Bài giảng Công nghệ Enzym - Protein

Nội dung text: Bài giảng Công nghệ Enzym - Protein

1. Phương pháp sản xuất - Tổng quát • Loại bỏ mô tạp Chuẩn bị nguyên liệu • Phá vỡ tế bào • Ly tâm, lắng Chiết tách • Tủa bông • Lọc • Bay hơi Cô đặc • Tủa • Siêu lọc • Kết tinh trực tiếp Tinh chế • Sắc ký • Hấp phụ • Cô đặc Hoàn chỉnh sản phẩm • Kết tinh • Đông khô • Ổn định
2. Chuẩn bị nguyên liệu sinh học  Cơ quan động vật  Loại chất béo và mô liên kết trước khi đông lạnh  Bảo quản lạnh đến khi đủ mẫu để xử lý  Nghiền trên máy nghiền thịt và enzym được chiết với dung dịch đệm.  Enzym để phá vỡ tế bào  Nguyên liệu thực vật  Thực vật có thể được nghiền và chiết với dung dịch đệm.  Tế bào cũng có thể được phá vỡ bằng cách xử lý với enzym.  Vi sinh vật  Ngoại bào: tách tế bào ra khỏi dung dịch lên men.  Nội bào: phá vỡ tế bào
3. Các phương pháp phá vỡ tế bào  Áp suất cao (Manton - Gaulin, French- press)  Nghiền (máy nghiền bi)  Siêu âm  Làm khô (đông khô, dung môi hữu cơ)  Ly giải:  Vật lý: đông lạnh, sốc thẩm thấu  Hóa học: chất tẩy, kháng sinh  Enzym: lysozyme, kháng sinh
4. French-press
5. Sản xuất enzym - Chiết tách  Tách dịch enzym ra khỏi các phần khác.  Lắng  Ly tâm liên tục  Lọc  truyền thống  lọc áp suất, lọc chân không  lọc chảy qua (cross-flow filtration).  Phương pháp kết bông
6. Cô đặc  Bay hơi  Kết tủa  Muối  Dung môi hữu cơ  Polymer  Siêu lọc
7. Tinh chế  Kết tinh  Điện di  Sắc ký Loại sắc ký Nguyên lý Tách theo Hấp phụ Liên kết bề mặt Ái lực bề mặt Phân bố Cân bằng phân bố Tính phân cực Trao đổi ion Liên kết ion Điện tích Lọc gel Khuếch tán lỗ Kích thước và hình dạng phân tử Ái lực Hấp phụ đặc hiệu Cấu trúc phân tử Kỵ nước Tương tác kỵ nước Cấu trúc phân tử Đồng hóa trị Liên kết đồng hóa trị Tính phân cực Đánh bắt ion kim Sự thành lập phức Cấu trúc phân tử loại
8. Nguyên lý Sắc ký
9. Nguyên lý Sắc ký
10. Chọn Phương pháp sắc ký GF = Lọc gel AC = Sắc ký Ái lực IEX = Sắc ký Trao đổi Ion HIC = Sắc ký Tương tác kỵ nước RPC = Sắc ký Pha đảo
11. Ví dụ tinh chế amylase bằng hấp phụ Dịch Enzym thô • Natri alginat Phức Enzym Alginat natri • Calcium chlorid • Lọc lấy tủa Dịch tạp chất Tủa Enzym Alginat Calci • Phản hấp phụ • Lọc lấy dịch Alginat Calci Dịch Enzym tinh • Cô đặc • Thẩm tích Sản phẩm amylase
12. Ví dụ sản xuất Taq polymerase Thermus aquaticus hay E.coli tái tổ hợp Môi trường Cột DEAE Lên men Môi trường thừa Cột Hydroxyapatide Thu tế bào Xác tế bào Cột DEAE Phá tế bào Dịch nổi Cột phosphocellulose Tủa (NH4)2SO4 Taq polymerase tinh khiết Thẩm phân
13. Enzym cố định  Ưu điểm  Enzym có thể được sử dụng lặp lại nhiều lần  Chế phẩm bền hơn enzym tự do  Enzym cố định có tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản xuất ở mức độ tự động hóa cao.  Nhờ sự cố định mà enzym không lẫn vào sản phẩm cuối  Enzym cố định bảo quản tốt hơn enzym tự do cùng loại  Nhược điểm  Giảm hoạt tính của enzym so với ban đầu.  Cản trở về không gian do liên kết với chất mang làm hạn chế sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất.
14. Vật liệu cố định  Chất mang phải rẻ tiền, dễ tìm hoặc dễ tổng hợp  Chất mang phải có tính cơ lý ổn định  Chất mang phải bền vững về mặt hóa học, không hòa tan trong môi trường phản ứng.  Chất mang phải có diện tích bề mặt lớn  Có khả năng trương nở trong môi trường
15. Các phương pháp cố định enzym Phương pháp liên kết với chất mang Phương pháp khác Đặc tính Hấp phụ Liên kết Liên kết Liên kết Bắt giữ vật lý ion đồng hóa trị chéo Kỹ thuật Dễ Dễ Khó Khó Khó Hoạt tính enzym Thấp Cao Cao Trung bình Cao Tính đặc hiệu cơ Không đổi Không đổi Thay đổi Thay đổi Không đổi chất Lực liên kết Yếu Trung bình Mạnh Mạnh Mạnh Khả năng tái cố Có thể Có thể Không Không Không định Khả năng ứng dụng Thấp Trung bình Trung bình Thấp Cao Chi phí cố định Thấp Thấp Cao Trung bình Thấp
16. Cố định thuận nghịch E Me- E E Liên kết ion kim Hấp phụ Me- E loại hoặc chelate E Me- E + - E S S E + - E Liên kết ion Liên kết disulfit S S E + - E S S E E E Liên kết ái lực E
17. Cố định không thuận nghịch E E E Liên kết đồng hóa trị E E Tạo vi hạt bao E E E E E E E E E E Bắt giữ Liên kết chéo E E E E E E
18. Ứng dụng enzym trong ngành dược  Liệu pháp enzym  Enzym trong sản xuất thuốc
19. Trị liệu bằng enzym  Thay thế enzym do bệnh di truyền  Thay thế enzym do một bệnh mắc phải  Cung cấp tác dụng sinh học đặc hiệu  Dùng trong điều trị hỗ trợ khi phối hợp với các liệu pháp khác, hay để giải độc máu hay mô.
20. Liệu pháp enzym - Yêu cầu của enzym  Phải đến được vị trí tác động của chúng trong cơ thể hay mô.  Phải có hoạt tính trong các điều kiện môi trường tại nơi tác động.  Chúng phải đủ bền để có được các thông số dược động học cần thiết,  Độ tan thỏa mãn yêu cầu nếu được dùng theo đường tiêm bắp hay dưới da.  Độ tinh khiết đủ cao  Có hiệu quả điều trị dựa trên hoạt tính đặc hiệu của enzym được dùng. Hiệu quả của liệu pháp phải được chứng minh  An toàn đối với bệnh và chỉ định điều trị  Dạng sử dụng thuận tiện
21. Các vấn đề của thuốc protein  Không ổn định  Sinh khả dụng  Tính thấm tế bào  Tính chất gây miễn dịch  Phản ứng dị ứng  Sản xuất và kiểm định  Lợi thế  Ít tác dụng phụ hơn  Thời gian phát triển ngắn  Tỷ lệ thành công khi xin cấp phép cao
22. Thách thức  Cải thiện tính ổn định  PEG, liên kết chéo  Phóng thích có kiểm soát  Bao bảo vệ  Cải tiến phân tử  Giảm tính miễn dịch  Định hướng đặc hiệu  Khả năng xuyên màng tế bào
23. Nguồn enzym  Chiết xuất - Tinh chế:  Không phải người: nấm, vi khuẩn, động vật, thực vật  Gây miễn dịch  Dùng ngoài  Yêu cầu thấp  Người  Giới hạn công suất, nguyên liệu hạn chế  Nhiễm virus và các yếu tố gây bệnh khác  Tái tổ hợp  Sử dụng gen người tái tổ hợp trong tế bào khác  Cải thiện hoạt tính, đặc điểm thông qua cải tiến trình tự
24. Hệ thống sản xuất  Nuôi cấy tế bào người – động vật  Chất lượng tốt  Năng suất giới hạn  Nhiễm virus  Nấm men  Thực hiện được một số biến đổi hậu dịch mã  Vi khuẩn  Năng suất cao  Không thực hiện được biến đổi hậu dịch mã  Sinh vật chuyển gen  Liệu pháp gen
25. Sản xuất thuốc bằng công nghệ enzym cnshduoc@gmail.com`
26. Thuốc đối quang  Cấu trúc không gian của phân tử sinh học và thụ thể  Chỉ một trong hai đồng phân có hoạt tính,  Các đồng phân có hoạt tính khác nhau  Dược động học và chuyển hóa khác nhau  Thuốc tinh khiết quang học (enantiopure  Bản quyền đồng phân
27. Thuốc đối quang Tác dụng dược lý chính Khác biệt giữa các đồng phân Thuốc chẹn β: l > d (d = không có hoạt tính) propranolol, acebutolol, atenolol, alprenolol, Ví dụ: S(-)-propranolol > R(+)-propranolol betaxolol, carvedilol, meto-prolol, labetalol, pindolol, sotalol, Thuốc chẹn kênh calci: l > d verapamil, nicardipine, nimodipine, nisoldipine, Ví dụ: S(-)-verapamil > R(+)-verapamil felodipine, mandipine Thuốc giãn phế quản: l > d (d = không có hoạt tính) albuterol (salbutamol), salmeterol và terbutaline Ví dụ: R(-)-albuterol > S(+)- albuterol An thần: l > d hexobarbital, secobarbital, mephobarbital, Ví dụ: S(-)-secobarbital > R-(+)secobarbital pentobarbital, thiopental, thiohexital Thuốc gây mê: d > l (l = không có hoạt tính) ketamine, isoflurane Ví dụ: S(+)-ketamine > R(-)-ketamine S(+)-isoflurane > R(-)-isoflurane Giảm đau tác động trung ương: Methadone Ví dụ: R(-)-methadone > S(+)-methadone Kháng viêm không steroid: d > l ibuprofen, ketoprofen, benoxaprophen, fenprofen Ví dụ: S(+)-ibuprofen > R(-)-ibuprofen An thần: nhóm 3-hydroxy-benzodiazepines: d > l (l = không có hoạt tính) oxazepam, lorazepam, temazepam Ví dụ: S(+)-oxazepam > R(-)- oxazepam
28. Thuốc đối quang - racemic Không bất đối: 2 Tự nhiên/ Chế phẩm dạng bán tổng hợp: 147 racemic: 8 Bất đối: 145 Chế phẩm một đồng phân: 119 Thuốc: 668 Chế phẩm một đồng phân: 110 Bất đối: 252 Chế phẩm dạng Tổng hợp: 521 racemic: 140 Không bất đối: 269
29. Các loại phản ứng được xúc tác bởi enzym Lớp enzym theo IUBMB Phản ứng xúc tác EC 1 Oxidoreductases Oxi hóa/khử đối với –CH–OH, –C=O, –C=C, Không đòi hỏi đồng cơ chất EC 2 Transferases Chuyển các nhóm chức như halogen, aldehyde, keto, acyl, Không đòi hỏi đồng yếu tố glycosyl, EC 3 Hydrolases Thủy phân/ngưng tụ các ester, glycosid, nitril, amid, Không đòi hỏi đồng yếu tố halogen, EC 4 Lyases Thêm/loại bỏ; cắt các liên kết C–C, C–O, C–N Không đòi hỏi đồng yếu tố EC 5 Isomerases Đồng phân hóa, chuyển dạng cis-trans, epime hóa Không đòi hỏi đồng yếu tố EC 6 Ligases Tạo các liên kết C–O, C–S, C–N, C–C Cần đồng cơ chất ATP
30. Một số vấn đề công nghệ  Chi phí cố định phải bù đắp được bởi sự gia tăng tính ổn định hoặc hoạt tính.  Giảm thiểu sự mất hoạt tính trong quá trình cố định.  Khi enzym được cố định bằng phương pháp có tính thuận nghịch, sự rò rỉ enzym phải được nghiên cứu và có biện pháp thích hợp.  Sự giới hạn về luân chuyển vật chất trong chất mang cần được tính toán khi điều chỉnh pH hay nhiệt độ trong quá trình phản ứng.  Với enzym tự do, hoạt tính chuyển hóa có thể đạt được cao hơn ở nồng độ enzym cao, do đó việc chuyển hóa các cơ chất khó có thể thực hiện được.  Tính vô trùng của phản ứng cần được quan tâm.  Sự tương thích của dung môi với chất mang và ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính cần được xem xét.
31. Lựa chọn nồi phản ứng * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * a * * * * * b c * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * d e f A: vận hành theo lô; B: vận hành theo lô có tuần hoàn; C: thùng khuấy có siêu lọc; D: thùng khuấy vận hành liên tục; E: thùng nhồi liên tục; F: tầng sôi liên tục
32. Oxidoreductase Ph Ph HN HN N N Ph N N Ph Nucleoside Oxidase O 5' N N Cl o N N Cl HO O H2O, pH 6, 25 C, 12-24h HO O HO OH HO OH .Nucleoside oxidase lấy từ Stenotrophomonas maltophilia (FERM BP-2252) .Sản xuất các dẫn xuất 5’-carboxylic acid của các nucleoside đồng đẳng. .Enzym thô từ dịch chiết tế bào .Hoặc enzym cố định trên Eupergit-C
33. Lipase F F F OH OAc OH Lipase + 37oC, 20h O O O O O O F N N F N N F N N N N N N (S)-acetat N N (R) racemic Lipase F F H2O OH OH COOH OH O O F N N F N N N N N N (S) Thuốc hạ cholesterol
34. Lipase O O O O OH Lipase o + H2O, 25 C, 4h O O O O O O (3R,4S)-phenol racemic cis-hexanoate N O O (-)-Ormeloxifene Thuốc ngừa thai tác dụng kéo dài (1 viên/tuần) O
35. Lipase F F F F Lipase pH 7, MeCN + O CO2Et 45oC, 24h CO2H CO2Et O O O N O N O N N H H H H Paroxetine Thuốc chống trầm cảm
36. Lipase CH3 O OH CH3 O (S)-(+)-ibuprofen Novozym 435 OH + CH O 1-Dodecanol 3 OC12H25 (R,S)-ibuprofen (R)-(-)-ibuprofen ester Thuốc kháng viêm không steroid
37. Amidase O O O- O + NH NH NH3 -lactamase + o H2O, 70 C rac-lactam (+)-lactam (-)-acid amin OH N NH Đồng đẳng Carbovir HO N N NH2 Thuốc kháng HIV Carbovir
38. Deaminase NH2 O NH2 N Cytidine Deaminase NH N + H O, pH 7, 32oC, 35-70h N O 2 N O N O O O O HO HO HO S S S Lamivudine Thuốc kháng virus (HBV, HIV)
39. Lyase CN Tế bào R. rhodochrous J1 CONH2 cố định o N H2O, pH 8, 25 C, 18h N Nicotinamide Vitamin B3