g cao thịt, 5 g peptone, 10 g lactose, 8,5 g desoxycholate natri, 8,5 g citrate natri, 1 g citrate sắt, 2,5 ml neutral red 1%, 0,33 ml lục sáng (brilliant green) 0,1%, và 13, 5 g agar vào 1 lít nước rồi đun sôi cho tan, không cần khử trùng bằng cao áp, đổ đĩa Petri. Salmonella và Shigella phát triển tạo khuẩn lạc không màu, còn các vi khuẩn lên men lactose PGS. TS. Phạm Hồng Sơn Giáo trình Vi sinh vật học thú y Huế 2008
  6. 16 thường bị ức chế, nếu có phát triển thì có màu mận chín hoặc màu đỏ. Vi khuẩn sản sinh H2S có thể hình thành khuẩn lạc màu đen. Các vi khuẩn Gram dương thì phát triển được trên môi trường này. Môi trƣờng thạch EMB (eosine-methylene blue agar) được chế bằng cách hòa 10 g peptone, 10 g lactose, 2 g K2HPO4, 0,2 g eosine Y, 0,5 g xanh methylene (methylene blue) và 15 g agar vào 1 lít nước, chỉnh pH 6,8, hấp cách thủy khử trùng 15 phút ở 121 °C, rót đĩa Petri để nguội cho thạch hóa rắn. Môi trường có màu đỏ hồng. Trên môi trường này E. coli có khuẩn lạc hơi nhỏ, màu lông chuột hoặc đen tím có ánh kim. Các vi khuẩn lên men lactose như Klebsiella có khuẩn lạc lớn, màu xanh lam không có ánh kim. Vi khuẩn không lên men lactose, như Salmonella, không làm thay đổi màu của môi trường, khuẩn lạc có màu đỏ hồng của môi trường. Môi trƣờng Endo được chế bằng cách đun chảy 100 ml thạch Martin (lấy dạ dày lợn hoặc dạ cỏ bò tươi mới, rửa sạch, cắt bỏ mỡ, gân, xay nhỏ, thêm 4 lần thể tích nước, rồi thêm 1% thể tích HCl, ngâm qua đêm ở nhiệt độ 50 °C, trung hòa bằng dung dịch NaOH 20% đến khi có phản ứng kiềm, hấp cao áp khử trùng ở 120 °C trong 15 phút, hòa với lượng tương đương nước thịt cơ bản, đun sôi 10 phút, kiềm hóa bằng NaOH 20% đến pH 7,9, đun sôi 30 phút, lọc, thêm 2% agar rồi hấp cao áp ở 110 trong 30 phút) để nguội 70 °C thì hòa vào đó 1 g lactose, rồi 0,5 ml fuchsine kiềm bão hòa trong cồn ethanol 95°, và 2,5 ml dung dịch thiosulfate natri (sodium thiosulfate) 10%, lắc đều. Đổ ra đĩa Petri, để nguội cho thạch hóa rắn. Lúc đầu môi trường có màu hồng nhưng khi nguội sẽ nhạt màu. Salmonella phát triển hình thành khuẩn lạc màu vàng, E. coli có khuẩn lạc màu đỏ. Các phản ứng arginine, lysine, ornithine decarboxylase chuyển môi trường về phía kiềm tính làm trung hòa acid sinh ra trong quá trình lên men nên nhất thiết phải có ống đối chứng bên cạnh các ống có một trong ba loại amino acid nêu trên. Môi trƣờng amino acid-decarboxylase (Møller) được chế bằng cách hòa 5 g peptone, 5 g beef extract, 0,005 g pyridoxal, 0,5 g glucose, 2,5 ml dung dịch đỏ cresol (cresol red) 0,2% và 5 ml tía bromocresol (bromocresol purple) 0,2% vào 1 lít nước cất, pH 6,0, thêm amino acid (loại này hay loại khác) cho đủ 1% rồi hấp cao áp 10 phút ở 115 °C. (Dung dịch bromocresol purple và cresol red pha bằng cách nghiền 2 g chất màu trong 50 ml NaOH 0,1 N rồi thêm 950 ml nước cất, đóng chai, nút kín để dùng dần). Trước khi làm thí nghiệm thì rót lượng nhỏ (1 - 2 ml) môi trường vào các ống nghiệm nhỏ vô trùng, thêm một lớp dày (5 mm) parafin lỏng vô trùng, cấy vi khuẩn bằng cách đâm que cấy xuyên qua lớp parafin lỏng. Ngoài môi trường này còn có thể dùng môi trƣờng Falkow (5 g peptone, 3 g cao men, 1 g glucose, 0,02 g bromocresol purple, 1 lít nước) thay thế. Phản ứng kiềm tính làm cho môi trường chuyển sang màu tím còn phản ứng acid làm môi trường chuyển sang màu vàng. Để kiểm tra các phản ứng lên men đƣờng của vi khuẩn, người ta thường dùng các dãy ống nƣớc peptone pH 7,1 - 7,3 có hàm lượng peptone thấp để lượng NH4 sinh ra do phân giải amino acid không đủ để trung hòa lượng acid sản sinh ra (2 g bacto peptone, 5 g NaCl, 0,3 g K2HPO4 hòa vào 1 lít nước), thêm đường (loại này hay loại khác) đủ 0,5%. Nƣớc peptone đƣờng (môi trường Barsiekow) có thể chế bằng cách hòa 0,5 g đường và 1,2 ml bromothymol blue 0,2% vào 100 ml nước peptone, phân ra ống rồi hấp ba lần mỗi lần 1 giờ ở nhiệt độ 100 °C để diệt khuẩn, hoặc tốt hơn là hấp cao áp khử trùng riêng nước peptone đã pha bromothymol blue PGS. TS. Phạm Hồng Sơn Giáo trình Vi sinh vật học thú y Huế 2008
  7. 17 (1,2 ml/l) hoặc thuốc thử Andrade 10 ml/l (Andrade's indicator: hòa 5 g acid fuchsine vào 1 lít nước cất và 150 ml NaOH 1 N, để ở nhiệt độ phòng, có lắc thường xuyên, rồi thêm NaOH 1 N để thuốc thử mất màu từ đỏ sang vàng rơm) trong ống nghiệm có đặt sẵn ống Durham lộn ngược, còn đường tinh khiết các loại được pha thành dung dịch 10% (hoặc 5% đối với đường tan kém, dễ kết tủa khi bảo quản ở tủ lạnh), lọc qua màng lọc vi khuẩn, cất ở 4 °C, trước khi làm thí nghiệm thì pha vào nước peptone trong ống nghiệm vô trùng để có hàm lượng đường 0,5%. Vi khuẩn lên men đường làm môi trường chuyển từ màu lục sang màu vàng rồi màu xanh (đối với bromothymol blue) hoặc chuyển từ màu đỏ sang màu vàng (đối với chỉ thị màu Andrade). Môi trƣờng TSI: hòa 3 g cao thịt, 3 g cao men, 15 g peptone, 5 g peptone proteose, 5 g NaCl, 10 g lactose, 10 g saccharose, 1 g glucose, 1 g FeSO4.7H2O (sulfate sắt II), 0,2 g Na2S2O3.5H2O (thiosulfate natri), 12 g agar và 0,024 g phenol red vào 1 lít nước cất, đun cho tan đều, chỉnh pH 7,4, rót ống khoảng 5 - 6 ml khi nóng, khử trùng ở 100 °C trong 15 phút, đặt ống nằm nghiêng để có phần nghiêng và phần đáy khi môi trường trở nên rắn. Môi trường có màu đỏ. Cấy bằng cách chọc sâu vào tâm phần đáy và phết bề mặt phần nghiêng. Sau khi ủ ấm, kết quả sinh hóa tương tự như ở môi trường KIA. Môi trƣờng Drigalsky được chế bằng cách thêm vào 1 lít môi trường thạch thường 10 g lactose và 40 ml bromothymol blue 0,2%, chỉnh pH đến 7,2 - 7,4. Tiệt trùng cao áp 15 phút ở 121 °C, đổ đĩa Petri. Vi khuẩn phân giải lactose tạo khuẩn lạc màu vàng, Salmonella không phân giải lactose nên tạo khuẩn lạc không màu (màu môi trường). Hiện tại, chi Salmonella có 67 loại (có tài liệu công bố tới 80 loại) kháng nguyên O, 94 loại kháng nguyên H lớp 1, hơn 11 kháng nguyên H lớp 2, kháng nguyên K là kháng nguyên Vi (thường chỉ phát hiện được khi vi khuẩn mới được phân lập từ bệnh phẩm động vật), nhưng một bộ phận kháng nguyên do thực khuẩn thể chi phối (bảng I-6). Trong loài phụ S. choleraesuis subsp. choleraesuis có nhiều dạng huyết thanh học (serovar) khác nhau, phân biệt dựa vào phối hợp kháng nguyên O và kháng nguyên H. Trong cảm nhiễm Salmonella, có các loại ký chủ động vật khác nhau phụ thuộc vào dạng huyết thanh học của vi khuẩn gây bệnh. Dựa vào đó người ta chia vi khuẩn này thành 4 nhóm sinh học khác nhau. Nhóm 1 gồm các chủng Salmonella gây ở một số động vật nhất định bệnh thương hàn (typhus) hay bại huyết (vi khuẩn xâm nhập và phát triển ở trong máu), trong nhiều trường hợp vi khuẩn có tính kết bám tế bào (nhờ nhung mao - pili, fimbria), tính xâm lấn (nhờ gene invA-E) và tính sinh sản nội bào, hoặc ở một số khác gây bệnh phó thương hàn nhờ tính đề kháng huyết thanh, tính sinh sản nội tế bào hệ lưới nội bì, tính sinh độc tố gây chết. Nhóm này gồm có Salmonella Typhi, S. Paratyphi A (gây bệnh thương hàn hoặc phó thương hàn ở người), S. Gallinarum-Pullorum (tiêu chảy - bạch lỵ ở gà con, thương hàn ở gà trưởng thành), S. Abortusequi (phó thương hàn, bại huyết hoặc sẩy thai (lưu sản) truyền nhiễm ở ngựa), S. Abortusovis (phó thương hàn ở cừu non, bại huyết hoặc sẩy thai truyền nhiễm ở cừu), Nhóm 2 gồm các chủng Salmonella bên cạnh gây bệnh thương hàn ở một số động vật nhất định còn gây bệnh viêm dạ dày - ruột cấp tính hoặc bại huyết ở động vật. Salmonella Paratyphi B (thương hàn ở người), S. Typhimurium (thương hàn ở chuột), PGS. TS. Phạm Hồng Sơn Giáo trình Vi sinh vật học thú y Huế 2008