Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật môi trường

Bài 1: CÁC QUY TẮC PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ 

KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

 

  1. Các quy tẮc phòng thí nghiỆm
    1. Tiệt trùng bề mặt và môi trường làm việc

Phòng thí nghiệm vi sinh phải được vệ sinh trước và sau khi sử dụng.

Dụng cụ thiết bị được khử trùng hay vệ sinh sạch sẽ và sắp sếp ngăn nắp.

Bề mặt làm việc phải được tiệt trùng bằng cồn 700.

  1. Máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm:

Dụng cụ bằng thuỷ tinh hoặc kim loại: 

  • Các dụng cụ đựng môi trường dinh dưỡng phải được khử khuẩn tuyệt đối trước khi sử dụng. Sau khi sử dụng xong phải rửa sạch và khử khuẩn lại, sấy khô, bao gói và để vào nơi quy định.

- Các máy móc, thiết bị cần có độ chính xác cao (cân phân tích, buồng đếm…) càng cần phải chú ý vệ sinh trong và sau khi tiến hành thí nghiệm 

Có hai phương pháp tiệt trùng: nhiệt khô hoặc nhiệt ẩm.

*Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt khô: Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 170 -1800C

*Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm: Được thực hiện trong thiết bị tiệt trùng áp suất 1atm, 1210C trong thời gian 20-30 phút.

Dụng cụ bằng plastic chịu nhiệt: Tiệt trùng bằng nhiệt ẩm.

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Thường được tiệt trùng trong thiết bị tiệt trùng ở 1210C, 20-30 phút.

Đối với những thành phần của môi trường dinh dưỡng nhạy cảm với nhiệt độ cao không thể sử dụng phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt trong thiết bị tiệt trùng. Trong những trường hợp đó cần sử dụng màng lọc vi khuẩn để tiệt trùng.

docx 65 trang thiennv 11/11/2022 2800
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật môi trường", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên.

File đính kèm:

  • docxgiao_trinh_thuc_hanh_vi_sinh_vat_ky_thuat_moi_truong.docx

Nội dung text: Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật môi trường

  1. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường - Lấy mẫu đất: mẫu đất mang phân tích có tính đại diện nên số lượng mẫu tùy theo yêu cầu nghiên cứu khác nhau. Mẫu đất lấy từ 10-20g cho mỗi vị trí, lấy 4 mẫu của 4 góc vuông và 1 mẫu ở tâm, độ sâu nhất định và mẫu phải được trộn đều trước khi sử dụng. - Chuẩn bị dụng cụ: Một bình tam giác 250 ml chứa 90ml nước cất vô trùng Một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng Một số pipet vô trùng. - Pha loãng mẫu: cân 10 g đất (hoặc mẫu) cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng. Lắc 10 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như trạng thái lỏng. Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít. Hình 2.2: Phương pháp pha loãng mẫu đặc theo dãy thập phân 10
  2. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường 3.KỸ THUẬT TRẢI ĐĨA Hình 2.3: Minh họa kỹ thuật trải đĩa Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tương đương với 2 giọt dịch). Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và khoảng 25-300 CFU (coliform unit: đơn vị khuẩn lạc). Sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch, que gạt thuỷ tinh được vô khuẩn bằng cách nhúng vào trong cồn, đốt cháy phần cồn còn lại trên que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Làm nguội que cấy bằng cách nhẹ nó vào bề mặt thạch, rồi dàn đều lượng chất lỏng chứa tế bào trên đó. Lớp chất lỏng trên thạch càng mỏng, sự hấp thu xảy ra càng nhanh. Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 300C và ủ trong 48 giờ. Kết quả: Số khuẩn lạc (CFU) x Độ pha loãng CFU/g = Thể tích mẫu (ml) 11
  3. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường 4. THỰC HÀNH 4.1. Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Đĩa petri 60 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái Que trang 6 Cái Ống nghiệm 30 Cái 4.2. Hóa chất và môi trường Môi trường Plate count agar (PCA) tổng hợp 23,5g hay môi trường thành phần gồm: Trypton, 5.0g; Yeast extract, 2.5g; Glucose, 1.0g; Agar,15g. Cân chính xác khối lượng môi trường cho vào becher 1,5 lít và thêm vào 1 lít nước cất. Đun nóng hỗn hợp đến khi tan đều rồi cho vào erlen 1,5 lít đem hấp khử trùng. Lưu ý, trong khi đun môi trường cần phải khuấy thường xuyên để môi trường không bị lắng và khét. Sau đó, hấp khử trùng ở 1210C, 1atm và thời gian 30 phút. Chuẩn bị: Cồn 960 2 lít Nước cất 5 lít NaCl tinh khiết 10g 4.3. Thực hành - Pha nước muối sinh lý 0,9% - Pha loãng mẫu (mẫu nước và đất) - Đổ đĩa. - Trải đĩa Đọc kết quả và viết báo cáo 12
  4. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 2 1. Số liệu báo cáo 1 2 3 Nồng độ pha loãng . ĐẠT Số khuẩn lạc KHÔNG Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: 2.1. Tại sao phải pha loãng mẫu? Các bước pha loãng mẫu? 2.2. Vi sinh vật hiếu khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác định tổng vi khuẩn hiếu khí? 2.3. Tại sao phải khử trùng hay sát trùng toàn bộ: môi trường, dụng cụ, tay trong quá trình thao tác? Ý nghĩa việc khử trùng và sát trùng? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi 13
  5. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường BÀI 3: XÁC ĐỊNH TỔNG VI KHUẨN KỴ KHÍ 1.KỸ THUẬT ĐỔ MÔI TRƯỜNG VI KHUẨN KỴ KHÍ Phân lập các vi sinh vật kị khí trên môi trường đặc ở đĩa petri. Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khí trong môi trường. Để nguội môi trường còn 45 - 500C. Hút 0,1 ml mẫu vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm. Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa petri và đậy thật nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí. Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri. Nuôi trong bình yếm khí: sau khi cấy vi khuẩn xong, cho vào bình yếm khí. Thoa một lớp parafin lỏng lên miệng bình, đốt đèn cồn hay đèn cầy lên và đặt vào bình, đậy nắp lại, hoặc dùng máy hút chân không. Cho vào tủ ấm, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường, dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp. Ngoài ra, người ta còn sử dụng phương pháp xác định tổng vi khuẩn kị khí bằng ống nghiệm đậy nút cao su nhưng môi trường nuôi cấy phải bổ sung đầy đủ glucose, trypticase, yeast và một số các muối khoáng khác cho vi khuẩn phát triển, đặc biệt phải bổ sung các tác nhân khử như cystein và Na2S vào môi trường. Thao tác thực hiện: Môi trường sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-46 0C. Bổ sung vài giọt Na2S + NaHCO3 để khử hết O2 trong môi trường. Cân 1g mẫu đất và pha loãng mẫu bằng nước cất vô trùng theo dãy thập phân liên tiếp, tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp sao cho khuẩn lạc mọc trên đĩa khoảng 30 - 300. Không để mẫu trong nước pha loãng lâu hơn 30 phút. Hút 1ml mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm vô trùng. 14
  6. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Rót môi trường ở nhiệt độ 40-46 0C vào ống nghiệm có chứa mẫu. Rót môi trường nhẹ nhàng tránh không tạo bọt khí và không để môi trường tràn ra ngoài. Đậy ống nghiệm bằng nút cao su vô trùng. Chờ cho thạch đông cứng lại và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày đếm các khuẩn lạc riêng rẽ quan sát được. 2. THỰC HÀNH 2.1. Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Ống nghiệm 60 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái 2.2. Hóa chất và môi trường Thành phần môi trường NH4NO3 2g KH2PO4 1g NaCl 10g MgSO4.7H20 3,3g Glucose 1g Pepton 5g Cao men 0,5g Agar 12g Sau khi khử trùng ở 1210C trong 15 phút, môi trường có pH 7.0 – 7.2. Cách pha hỗn hợp Na 2S + NaHCO3: Cân 0,75g Na2S và 0,3g NaHCO3 pha trong 30ml nước cất. 15
  7. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Môi trường sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-46 0C. Bổ sung vài giọt Na2S + NaHCO3 để khử hết O2 trong môi trường. - Cồn 960 2 lít - Nước cất 5 lít - NaCl tinh khiết 10g 2.3. Thực hành - Pha loãng mẫu (mẫu nước và đất) - Đổ ống nghiệm Đọc kết quả và viết báo cáo 3. CHUẨN BỊ Đổ môi trường PGA 16
  8. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 2 1. Số liệu báo cáo 1 2 3 Nồng độ pha loãng . ĐẠT Số khuẩn lạc KHÔNG Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: 2.1. Tại sao phải sử dụng dung dịch Na2S + NaHCO3 ? 2.2. Vi sinh vật kỵ khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác định tổng vi khuẩn kỵ khí? 2.3. Phân biệt sự khác nhau giữa vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí? 2.4. Ý nghĩa việc xác định tổng vi khuẩn kỵ khí trong môi trường? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi 17
  9. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường BÀI 4: XÁC ĐỊNH TỔNG VI NẤM 1. NGUYÊN TẮC Nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển trong khoảng 20 – 280C, một số ít là ưa nóng và ưa lạnh. Vi nấm có khả năng sinh trưởng trong vùng pH từ 2-9, nhưng pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 – 6,5. Hầu hết vi nấm đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí. Mật độ vi nấm trong mẫu được xác định dưới dạng tổng vi nấm bằng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường thích hợp. 2. THỰC HÀNH 2.1. Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Đĩa petri 60 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái 2.2. Hóa chất và môi trường Thành phần môi trường: Khoai tây 300g Glucose 20g Agar 15g Pha chế môi trường: Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và lọc lấy dịch lọc, sau đó bổ sung đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh pH đến 5,5 để ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút. 18
  10. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Chuẩn bị: - Cồn 700 2 lít - Cồn 960 2 lít - Nước muối sinh lý 1 lít - Nước cất 5 lít 2.3. Thực hành - Đổ môi trường - Trải đĩa Đọc kết quảvà viết báo cáo 3. CHUẨN BỊ Chuẩn bị môi trường Lauryl Sulphate broth (LSB) 19
  11. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 4 1. Số liệu báo cáo Nồng độ pha loãng 1 2 3 . ĐẠT Số khuẩn lạc KHÔNG Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: 2.1. Vi nấm là gì? 2.2. Phương pháp xác định tổng vi nấm? 2.3. Phân biệt khuẩn lạc vi khuẩn và vi nấm? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi 20
  12. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP MPN 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT 1.1. Đếm trên lam phết kính Tiêu bản vi sinh vật đã được nhuộm màu (nhuộm đơn). Hình 5.1: Diện tích hình vuông phết kính Sơ đồ: Di chuyển vật kính trong hình vuông phết kính, để đếm số VSV/1VT a. Phết kính: - Dùng lam sạch và bút chì mỡ (bút lông kim), kẻ một hình vuông S = 400 mm 2, ở mặt trên lam. Mục đích không cho vi sinh vật lan ra khỏi diện tích đếm. - Hút 0.02-0.2 ml dung dịch pha loãng , nhỏ vào giữa hình vuông, ở mặt trên lam. - Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy ở đầu que dàn đều giọt mẫu ra xung quanh, vừa chạm vào cạnh hình vuông. - Cố định tiêu bản, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm blue methylen. - Nhỏ một giọt dầu soi, xem ở vật kính x100. b. Cách đếm - Đếm số tế bào VSV/ 1VT (VT: vi trường). - Đếm hết tất cả từ 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính. Theo sơ đồ hình vẽ. c. Công thức tính 21
  13. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Trong đó: X = Số VK đếm được trong một vi trường 400 = diện tích hình vuông phết kính, bằng 400mm2 0.0004 = diện tích của vi trường, πR2 = 0.0004 mm2 Số vi trường có được trong S: 4cm2 V = thể tích giọt VK phết kính H = hệ số pha loãng mẫu 1.2. Đếm trong buồng đếm: a. Cấu tạo buồng đếm. - Buồng đếm là một phiến kính trong, dày, hình chữ nhật. - Giữa là phần lõm phẳng, có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ. Bên ngoài có ghi tên loại buồng đếm, và ghi các thông số kỹ thuật như hình trên. Hình 5.2: Cấu tạo buồng đếm 22
  14. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường b. Cấu tạo khung đếm. Hình 5.3 Cấu tạo khung đếm Cấu tạo một khung đếm có: - Trường hợp1: 1 khung có 16 ô lớn, 1 ô lớn có 25 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ. - Trường hợp 2: 1 khung có 25 ô lớn, 1 ô lớn có 16 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ. - Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400 mm2. 2 3 Vậy Vô nhỏ = 0.1 mm x 1/400 mm = 1/4000mm . c/ Cách tiến hành. - Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm. - Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch nấm men đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu, bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm và lammen. - Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lammen, hơi thừa một ít. Nếu bị bọt kẹt lại trong lammen thì phải làm lại. - Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm. - Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó dùng vật kính x40 để đếm. 23
  15. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường - Đếm số tế bào trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh, 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏ trong 1 ô lớn. Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm số tế bào nằm ở cạnh phía trên và cạnh bên phải ô. - Đếm tất cả 80 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (T/h: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ). - Hoặc đếm 125 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (T/h: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ). d. Công thức tính. Trong đó: a = số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ (V = 1/ 4.000 mm3) 4.000 = số qui đổi từ 1/4.000 mm3 thành 1 mm3. 1.000 = số qui đổi từ 1 mm3 thành 1ml (1ml = 1.000 mm3) H = hệ số pha loãng (ví dụ: H = 10-2) e. Chú ý: - Phương pháp này chỉ sử dụng để quan sát những vi sinh vật có kích thước lớn như bào tử của nấm men và nấm mốc. - Chỉ đếm được tổng số tế bào, không thể biết tế bào nào còn sống hay đã chết. - Nên nhuộm màu (methylene blue) để dễ quan sát và đếm chính xác. - Nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10 tế bào. - Sử dụng xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô. - Để đạt độ chính xác cao, thì số tế bào trung bình đếm được trong 1 ô nhỏ: 2.5 < a <10. 1.3. Phương pháp trải đĩa Tương tự thao tác trải đĩa, số lượng tế bào vi sinh vật được xác định qua khuẩn lạc. Khuẩn lạc là các cá thể hay tế bào vi sinh vật được nuôi cấy trong các điều kiện môi trường thích hợp, sau đó phân chia tạo thành nhiều cá thể hay quần thể vi sinh vật mà mắt thường nhìn thấy được. 24
  16. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường 1.4. Phương pháp MPN (Most Probable Number) Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất; số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục ), ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng. Cụ thể là xác định số lượng Coliforms trong thực phẩm, nước uống, nước sinh hoạt hoặc nước thải. Thao tác: 25
  17. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Bước 1: Lấy mẫu và pha loãng mẫu đến 3 nồng độ liên tiếp thích hợp. Bước 2: Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 3 ống nghiệm môi trường Lauryl Sulphate broth (LSB). Hút 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 3 ống nghiệm. Bước 3: Ủ ấm từ 35 – 370C, thời gian 24 - 48 giờ. Bước 4: Ống dương tính là có bọt khí trong ống durham. Bước 5: Tra bảng Mac Crady – loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ liên tiếp. Bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10 ml, 1ml và 0,1ml tương đương MPN/ml của mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2 và 10-3 dùng phân tích. Kết quả tra bảng MPN/ml = kết quả tra bảng x f/10 ( f độ pha loãng thấp nhất 10n) Lưu ý: Các ống nghiệm có khả năng hiện diện của coliform là dương tính cả hai môi trường LSB và BGBL. 2. THỰC HÀNH 2.1. Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Ống nghiệm 100 Cái Đĩa petri 20 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái 2.2. Hóa chất và môi trường Môi trường LSB và BGBL Cân chính xác khối lượng môi trường tổng hợp hay thành phần của từng môi trường. đun nóng cho môi trường đồng nhất rồi phân phối vào các ống thí nghiệm có ống durham. Lưu ý: lượng môi trường trong ống nghiệm phải cao hơn ống durham. Cần loại bỏ các ống durham có bọt khí sau khi hấp khử trùng. Hấp khử trùng môi trường ở 1210C, 1atm, 15 phút. 26
  18. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Chuẩn bị: Cồn 960 2 lít Nước cất 5 lít 2.3. Thực hành Mẫu nước: nước thải và nước sinh hoạt Mẫu đất Định lượng trực tiếp số lượng tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu. Định lượng E.coli và Coliforms bằng phương pháp MPN. Đọc kết quả Viết báo cáo 3. CHUẨN BỊ Violet Red Bile Agar (VRBA) 27
  19. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 5 1. Số liệu báo cáo 1.1. Kết quả quan sát trên buồng đếm hồng cầu: Nồng độ pha loãng 1 2 3 . Số tế bào 1.2. Kết quả đếm bằng phương pháp MPN Nồng độ pha loãng 1 2 3 . ĐẠT Tra bảng . KHÔNG Nhận xét kết quả: 28
  20. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường 2. Câu hỏi ôn bài: 2.1. Nhược điểm của phương pháp điếm tế bào vi sinh vật bằng buồng đếm hồng cầu là gì? 2.2. Thao tác sử dụng kính hiển vi quan sát và đếm tế bào vi sinh vật? 2.3. Tại sao phải sử dụng môi trường BGBL sau khi xác định bằng môi trường LSB? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi 29
  21. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường BÀI 6: XÁC ĐỊNH E.COLI VÀ COLIFORM 1. TỔNG QUAN Vi khuẩn Coli (Total coliform) tồn tại trong tự nhiên, trong phân người, phân gia súc, trong nước, trong nước thải hay trong các vật phẩm có nguồn gốc khác nhau. Theo đặc tính nuôi cấy, người ta chia chúng làm hai nhóm: - Fecal Coli (Escherichia coli - E.coli) có nguồn gốc từ phân (người, động vật, cá ) - Non fecal Coli (Bacterium coli) có nguồn gốc khác (đất, cây cỏ, nước thải ) Vi khuẩn E.coli thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae, chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng. Vi khuẩn E.coli nhiễm vào đất, nước từ phân của động vật. Sự có mặt của chúng chứng tỏ nước bị nhiễm phân hoặc nước thải sinh hoạt. Chúng sẽ gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chúng. - Hình dạng: Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực không có capsul. Kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu tròn. Một số dòng có lông bám (pili). - Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa: Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp 370C nhưng có thể mọc trên 400C, pH 7,4. - Trên môi trường VRBA tạo khuẩn lạc màu tím. - E.coli gây bệnh truyền nhiễm tiêu chảy hay nhiễm trùng huyết trẻ sơ sinh Ngoài ra, nước thải nhiễm E.coli còn có thể nhiễm các vi sinh vật khác có trong đường ruột như vi khuẩn tả (Vibrio choleras), vi khuẩn lỵ (Shigella), 2. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG 2.1. Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Đĩa petri 60 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái 2.2. Hóa chất và môi trường Môi trường VRB 30
  22. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường Cân môi trường tổng hợp hay thành phần sau đó thêm nước nước cất thích hợp rồi đun nóng cho hòa tan các chất với nhau. Đổ môi trường thạch đĩa mà không cần phải hấp khử trùng. Chuẩn bị: Cồn 700 1 lít Cồn 960 2 lít Nước cất 5 lít Nước muối sinh lý 1 lít 3. THỰC HÀNH Mẫu nước và mẫu đất: - Pha loãng mẫu theo dãy nồng độ thập phân - Chọn nồng độ thích hợp, lấy một lượng mẫu vừa phải cho vào đĩa petri có chứa môi trường VRB. - Trải đĩa và đem ủ ở nhiệt độ thích hợp, sau 24 giờ đọc kết quả. Đọc kết quả: Sau 24 giờ các khuẩn lạc đặc trưng là E.coli và Coliform có màu đỏ tía, đường kính 0.5mm hoặc hơn, đôi khi được bao quanh bởi một vùng hơi đỏ của mật kết tủa. Viết báo cáo 4. CHUẨN BỊ Môi trường NA 31
  23. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 6 1. Số liệu báo cáo 1 2 3 . ĐẠT Số khuẩn lạc KHÔNG Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: 2.1. Coliform là gì? E.coli là gì? Tại sao phải nhận biết Coliform và E.coli? 2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy Coliform? Các phương pháp xác định E.coli đã học, ưu điểm và nhược điểm của mỗi phương pháp? 2.3. So sánh mẫu phân tích theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN)? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi 32
  24. Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường BÀI 7: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN VI SINH VẬT 1. KHÁI NIỆM Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ 1 tế bào ban đầu. Nguyên tắc: - Tách rời các tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. - Sau khi phân lập vài lần, từ khóm thuần cấy truyền sang ống môi trường thạch nghiêng hay ống nghiệm canh để gia tăng số lượng vi sinh vật. 2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT 2.1. Môi trường thạch đĩa 2.1.1. Kỹ thuật hộp ria - Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống. - Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốn góc). Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo. - Bao gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm. 33