Bài giảng Công nghệ di truyền - Chương 2: Polymerase chain reaction - Nguyễn Vũ Phong

Nội dung text: Bài giảng Công nghệ di truyền - Chương 2: Polymerase chain reaction - Nguyễn Vũ Phong

1. Ứng dụng 1. Giải trình tự DNA 2. Chẩn đoán - Xác định tính trạng di truyền - Phát hiện sinh vật gây bệnh - Phát hiện chất gây nhiễm thực phẩm 3. Pháp y 4. Đa dạng di truyền quần thể 5. Khảo cổ học và tiến hóa
2. Cần quan tâm • Kích thước sản phẩm – Hỗn hợp enzyme (+ 1 proof-reading) sẽ tăng kích thước sản phẩm khoảng 10 kb. (Long-rang PCR) – Cần kéo dài thời gian cho long-rang PCR – Tuổi mẫu (chất lượng mẫu) tỉ lệ nghịch với kích thước khuếch đại của sản phẩm. • Khuếch đại sản phẩm sai trình tự – Primer bắt cặp khuếch đại đoạn không mong muốn (không đặc hiệu, nồng độ muối, nhiệt độ, ) – Sử dụng primer đặc hiệu, tăng nhiệt độ bắt cặp, tăng Mg ion
3. Cần quan tâm • Nhiễm lẫn – Vật dụng, thao tác, tác nhân sinh học trong phòng thí nghiệm – Thao tác cẩn thận, giữ sạch nơi thí nghiệm • Sản phẩm không đồng nhất – Mẫu không đồng nhất, đến từ nhiều nguồn khác nhau hoặc bị suy thoái (degradation) – Hiệu quả của enzyme polymerase
4. Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Hot-start PCR – Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn. – Cho enzyme polymerase vào dung dịch khi đạt nhiệt độ bắt cặp tối thích. – Bọc enzyme hoặc muối Mg bằng sáp – Sử dụng antibody bất hoạt enzyme giai đoạn đầu.
5. Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Touch-down PCR – Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn. – Nhiệt độ bắt cặp ban đầu cao tránh bắt cặp không đặc hiệu xảy ra, sau đó sẽ giảm đến nhiệt độ bắt cặp tối thích
6. Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Nested-PCR Tăng độ chuyên biệt.
7. Hard- copies
8. Hard-copies
9. Hard- copies
10. Inverse PCR
11. Reverse transcriptase PCR (RT-PCR)
12. RT-PCR
13. Quantitative PCR (qPCR) – Kết quả khuếch đại DNA thể hiện qua từng chu kỳ nhiệt – Sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang khi chèn vào trong sợi đôi DNA (ex: SYBER Green) – Hoặc sử dụng các đoạn đầu dò đặc hiệu mang chất phát huỳnh quang (ex: Taq man probe)
14. Quantitative PCR (qPCR) Hệ thống SYBER Green
15. Quantitative PCR (qPCR) Hệ thống Taqman probe
16. PCR mỏ neo (anchored PCR)
17. Các loại PCR khác • Multiplex – PCR • Mutagenesis • Asymmetric PCR • Isothermic amplification (Loop mediated isothermal amplification)