Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 8: Các kỹ thuật phân tích trong Sinh học phân tử - Nguyễn Hữu Trí

Nội dung text: Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 8: Các kỹ thuật phân tích trong Sinh học phân tử - Nguyễn Hữu Trí

1. Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế • Cho phép định lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu. • Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base. • Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào mối tương quan: • Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ: • 50μg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi • 40 μg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn • Định tính: độ sạch dựa trên tỉ số OD260/OD280, tính chất của nucleic acid (mạch đôi/đơn) (280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức độ hấp thụ cao nhất. • 24/03/2016 3:01 SA 21 Nguyễn Hữu Trí Các phương pháp lai phân tử 24/03/2016 3:01 SA 22 Nguyễn Hữu Trí 11
2. Cơ sở của sự lai phân tử  Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết H giữa hai mạch.  Sau khi hai mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản ứng được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử.  Đặc điểm của sự lai phân tử:  Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung với nhau.  Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA 24/03/2016 3:01 SA 23 Nguyễn Hữu Trí Các kiểu lai phân tử • Lai trên pha lỏng • Lai trên pha rắn • Lai tại chỗ 24/03/2016 3:01 SA 24 Nguyễn Hữu Trí 12
3. Các kiểu lai phân tử Lai trong pha lỏng: Các trình tự cần lai nằm trong pha lỏng, là một dung dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm. Phương pháp này được sử dụng để phát hiện các trình tự tương đồng (giữa các loài hay trong một cá thể). 24/03/2016 3:01 SA 25 Nguyễn Hữu Trí Các kiểu lai phân tử Lai trong pha rắn: Một trong hai trình tự cần lai được cố định trên giá thể rắn (màng lai). Phát hiện phân tử lai thông qua mẫu dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ. Ba kĩ thuật lai trên pha rắn thông dụng là Southern blot, Northern blot, Dot blot. 24/03/2016 3:01 SA 26 Nguyễn Hữu Trí 13
4. Các kiểu lai phân tử Lai tại chỗ: Trình tự nucleic acid cần tìm không được tách chiết ra khỏi mô hay tế bào. Quá trình lai với mẫu dò đã được đánh dấu và phát hiện các phân tử lai được thực hiện ngay trên nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt mô. 24/03/2016 3:01 SA 27 Nguyễn Hữu Trí Southern blot • Nguyên tắc của Southern blot là màng lai nitrocellulose có khả năng tiếp nhận DNA đã được biết từ lâu và đã được sử dụng trong các nghiên cứu lai axit nucleic khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960. • Đầu thập niên 1970, sự ra đời của phương pháp điện di trên gel đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. • Từ đó bước phát triển tiếp theo của phương pháp là chuyển các đoạn DNA phân tách từ gel lên màng lai nitrocellulose. • Phương pháp này được E. M. Southern mô tả tại Ðại học Edingburgh vào năm 1975. 24/03/2016 3:01 SA 28 Nguyễn Hữu Trí 14
5. Southern blot Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau: 1. Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp. 2. Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose. 3. Làm biến tính DNA ngay trên gel, DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai. 4. Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai (màng nitrocellulose hay màng nylon). Việc chuyển DNA thường được tiến hành bằng hoạt tính mao dẫn trong khoảng vài tiếng hoặc có thể dùng một thiết bị thấm chân không. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được giữ nguyên không thay đổi. 5. Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu. Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa DNA trên màng lai với mẫu dò. Ðể đánh dấu người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò phát quang sinh học. 6. Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò. Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, nếu sử dụng biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu hoặc nếu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang. 24/03/2016 3:01 SA 29 Nguyễn Hữu Trí Southern blot 15
6. Northern Blot: RNA-DNA*(RNA*) • Sau khi E. M. Southern mô tả phương pháp Southern blot vào năm 1975, Alwine đã dùng một phương pháp tương tự để xác định các đoạn RNA đặc biệt gọi là Northern blot vào năm 1977. • Không cần phải cắt RNA bằng restriction enzyme. • Dùng formaldehyde để phá cầu nối Hydrogen và biến tính RNA vì mạch đơn RNA sẽ tạo cấu trúc thứ cấp và gấp cuộn. 31 Northern blot • Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau: 1. Tách RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) và xử lý với formaldehyde 2. RNA được phân tách bằng điện di trên gel agarose biến tính (có formaldehyde). 3. RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ nguyên vị trí như ở trên gel), thông thường màng nitrocellulose được dùng, tuy nhiên có thể dùng màng nylon được tích điện dương. 4. RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai RNA- DNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép. 5. Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò được gắn với enzyme thì đem ủ với một cơ chất không màu. Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp. 24/03/2016 3:01 SA 32 Nguyễn Hữu Trí 16
7. Northern blot 24/03/2016 3:01 SA 33 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp PCR • PCR (polymerase chain reaction-phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymease) là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực Sinh học phân tử. Phương pháp này do Kary Mullis phát minh vào năm 1985; được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993. • Nguyên tắc của phương pháp PCR: dựa vào đặc tính hoạt động của DNA polymerase: cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt để hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Như vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. • Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao. 24/03/2016 3:01 SA 34 Nguyễn Hữu Trí 17
8. Ba giai đoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR Giai đoạn biến tính (denaturation) Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ 94-950C, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất cả các liên kết hydro giữa hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn. Giai đoạn lai (hybridization) Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-700C, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng khoảng từ 3-50C) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút. Giai đoạn kéo dài (elongation) Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo 35 Nguyễn Hữu Trí dài từ 3024/03giây/2016đến 3:01nhiều SA phút. Các thành phần của phản ứng PCR 1. Primer (mồi):  Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA. Chúng bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer).  Mồi là một chỉ tiêu quan trọng của phản ứng PCR để quyết định tính đặc trưng và hiệu quả của phản ứng. Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định: dài khoảng 18-24 base; Tm của 2 mồi gần nhau; thành phần nucleotic của các mồi cần bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần; mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại; không hình thành primer dimer, không phải là trình tự lặp lại. 2. DNA bản mẫu (DNA template): hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin, ). PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay những mẫu DNA không được bảo quản tốt. 3. Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động của Taq polymerase, hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme. Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. 24/03/2016 3:01 SA 36 Nguyễn Hữu Trí 18
9. Các thành phần của phản ứng PCR 4. dNTP: thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng, sự mất cần bằng làm tăng các lỗi sao chép của polymerase; hàm lượng thường không đổi nhưng có thể thay đổi tùy điều kiện thực tế. 5. Enzyme polymerase chịu nhiệt Tag-polymerase là DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường. Tag-polymerase được nhà Vi sinh vật học Thomas Brock phát hiện ở Thermus aquaticus một loài vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ cao. Enzyme chịu nhiệt này giúp giải quyết vấn đề của enzyme biến tính sau mỗi chu kỳ. Từ đó đến nay, một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và người ta đã tách chiết thêm được các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR như Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus), UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) 6. Số lượng chu kỳ phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu, thông thường số lượng chu kỳ nhỏ hơn 40 cho một phản ứng PCR. Thời gian của từng chu kỳ phụ thuộc thiết bị và kích thước sản phẩm. 7. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR: cần đáp ứng được nhu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. Những cải tiến máy luân nhiệt quan tâm đến microtiler plate 96 giếng, các block nhiệt riêng biệt trong 1 máy, block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR. 24/03/2016 3:01 SA 37 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp PCR 5 3 Gene mục tiêu DNA bộ gene 3 5 19
10. 1 Biến tính 5 3 3 5 2 Bắt cặp Chu kỳ 1 thu 2 Primer phân tử 3 Kéo dài nucleo- tide mới Phương pháp PCR Chu kỳ 2 thu 4 phân tử Chu kỳ 3 thu 8 phân tử Chu kỳ n thu 2n phân tử 20
11. Các ứng dụng của phương pháp PCR Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông nghiệp, Một số ứng dụng có tính tổng quát:  Sản xuất mẫu dò: PCR giúp sản xuất nhanh một lượng lớn mẫu dò đánh dấu khi thực hiện các phản ứng với cặp mồi chuyên biệt và các nucleotide đánh dấu.  Khuyếch đại số lượng các RNA: sử dụng kĩ thuật phối hợp RT-PCR (kết hợp enzyme phiên mã ngược và Taq polymerase; hoặc sử dụng Tth polymerase). RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA thông tin tồn tại với hàm lượng rất thấp, không thể phát hiện bằng phương pháp cổ điển như Northern blot, Kĩ thuật in situ RT-PCR cho phép khuyếch đại các RNA ngay trên mô và tế bào.  Định lượng bằng phương pháp PCR: dùng để nghiên cứu các trình tự RNA hay DNA có số lượng bản sao rất thấp. Trình tự đích được khuyếch đại đồng thời với một trình tự chứng có nồng độ đã biết, sau phản ứng so sánh hàm lượng sản phẩm, và suy ra số lượng bản mẫu ban đầu. 24/03/2016 3:01 SA 41 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp giải trình tự (DNA sequencing) • Phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử DNA – Phương pháp Maxam và Gilbert – Phương pháp Sanger – Pyrosequencing – Array sequencing 21
12. Phương pháp Maxam và Gilbert • Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học. Lần đầu tiên công bố vào năm 1977. • Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau. • Trước hết, phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình phóng xạ. • Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch DNA đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng điện di. Kết qủa các phản ứng hóa học xử lí mạch DNA được phát hiện bằng điện di trên gel polyacriamid có thể xác định được trình tự mạch đơn. Phương pháp Maxam và Gilbert Mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ có thể xử lí theo 4 nhóm phản ứng DMS FA H H+S - Nhóm phản ứng thứ nhất xử lí mạch đơn DNA bằng dimethyl sulphat làm đứt mạch tại G. - Nhóm phản ứng thứ hai xử lí G G C mạch đơn DNA bằng axit C G A T C (pH=2) gây đứt mạch đơn tại A G G T hoặc G. G G C C C - Nhóm phản ứng thứ ba xử lí A T mạch đơn DNA bằng hydrazin G C gây đứt mạch đơn tại T và C. A C - Nhóm phản ứng thứ 4 xử lí A T mạch đơn DNA bằng hydrazin với nồng độ muối cao làm đứt mạch đơn tại C. 22
13. Phương pháp Maxam và Gilbert 3′ A A G G G+A T+C C Mảnh dài nhất C A A A C G T Mảnh ngắn nhất G C G A G 5′ Trình tự được đọc theo thứ tự từ dưới lên (5′ - 3′). Phương pháp Sanger Nguyên lý: Sanger, Smith và Coulson công bố vào năm 1977, dựa theo cơ chế tổng hợp DNA. Đã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen thực khuẩn thể X 174 Trong quá trình tổng hợp mạch đơn DNA bỏ sung một hàm lương nhỏ dideoxinucleotid (ddNTP). Do ddNTP mất cả 2 nhóm OH (carbon số 2 và 3) ngẫu nhiên làm cho phản ứng tổng hợp DNA ngừng lại. Dideoxynucleotide dùng trong DNA sequencing 23
14. Phương pháp Sanger A ddATP + ddA four dNTPs dAdGdCdTdGdCdCdCdG ddCTP + dAdGddC C four dNTPs dAdGdCdTdGddC dAdGdCdTdGdCddC dAdGdCdTdGdCdCddC ddGTP + dAddG Sự kéo dài kết thúc do sự hiện G four dNTPs dAdGdCdTddG diện của dideoxynucleotide dAdGdCdTdGdCdCdCddG T ddTTP + dAdGdCddT four dNTPs dAdGdCdTdGdCdCdCdG Phương pháp Sanger 3′ G G A T C G Mảnh dài nhất T A ddG A A T C Mảnh ngắn nhất A ddG T G 5′ Trình tự được đọc theo thứ tự từ dưới lên (5′ - 3′). 48 24
15. Giải trình tự bằng máy tự động (Sequencer) • Theo nguyên tắc sử dụng ddNTP do Sanger và cộng sự phát minh • Trong quá trình tổng hợp DNA sử dụng mồi và dNTP đánh dấu huỳnh quang, mỗi loại dNTP có ABI 3100 màu khác nhau • Máy tổng hợp mạch đơn trên cả 2 mạch khuôn, dùng phần mềm để xử lý kết quả. Chromatogram Giải trình tự bằng máy tự động (Sequencer) 5-50 25
16. Microarray Nguyên tắc: dựa vào kỹ thuật lai 1.Cố định các mẫu dò 2.DNA mục tiêu 3.Dựa vào cường độ (oligonucleotide hay sản được đánh dấu, sau phát tín hiệu của phân tử phẩm PCR) có trình tự đó lai với mẫu dò đánh dấu để xác định sự xác định trên giá thể rắn trên giá thể. có mặt DNA mục tiêu có thích hợp theo thứ tự. trong mẫu ban đầu. 26
17. Mẫu dò (Probe) • cDNA: sản phẩm PCR các cDNA trong thư viện cDNA hay từ bộ sưu tập dòng – Được in lên giá thể • Oligonuclotide: dài 20-25 mer – Tổng hợp in situ trực tiếp lên giá thể – Các oligonucleotide được tổng hợp sẵn và in lên giá thể – Gần đây các oligonucleotide dài hơn (50-100 mer) đã được phát triển để tăng độ nhạy và tính đặc hiệu. • Phương pháp microarray có thể đồng thời phân tích sự biểu hiện của hơn 30.000 gen • Ứng dụng phát hiện các mẫu có mật độ thấp vì microarray chỉ cần một lượng nhỏ mẫu. DNA mục tiêu • Được đánh dấu và sử dụng các chất chỉ thị phát hiện: – Chất phát huỳnh quang (Cy3/ Cy5, streptavidin/ phycoerythrin) – Chất phóng xạ ( 32P, 33P , 35P) – Chất phát huỳnh quang hoá học (digoxigenein, biotin, Ag, Au) 27
18. Image analysis of cDNA Microarray array Microarray cDNA microarray Oligonucleotide microarray 28
19. TheMicroarrayprocess MASSIVE PCR PCR PURIFICATION and PREPARATION PREPARING SLIDES PRINTING Chuẩn bị RNA Nuôi và thu tế bào Lai Array Tách RNA tổng số Tổng hợp cDNA Đánh dấu cDNA Microarray 29
20. Chân thành cảm ơn 24/03/2016 3:01 SA 59 Nguyễn Hữu Trí 30