Bài giảng Thực hành Vi sinh thực phẩm

Nội dung text: Bài giảng Thực hành Vi sinh thực phẩm

1. Các thao tác chính khi cấy ví sinh vật Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, dễ chọn lựa
2. Thực hành: Sử dụng môi trường đã pha chế ở phần trên, tiến hành làm các dạng môi trường thạch đĩa, thạch nghiêng và tiến hành cấy một số giống vi sinh vật do phòng thí nghiệm cung cấp. Nuôi ủ ở nhiệt độ thích hợp và đánh giá kết quả sau 48 giờ nuôi cấy.
3. Bài 2:KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG Một kính hiển vi tốt là một dụng cụ rất quan trọng trong phòng thí nghiệm vi sinh. Có nhiều loại kính hiển vi khác nhau, trong đó loại thường dùng nhất là kính hiển vi quang học nền sáng ( brightfield light microscope ). Kính hiển vi này có nhiều thấu kính và có một nguồn ánh sáng trắng. Chúng phóng đại và chiếu sáng các vật thể nhỏ bé như vi khuẩn và các vi sinh vật khác mà chúng ta không thể nhìn thấy bằng mắt thường. Kính hiển vi loại này sẽ được chúng ta sử dụng trong toàn bộ môn học này. Nếu sử dụng thành thạo kính hiển vi, sinh viên có thể thu nhận được những thông tin chính xác và hữu ích về các tiêu bản hoặc mẫu nuôi cấy vi sinh vật. Việc nghiên cứu trong phòng thí nghiệm với kính hiển vi sẽ giúp cho chúng ta có được những ấn tượng sâu sắc về các hình thái rất nhỏ bé của sự sống, những hình thái chỉ quan sát được khi chúng được phóng đại nhiều lần. 1. Các bộ phận chủ yếu của kính hiển vi quang học nền sáng và chức năng của chúng a. Hãy nhìn vào kính hiển vi trước mặt và so sánh nó với hình vẽ. Kính hiển vi được đặt trên một chân đế ( base ) vững chắc và có một bộ phận tay cầm ( arm ) để chúng ta có thể di chuyển kính hiển vi đến vị trí khác (Lưu ý: khi cầm hoặc mang kính hiển vi đi nơi khác, luôn phải sử dụng cả hai tay; một tay nắm lấy bộ phần tay cầm trong khi tay khác đỡ vào chân đế). Không bao giờ được nhấc kính lên bằng cách nắm vào các thấu kính. b. Hãy nhìn vào bàn chứa tiêu bản, chúng nằm giữa hệ các thấu kính bên trên và một bộ phận cung cấp ánh sáng bên dưới. Bàn chứa tiêu bản có một lỗ tròn ở vị trí trung tâm. Nó cho phép ánh sáng từ bên dưới đi xuyên qua và đến được các thấu kính bên trên. Tiêu bản cần quan sát sẽ được đặt trên bàn chứa tiêu bản, nơi mà có ánh sáng chiếu từ bên dưới tới. Lưu ý đến núm điều chỉnh bên cạnh bàn chứa tiêu bản, chúng dùng để di chuyển tiêu bản qua trái/phải hoặc trước/sau trên bàn chứa tiêu bản . Bàn chứa tiêu bản loại này gọi là bàn chứa tiêu bản cơ khí (mechanical stage ) c. Một đèn chiếu được đặt trong chân đế. Anh sáng sẽ đi xuyên qua tụ quang Abbe (Abbe condenser ). Tụ quang có chứa các thấu kính. Chúng có tác dụng tập trung các tia sáng vào tiêu bản. Tụ quang có cửa sập ( iris diaphragm , shutter ) dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng. Một thanh gạt ( rotating knob ) được gắn kèm theo để điều chỉnh cửa sập. Tụ quang có thể được nâng lên hay hạ xuống nhờ một núm
4. điều chỉnh ( adjustment knob ). Khi hạ kính tụ quang xuống sẽ làm giảm lượng tia sáng chiếu vào tiêu bản (điều này thường không được thực hiện khi nghiên cứu vi sinh vật). Cách tốt nhất là giữ tụ quang ở vị trí cao nhất và chỉ điều chỉnh lượng sáng bằng cách đóng/mở cửa sập. d. Phía trên bàn chứa tiêu bản, được gắn với tay cầm, là một ống tròn ( tube ) có các thấu kính phóng đại. Bên dưới ống tròn là một cổ xoay ( rotating nosepiece ) được gắn với ba hay bốn vật kính ( objective lenses ). Khi xoay cổ xoay, một trong số các vật kính sẽ được đặt đúng vào vị trí lỗ tròn trên bàn chứa tiêu bản. Bên trên ống tròn là thị kính ( ocular lens, eyepiece ) (kính hiển vi có thể có một thị kính, loại hai thị kính cho phép chúng ta có thể nhìn bằng cả hai mắt). e. Tùy loại kính hiển vi đang sử dụng mà cổ xoay và bàn chứa tiêu bản có thể được nâng lên hay hạ xuống bằng núm sơ cấp ( coarse adjustment knob ) và núm thứ cấp ( fine adjustment knob ). Trong một số loại kính hiển vi, chúng được đặt tại hai vị trí riêng hoặc sẽ được đặt cái này bên trên cái kia. Khi sử dụng phải vặn nút sơ cấp một cách nhẹ nhàng để nâng hoặc hạ bàn chứa tiêu bản. Đầu tiên, điều chỉnh cho bàn chứa tiêu bản được nâng lên tối đa gần sát với vật kính, đồng thời phải đưa mắt nhìn từ phía bên ngoài để tránh việc vật kính đâm thủng tiêu bản, từ đó làm hỏng vật kính. Nút thứ cấp sẽ làm di chuyển bàn chứa tiêu bản một cách rất chậm chạp vì vậy không thể thấy sự di chuyển này khi nhìn bên ngoài. Ta sử dụng nút thứ cấp khi mắt đang nhìn vào thị kính và điều chỉnh nhẹ nhàng để chỉnh rõ nét ảnh đang quan sát. f. Lưu ý chỉ được hạ bàn chứa mẫu vật đi xuống khi đưa mắt vào quan sát ở thị kính để tránh trường hợp vật kính đâm thủng tiêu bản; chỉ khi người kỹ thuật viên quan sát từ bên ngoài mới cho phép nâng bàn chứa tiêu bản lên g. Khi xoay nút thứ cấp quá nhanh có thể làm cho nút xoay bị kẹt cứng, khi đó không được cố xoay tiếp mà phải thông báo ngay cho giáo viên hướng dẫn. h. Tổng số lần phóng đại tùy thuộc vào vật kính và thị kính đang dùng. Nhìn vào thị kính, sinh viên sẽ thấy một ký hiệu “ 10X ”, có nghĩa là phóng đại 10 lần. Nhìn vào các vật kính sẽ thấy ký hiệu “ 4X ”, “ 10X ”, “ 40X ” và “ 100X ”, tương ứng với độ phóng đại 4, 10, 40, và 100 lần. Vật kính lowpower còn được gọi là vật kính 10x hay 16mm. Vật kính highdry (highpower ) còn được gọi là vật kính 40x hay 4mm. Vật kính dầu còn gọi là vật kính 90x, 100x hay 1.8mm. Khi độ phóng đại tăng, kích thước của đầu vật kính sẽ nhỏ dần và cho phép ít ánh sáng đi qua. Đó là lý do mà sinh viên cần phải điều chỉnh vị trí của tụ quang và cửa sập chắn sáng
5. khi dùng các vật kính khác nhau để có thể nhìn tiêu bản được rõ ràng hơn. Tụ quang tập trung ánh sáng lên một vùng nhỏ bên trên bàn chứa tiêu bản, còn cửa sập điều chỉnh lượng sáng đi vào tụ quang. Khi sử dụng dầu soi kính, dầu soi kính sẽ được đặt ở vị trí giữa tiêu bản và vật kính. Do dầu soi kính có tác dụng khúc xạ giống như thủy tinh nên sẽ giảm thiểu lượng tia sáng bị mất đi. Thị kính được đặt trên đầu của một ống kim loại sẽ phóng đại ảnh được truyền từ vật kính. Kết quả là độ phóng đại chung nhận được sẽ là tích số độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính. Ví dụ, khi sử dụng thị kính 10x và vật kính 43x thì độ phóng đại chung là 10 x 43 = 430 lần. Kính hiển vi quang học nền sáng
6. i. Độ dài tiêu cự ( focal length ) của một vật kính tỉ lệ với đường kính của vật kính đó. Lưu ý, trước khi chỉnh một vật kính sang vị trí thẳng đứng với lỗ tròn trên bàn chứa tiêu bản, phải đảm bảo vật kính sẽ không đâm thủng tiêu bản. Nêu chưa chắc chắc, tốt nhất nên hạ bàn chứa tiêu bản xuống tận dưới cùng trước khi chuyển sang sử dụng một vật kính khác. j. Sử dụng một mảnh vải mềm và sạch để lau nhẹ nhàng các thấu kính và phía trên tụ quang khi chúng bị bám bụi. k. Chỉ duy nhất nhân viên phòng thí nghiệm mới được lấy vật kính hay thị kính ra khỏi kính hiển vi (vì một lý do nào đó). l. Chỉ những người đã học cách sử dụng mới được dùng kính hiển vi. Ánh sáng truyền qua tiêu bản, dầu soi và vật kính Cách cầm để di chuyển kính hiển vi 2. Thực hành trên kính hiển vi với tiêu bản a. Sử dụng một số tiêu bản có sẵn hoặc tự làm. b. Đặt tiêu bản lên bàn chứa tiêu bản và kẹp lại chắc chắn. Đặt tiêu bản ở vị trí sao cho tia sáng đi từ tụ quang xuyên qua trung tâm phần được nhuộm màu. c. Đưa vật kính lowpower vào vị trí thẳng đứng và đưa bàn chứa tiêu bàn thật gần vật kính. Lưu ý: quan sát từ phía bên ngoài. d. Đưa mắt vào thị kính để quan sát. Nếu sử dụng loại kính đơn tròng ( monocular scope ), sinh viên phải mở cả hai mắt (sinh viên sẽ làm quen dần với việc chỉ tập
7. trung vào ảnh đang quan sát trong kính hiển vi thay vì các ảnh khác bên ngoài). Nếu sử dụng loại kính hai tròng ( binocular scope ), sinh viên hiệu chỉnh hai tròng kính qua lại để khi nhìn vào thị kính chỉ thấy một thị trường duy nhất. Phải đảm bảo tụ quang đang ở vị trí cao nhất và chỉnh cửa sập sao cho ánh sáng xuyên qua là vừa đủ để quan sát. Hạ bàn chứa mẫu vật xuống từ từ bằng nút sơ cấp cho đến khi thấy những vật thể có màu xuất hiện trong thị trường. e. Sử dụng nút thứ cấp để chỉnh cho ảnh rõ nét nhất. Di chuyển tiêu bản theo hướng tới/lui và trái/phải. Vật kính lowpower cho một cái nhìn toàn cảnh về tiêu bản và giúp sinh viên lựa chọn một thị trường vừa ý. Để quan sát rõ hơn cần phải chuyển sang một độ phóng đại cao hơn. f. Khi đã lựa chọn được thị trường vừa ý, xoay vật kính highdry vào vị trí thẳng đứng. Nếu độ sắc nét của ảnh chưa đạt, sinh viên chỉnh lại bằng nút thứ cấp. Nếu không thấy ảnh trong thị trường, sinh viên hãy nhìn từ bên ngoài đồng thời quan sát và chỉnh cho vật kính gần sát vào tiêu bản (không được chạm vào tiêu bản). Sau đó nhìn vào thị kính, chỉnh cho bàn chứa tiêu bản hạ xuống từ từ, đầu tiên bằng nút sơ cấp, sau đó bằng nút thứ cấp cho đến khi ảnh rõ nét nhất. Lưu ý: sinh viên cần so sánh về cấu trúc của ảnh quan sát được ở các độ phóng đại khác nhau. g. Di chuyển vật kính highdry sang một tư thế hơi nghiêng một chút rồi nhỏ một giọt dầu soi kính lên trên tiêu bản. Sinh viên quan sát từ bên ngoài và chuyển vật kính dầu sang vị trí thẳng đứng (tránh để chạm vào tiêu bản). Sử dụng nút thứ cấp để chỉnh ảnh cho rõ nét. h. Ghi nhận lại ảnh quan sát được bằng cách vẽ vào trong một hình tròn một số tế bào vi sinh vật mà sinh viên nhìn thấy. i. Sau khi hoàn tất việc quan sát, lấy tiêu bản ra khỏi kính hiển vi (không được để dầu soi kính dính vào vật kính highdry ) 3. Một số vấn đề gặp phải khi sử dụng kính hiển vi Vấn đề gặp phải Cách xử lý Nâng tụ quang lên Không đủ ánh sáng Mở cửa sập khi nhìn vào thị kính Kiểm tra lại tiêu bản: đặt sai vị trí Lau nhẹ nhàng vật kính và thị kính Bụi hay sợi vải được nhìn Gây ra bởi các bọt khí trong dầu soi thấy trong thị trường kính; kiểm tra lại tiêu bản
8. Phải chắn rằng đang sử dụng vật kính dầu Những hạt nhỏ di chứ không phải là vật kính highdry chuyển trong một thị Đảm bảo rằng dầu soi kính đang trường mờ ngập trong vật kính
9. Bài 3: TIÊU BẢN GIỌT TREO, GIỌT ÉP – QUAN SÁT SỰ DI ĐỘNG CỦA VI KHUẨN Một số vi khuẩn không di động ( nonmotile ) nhưng trong môi trường lỏng chúng thường di chuyển hỗn loạn, gọi là chuyển động Brown ( Brownian movement ). Đây là kết quả chuyển động của các phân tử nước từ đó kéo các vi khuẩn chuyển động theo. Sự di chuyển thật sự (động lực tự thân, selfpropulsion ) được thấy ở một số vi khuẩn nhờ một số cơ chế khác nhau. Vi khuẩn di chuyển nhờ tiên mao ( flagella motion ). Các xoắn khuẩn có các lông mao xung quanh ( axial fibrils ) sẽ di chuyển theo kiểu xoắn ốc (corkscrewtype motion ) và kiểu uốn khúc ( bendingtype motion ). Một số vi khuẩn khác thì trượt nhẹ nhàng ( gliding motion ). Các kiểu di động hay không di động có thể được quan sát bằng tiêu bản giọt treo (hanging drop slide ). Tiêu bản giọt treo cũng dùng để quan sát hình dạng vi khuẩn ở trạng thái sống cũng như sự sắp xếp của các tế bào vi khuẩn khi chúng kết hợp với nhau (xem hình). Một vòng Vaseline xung quanh gờ của chỗ lõm ( coverslip ) sẽ giúp tiêu bản không bị khô. Tiêu bản giọt treo 1. Sử dụng các vi sinh vật sau trong thí nghiệm a. Saccharomyces cerevisiae b. Lactobacillus acidophilus c. Bacillus subtilis d. Staphylococcus sp e. Một số chủng khác 2. Dùng que tăm, vẽ một vòng tròn nhỏ bằng Vaseline xung quanh chổ lõm của phiến kính. Không nên dùng nhiều Vaseline. 3. Sau khi lắc thật kỹ dung dịch huyền phù vi sinh vật, dùng que cấy vòng đã vô trùng đặt một giọt dung dịch huyền phù này lên giữa phiến kính hình vuông (coverslip ). 4. Đưa phiến kính hình chữ nhật ( depression slide ) úp lên phiến kính hình vuông (coverslip ), sao cho chỗ lõm của phiến kính hướng xuống dưới và giọt huyền phù vi sinh vật nằm lọt vào chỗ lõm. Nhấn xuống nhẹ nhàng để hai phiến kính gắn vào nhau. 5. Lật ngược hai phiến kính lại và đặt lên kính hiển vi để quan sát với vật kính dầu.
10. Cách làm tiêu bản giọt treo
11. Bài 4: QUAN SÁT NẤM SỢI Nấm sợi (nấm mốc) thường được nhận diện bằng các đặc điểm hình thái đặc trưng quan sát được dưới kính hiển vi. Tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty thể. Sợi nấm có thể có hoặc không có vách ngăn. Khuẩn ty mọc lên trên bề mặt cơ chất thường là những cấu trúc mang bào tử. Cuống mang bào tử có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh. Bào tử vô tính của nấm sợi thường tập trung trong hai nhóm: bào tử kín và bào tử trần. Hai giống nấm sợi Aspergillus và Penicillium thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes , không có hình thức sinh sản hữu tính. Hệ sợi có vách ngăn. Bào tử vôi tính là bào tử trần. Mucor và Rhizopus thuộc nhóm nấm tiếp hợp Zygomycetes . Hệ sợi không có vách ngăn và có thể có rễ giả. Bào tử vô tính là bào tử kín. Bào tử hữu tính là bào tử tiếp hợp. Rhizopus có cuống mang bào tử và không phân nhánh. Mucor có cuống mang bào tử phân nhánh. Aspergillus sp. Mucor sp. Rhizopus sp.
12. Qui trình + Sử dụng các nấm sợi sau trong thí nghiệm: Mucor, Aspergillus, Rhizopus + Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm trên hộp petri. + Dùng một miếng băng keo trong, đặt mặt có keo dính lên khuẩn lạc nấm mốc. Sau đó lấy ra và áp sát vào phiến kính sao cho băng dính dính chặt vào phiến kính. + Quan sát dưới kính hiển vi
13. Bài 5: TẠO VẾT BÔI VÀ NHUỘM ĐƠN Tiêu bản giọt ép đem lại rất nhiều thông tin nhưng chúng cũng có những nhược điểm nhất định. Vi sinh vật di chuyển trong dịch lỏng bởi chuyển động Brown hay tự chuyển động nên rất khó khăn trong việc quan sát. Chúng ta có thể thấy được hình dạng và hoạt động của vi sinh vật nhưng không thể xác định chính xác hình thái của chúng (đặc biệt là nhóm vi khuẩn). Do vậy, để xác định chính xác hình thái của vi sinh vật người ta thường sử dụng phương pháp nhuộm màu (quan sát vi sinh vật chết) Vi khuẩn có thành tế bào vững chắc để duy trì hình dạng của mình. Vì vậy, chúng ta có thể phân loại vi khuẩn căn cứ theo hình dạng của chúng. Vi khuẩn có ba dạng cơ bản: hình cầu ( spherical , round ), hình que (hình gậy, rod ) và hình xoắn ( spiraled ). Vi khuẩn hình cầu gọi là coccus (số nhiều là cocci ). Vi khuẩn hình que gọi là bacillus (số nhiều là bacilli ) hay chỉ đơn giản gọi là rod . Vi khuẩn có dạng xoắn có tối thiểu hai đến ba đường cong trên tế bào được gọi là spirillum (số nhiều là spirilla ). Các vi khuẩn có tế bào dài và ngoằn ngoèo với các vòng xoắn (lỏng hoặc chặt) được gọi là spirochetes . Cách thức mà các tế bào tạo thành nhóm thì đặc trưng cho từng giống hoặc loài vi khuẩn. Các tế bào đứng thành từng cặp ( diplococci ), đứng thành chuỗi ( streptococci ), đứng thành từng cụm ( staphylococci ), hoặc đứng thành một cụm bốn tế bào ( tetrads ), và đôi khi chúng cũng đứng thành từng tế bào riêng lẻ. Các vi khuẩn hình que ( bacilli ) thường ở dạng một tế bào riêng lẻ, nhưng cũng có khi xuất hiện ở dạng một cặp nối tiếp nhau ( diplobacilli ) hay đứng thành một chuỗi dài (streptobacilli ). Một số loài có khuynh hướng đứng thành một cụm các tế bào hình que song song ( palisade ) hoặc tạo thành hình chữ V, X, Y khi chúng nhân đôi và phân chia. Một số loài tạo thành nhiều hình dáng và kích thước khác nhau (đa hình thể, pleomorphism). Các xoắn khuẩn thường xuất hiện ở dạng một tế bào đứng riêng lẻ và thường không kết thành nhóm. 1. Tạo vết bôi và làm tiêu bản nhuộm đơn Tạo vết bôi vi khuẩn ( bacterial smear ) là làm khô tế bào vi khuẩn trên phiến kính. Các bước thực hiện cơ bản là (1) vi khuẩn được trải lên phiến kính sao cho các tế bào nằm thành một lớp mỏng, (2) tế bào vi khuẩn không bị rửa trôi trong quá trình nhuộm và (3) vi khuẩn không bị biến dạng. Sử dụng phương pháp nhuộm đơn sẽ tạo sự tương phản giữa vi khuẩn và cảnh nền. Phương pháp này được dùng để thu thập thông tin về hình dạng, kích thước và sự sắp
14. xếp của tế bào. Bước kế tiếp là đặt phiến kính lên giá, phủ lên vết bôi phẩm nhuộm, chờ một vài giây. Các phẩm nhuộm cơ bản thường dùng là crystal violet (thời gian nhuộm 20 – 30 giây), carbolfuchsin (thời gian nhuộm 5 – 10 giây) hoặc methylene blue (thời gian nhuộm 1 phút). Tạo vết bôi i. Dùng bút lông (không xóa) khi chú tên vi khuẩn ở một đầu phiến kính. Dùng băng keo trong dán đè lên dòng chữ vừa ghi ii. Lắc kỹ dung dịch vi khuẩn. Với thao tác vô trùng chuyển 1 hoặc hai vòng cấy vi khuẩn vào giữa phiến kính. Trải đều trên diện tích khoảng ½ inch. Nếu tạo vết bôi từ môi trường rắn thì cho một giọt nước vào giữa phiến kính và dùng que cấy thẳng cho một lượng nhỏ sinh khối vào giọt nước. Trộn đều sinh khối với giọt nước. Trải đều trên diện tích khoảng ½ inch. iii. Hơ phiến kính trên ngọn lửa để cố định và giết chết vi khuẩn. Nhuộm đơn i. Đặt phiến kính lên bàn (hay lên giá). ii. Nhuộm với phẩm nhuộm (alkaline methylene blue trong 1~1.5 phút, cabolfuchsin trong 5 ~10 giây, hoặc crystal violet trong 20 ~30 giây) iii. Rửa trôi thuốc nhuộm bằng nước trong vài giây. iv. Thấm khô bằng giấy thấm. Không được chà xát lên vết bôi. v. Quan sát bằng kính hiển vi với vật kính dầu vi. Có thể sử dụng ba loại phẩm nhuộm khác nhau với cùng một loại vi sinh vật để có sự so sánh.
15. Tạo vết bôi vi sinh vật Hình dạng cơ bản và sự sắp xếp của các tế bào vi khuẩn.
16. (a) Cocci. 1.Diplococci (cặp); 2. Treptococci (chuỗi); 3. Staphylococci (chùm nho); 4.Tetrads (nhóm 4 tế bào). (b) Bacilli (hình que). 1. Streptobacilli (chuỗi); 2. Palisades; hình V, X và Y; 3. Bacilli tạo bào tử (bào tử nhỏ, tròn, rỗng, không bị nhuộm màu, ở giữa hay một đầu của tế bào); 4. Một bacillis đa hình thể (chiều dài và rộng khác nhau). (c) Xoắn khuẩn. 1. Spirilla (hình uốn cong hay xoắn ngắn); 2. Spirochetes (dài, cuộn xoắn chặt hay lỏng lẻo) Vi khuẩn được nhuộm bằng Crystal Violet. (a) Bacillus subtilis (x1000). (b) Spirillus volutans (x 1000). (c) Micrococcus luteus (x 1000)
17. Một số hình dạng thông thường của vi khuẩn
18. Bài 6: NHUỘM GRAM Vào năm 1884, Christian Gram, một nhà nghiên cứu bệnh học người Đan Mạch, đã khám phá ra một phương pháp nhuộm vi sinh vật bằng phẩm nhuộm pararosaniline. Thông qua việc sử dụng theo trình tự hai loại phẩm nhuộm, có 2 màu khác nhau, ông ta đã nhận thấy vi khuẩn được chia thành 2 nhóm. Nhóm thứ nhất giữ màu phẩm nhuộm đầu tiên: crystal violet (nhóm vi khuẩn gram dương ). Nhóm thứ hai bị mất màu phẩm nhuộm đầu tiên sau khi được rửa bằng một dung dịch tẩy màu rồi được tiếp tục nhuộm bằng phẩm nhuộm thứ hai là safranin hay carbon fuchsin (nhóm vi khuẩn gram âm ). Dung dịch iodine được dùng như là một chất cẩn màu ( mordant ) (có nhiệm vụ gắn phẩm nhuộm lên/vào một chất bằng cách kết hợp với phẩm nhuộm để tạo phức không tan) ở sau lần nhuộm đầu tiên. Cơ chế của kỹ thuật nhuộm này chưa được hiểu một cách tường tận. Tuy nhiên, người ta vẫn cho rằng đó là do có sự khác biệt về thành phần hóa sinh của thành tế bào vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương thì có nhiều peptidoglycan (phức chất của protein đường) và các peptidoglycan này được liên kết chặt chẽ với nhau từ đó giúp cho tế bào có thể kháng lại chất tẩy màu. Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thành phần lipid ở nồng độ cao cho nên chúng có thể hòa tan trong chất khử màu (alcohol, acetone, ) và bị rửa trôi cùng với crystal violet. Nhuộm Gram là một trong số các công cụ hữu dụng nhất trong các phòng thí nghiệm vi sinh và được sử dụng rất thường xuyên. Phương pháp nhuộm Gram được cải biên bằng cách thay đổi nồng độ phẩm nhuộm, thời gian nhuộm và thành phần của chất tẩy màu. Phương pháp cải biên của Hucker, được sử dụng trong bài thí nghiệm này, hiện nay đang được sử dụng rộng rãi. Việc lựa chọn chất tẩy màu tùy thuộc vào thời gian mong muốn hoàn thành các bước nhuộm. Sử dụng ethyl alcohol 95%, dùng trong bài thí nghiệm này, cho phép sinh viên tập làm quen với chất tẩy màu bởi vì nó có tác dụng rất chậm. Acetone là chất tẩy màu có tác dụng nhanh nhất trong khi hỗn hợp (50:50) của ethyl alcohol 95% và acetone thì ở mức trung bình. Hỗn hợp acetonealcohol thường được dùng trong các phòng thí nghiệm. Vật liệu và hóa chất Dung dịch Crystal violet + 2 g Crystal violet hòa tan trong 20 ml ethanol 95% + 0.8 g Ammoni oxalate hòa tan trong 80 ml nước cất + Trộn 2 dung dịch trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ sẫm màu, sử dụng trong vài tháng