Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 7: Kỹ thuật tạo dòng - Nguyễn Hữu Trí

Nội dung text: Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 7: Kỹ thuật tạo dòng - Nguyễn Hữu Trí

1. 3/24/2016 21 Nguyễn Hữu Trí Tại sao phải tạo dòng DNA? Sử dụng các DNA được tạo dòng là cách đầu tiên xây dựng bản đồ cắt giới hạn. – phân tích giải trính tự DNA được tạo dòng – Sử dụng DNA tạo dòng làm probe xác định rõ mức độ phiên mã, kích thước của mRNA – Sử dụng DNA tạo dòng như một probe để xác định DNA tương tự trong các loài khác nhau hoặc tạo thành thư viện tạo dòng – Sản xuất thật nhiều gen được tạo dòng (Ví dụ insulin protein) – Sử dụng tạo dòng để tạo antisense mRNA cho gene silencing – Tạo một reporter gene để xác định sự biểu hiện của gen 3/24/2016 22 Nguyễn Hữu Trí 11
2. Công cụ tạo dòng – Restriction endonuclease để cắt DNA – DNA Ligase để nối DNA – Vector để gắn DNA – Tế bào chủ để khuếch đại DNA – Công cụ để chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ – Công cụ để giữ DNA trong tế bào chủ – Công cụ để xác định xem tế bào nào đã được tạo dòng thành công (tầm soát) 3/24/2016 23 Nguyễn Hữu Trí Thể mang gen: vector – Một vector cần có các đặc điểm tiêu chuẩn sau: – Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc vào tế bào chủ – Có đặc tính giúp dễ xác định tế bào có chúng – Mang những vị trí nhận biết duy nhất của các enzyme cắt giới hạn – Có kích thước càng nhỏ càng tốt, dễ xâm nhập, sao chép nhanhhiệu quả. – Có số lượng bản sao trong tế bào cao – Các vector cần biểu hiện thì phải có promoter mạnh 3/24/2016 24 Nguyễn Hữu Trí 12
3. Thể mang gene: vector – Vector: phân tử DNA kích thước nhỏ dùng để mang gene, sao chép, thao tác trên gene. – Vector tạo dòng và vector biểu hiện – Vector tạo dòng: chuyển và lưu trữ gen tái tổ hợp trong tế bào chủ, nhân bản, thao tác, phân tích sau đó trên DNA tái tổ hợp sẽ dễ dàng hơn – Vector biểu hiện: tạo sản phẩm của gen tái tổ hợp ở mức phiên mã, dịch mã, phân tích trình tự điều hòa sự biểu hiện của gene. 3/24/2016 25 Nguyễn Hữu Trí Vector 3/24/2016 26 Nguyễn Hữu Trí 13
4. Sự khác nhau của các vector tạo dòng • Loại tế bào mà chúng có thể vào • Cách thức mà chúng xâm nhập (bằng biến nạp hay bằng cách xâm nhiểm của virus/phage) • Độ lớn của đoạn DNA ngoại lai mà chúng có thể mang • Vị trí cắt giới hạn chính xác của enzyme cắt giới hạn • Sự ổn định của DNA khi được chèn vào • Những khía cạnh quan tâm – Hiệu quả tạo dòng – Số lượng bản sao (trên một tế bào chủ) – Khả năng tầm soát (ví dụ hệ thống Lac Z) 3/24/2016 27 Nguyễn Hữu Trí Plasmid là các vector tạo dòng • Vị trí cắt hạn chế duy nhất để chèn DNA mục tiêu (vùng polylinker), có thể nằm cắt ngang gen lacZ mã hóa cho Beta- galactosidase, một enzyme chuyển khuẩn lạc thành màu xanh khi hiện diện X-gal (khuẩn lạc chuyển thành màu tráng khi có một đoạn DNA ngoại lai chèn thành công vào vùng polylinker và làm bất hoạt gen lacZ ) • Có promoter mạnh nằm ở hai phía của vùng polylinker để biểu hiện DNA được tạo dòng. • Một oriC • Marker chọn lọc (Ví dụ. Gen kháng kháng sinh) nếu không có biến nạp vi khuẩn sẽ chết (chắc chắn rằng chỉ có những vi khuẩn được biến nạp thành công mới sống) 3/24/2016 28 Nguyễn Hữu Trí 14
5. Plasmid – Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2-5kb) dạng chuỗi xoắn kép, dạng vòng, có thể tự nhân đôi độc lập với DNA bộ gen – Có số bản copy cao trong tế bào E. coli (100) – Gen khác kháng sinh (marker chọn lọc, VD. AmpR; có nghĩa là E. coli có khả năng kháng khi biến nạp thành công nhận được plasmid) – Tạo dòng tốt với đoạn DNA 5-10 kb (nhỏ) – Rất dễ sử dụng 3/24/2016 29 Nguyễn Hữu Trí Các loại plasmid • Plasmid thế hệ thứ nhất: tìm thấy trong tự nhiên (ColE1, pSC101 ) • Plasmid thế hệ thứ hai: plasmid nhân tạo (pBR322: kích thước 4364 bp, mang hai gen ApR, TetR và 20 vị trí nhận biết duy nhất của các enzyme cắt giới hạn) • Plasmid thế hệ thứ ba: đây là các plasmid mạnh hiện nay có hai đặc tính cơ bản – Kích thước nhỏ – Có mang một polylinker 3/24/2016 30 Nguyễn Hữu Trí 15
6. Vector tạo dòng là phage + Bacteriophage vector + Được thiết kế để đi vào chu trình tan + Có khả năng sinh sôi nhanh, hiệu quả xâm nhiễm cao hơn hẳn plasmid + Tạo dòng tốt với những đoạn DNA lớn hơn nhiều so với plasmid (5-20 kb) + Phage không dễ thao tác như plasmid + Phage  được loại bỏ 1/3 bộ gen chỉ giữ lại vùng chứa gen xâm nhập, tự sao và lắp ghép + DNA ngoại lai được đưa vào tế bào chủ qua phage này, nhân bản và lưu trữ cùng với phage + Vector phage  chứa ít trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn + Thực khuẩn thể M13 + Bộ gen mạch đơn có kích thước 6,4 kb + Ưu điểm của vector này là tạo được một số lượng lớn DNA mạch đơn + Thường dùng để giải trình tự DNA 3/24/2016 31 Nguyễn Hữu Trí Vector tạo dòng là phage 3/24/2016 32 Nguyễn Hữu Trí 16
7. Vector tạo dòng là phage 3/24/2016 33 Nguyễn Hữu Trí Vector tạo dòng là phagemid – Kết hợp giữa bacteriophage và plasmid – Tạo ra, đóng gói ssDNA với sự trợ giúp của phage – Hoặc có thể biến nạp vào E. coli khi nó thể hiện giống một plasmid (kích thước hạn chế giống một plasmid) – Ví dụ. pBluescript (pBS) – Có promoter phage T3 và T7 trên mỗi hướng cho việc tổng hợp ssRNA in vitro. 3/24/2016 34 Nguyễn Hữu Trí 17
8. Vector tạo dòng là Phagemid 3/24/2016 35 Nguyễn Hữu Trí Vector tạo dòng là Cosmid – Thiết kế nhân tạo bởi sự kết hợp được ưu điểm plasmid DNA và trình tự cos từ phage  – Khi vào trong tế bào chủ, có khả năng sao chép như plasmid. Plasmid tái tổ hợp bền hơn trong tế bào chủ –Rất tốt để tạo dòng những đoạn gen rất lớn DNA (35-45 kb). Hiệu suất chuyển gen cao hơn – Plasmids càng lớn thì càng khó thao tác 3/24/2016 36 Nguyễn Hữu Trí 18
9. Vector tạo dòng là Cosmid 3/24/2016 37 Nguyễn Hữu Trí Vector tạo dòng là BAC • BAC (Bacterial artificial chromosome – NST nhân tạo vi khuẩn) – Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn – Dùng để tạo dòng những đoạn DNA rất lớn vào E. coli (tốt và ổn định – sử dụng trong tạo dòng HGP) – Có chứa ORI của nhân tố f; sử dụng giống plasmid. – BAC có thể mang đoạn DNA với kích thước từ 75-300 kb. 3/24/2016 38 Nguyễn Hữu Trí 19
10. Eukaryotic vector – Ti plasmid của Agrobacterium tumefaciens dùng để tạo dòng ở thực vật. Kích thước từ 180 – 205 kb, có thể mang đoạn DNA kích thước khá lớn, lên đến khoảng từ 30 - 150 kb. – YAC (Yeast artificial chromosome – NST nhân tạo nấm men) Kích thước 10kb mang được DNA 100 – 1000kb. Sao chép như một nhiễm sắc thể bình thường của nấm men. Dùng để tạo bản đồ vật lý bộ gen ví dụ bộ gen người (nhưng không bền như BAC). – MAC (mammalian artificial chromosome – NST nhân tạo động vật hữu nhũ): gồm có tâm động, telomere và ORI của động vật hữu nhũ, mang được đoạn gene từ 10 kb đến nhỏ hơn 1000kb. 3/24/2016 39 Nguyễn Hữu Trí Vector tạo dòng 3/24/2016 40 Nguyễn Hữu Trí 20
11. Ưu điểm của Prokaryote 1. Phát triển nhanh 2. Thao tác dễ dàng Nhược điểm của Prokaryote 1. Không thể tách các intron ra 2. Intron cần thiết cho sự biểu hiện của gen 3. Kích thước DNA đưa vào vi khuẩn bị hạn chế 4. Prokaryote không có cơ chế glycosyl hóa protein 3/24/2016 41 Nguyễn Hữu Trí Tế bào chủ - E. coli: + Tế bào chủ phổ biến nhất, dễ nuôi, sinh sản nhanh + Vi sinh vật gây bệnh cơ hội + Không tiết enzyme - Bacillus subtilis: + Không gây bệnh, không tạo nội độc tố, tiết protein + Pasmid không ổn định trong tế bào chủ. - Saccharomyces cerevisiae: + Tế bào eukaryote được nghiên cứu di truyền kỹ nhất + Sử dụng để thể hiện gene eukaryote. 3/24/2016 42 Nguyễn Hữu Trí 21
12. Cải tiến tế bào chủ E. coli • Thông thường E. coli dùng để tạo dòng thường được cải tiến: – Loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế bằng cách gây đột biến trong hệ thống sửa đổi hạn chế nội sinh – Hệ thống tái tổ hợp DNA được sửa đổi để ngăn chặn sự tái tổ hợp – Thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lượng plasmid tích lũy trong tế bào 3/24/2016 43 Nguyễn Hữu Trí Các bước tạo dòng Tế bào chứa Vi khuẩn gene mục tiêu 1 Gene được chèn vào plasmid Nhiễm sắc thể Plasmid vi khuẩn Gene mục tiêu DNA tái tổ hợp DNA (plasmid) nhiễm sắc thể 2 Plasmid được đưa vào tế bào vi khuẩn Vi khuẩn tái tổ hợp 22
13. Vi khuẩn tái tổ hợp 3 Tế bào chủ được nuôi để hình thành một dòng tế bào có chứa gene mục tiêu đã được tạo dòng. Gene mục tiêu Protein được biểu hiện bởi gene mục tiêu Nhiều bản sao của gene Thu nhận protein 4 Nghiên cứu cơ bản Nghiên cứu và rất nhiều ứng dụng Nghiên cứu cơ bản về gene cơ bản về protein Gene kháng sâu Gene được dùng để Protein làm tan cục Hormone tăng trưởng bệnh được đưa tạo vi khuẩn tẩy máu động trong liệu điều trị chống còi cọc vào thực vật sạch chất thải độc pháp chống đau tim Tạo dòng một gene từ Eukaryotic vào một plasmid • Trong tạo dòng gene, plasmid được gọi là vector tạo dòng. • Một vector tạo dòng là một phân tử DNAcó thể mang DNA ngoại lai vào một tế bào chủ và nhân lên độc lập với DNA tế bào chủ. 23
14. Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp • Các bước để tạo dòng gene β-globin từ chim ruồi (hummingbird) vào một plasmid vi khuẩn. Kỹ thuật Tế bào chim ruồi Tế bào vi khuẩn lacZ gene Restriction Đầu dính Gene mục tiêu site ampR gene Plasmid Các mảnh DNA vi khuẩn của chim ruồi Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp Tế bào chim ruồi Tế bào vi khuẩn lacZ gene Restriction Đầu dính Gene mục tiêu site ampR gene Plasmid Các mảnh DNA vi khuẩn của chim ruồi Plasmid không taí tổ hợp Các plasmid tái tổ hợp 24
15. Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp Tế bào chim ruồi Tế bào vi khuẩn lacZ gene Restriction Đầu dính Gene mục tiêu site ampR gene Plasmid Các mảnh DNA vi khuẩn của chim ruồi Plasmid không taí tổ hợp Các plasmid tái tổ hợp Vi khuẩn mang plasmid Kỹ thuật Tế bào chim ruồi Tế bào vi khuẩn lacZ gene Restriction Đầu dính Gene mục tiêu site ampR gene Plasmid Các mảnh DNA vi khuẩn của chim ruồi Plasmid không taí tổ hợp Các plasmid tái tổ hợp Tạo dòng tế bào mang Vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp plasmid Kết quả Khuẩn lạc mang plasmid Khuẩn lạc mang plasmid không tái tổ hợp với gene tái tổ hợp với gene lacZ còn nguyên. lacZ bị bất hoạt Các tế bào cùng dòng 25
16. Tái tạo dòng (subcloning) • Tái tạo dòng là kiểu đơn giản nhất của thí nghiệm tạo dòng, là quá trình chuyển DNA đã được tạo dòng từ vector này sang vector khác để biểu hiện nó trong một chủng chủ nhất định. • Các bước cơ bản của tái tạo dòng cũng tương tự như tạo dòng 3/24/2016 51 Nguyễn Hữu Trí Thư viện DNA • Dựa vào bản chất của DNA cần tạo dòng người ta phân biệt hai loại thư viện gen: – thư viện bộ gen và thư viện cDNA 3/24/2016 52 Nguyễn Hữu Trí 26
17. Thư viện bộ gen (Genomic library) – Thư viện bộ gen được lập là tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen đầy đủ đã được gắn vào vector. Các vector tái tổ hợp sau đó được đưa vào tế bào chủ. Các tế bào chủ sau đó được nuôi cấy trên môi trường và tạo thành các dòng. Vector có thể là plasmid hoặc phage. – Thư viện bộ gen thường được lập cho prokaryote 3/24/2016 53 Nguyễn Hữu Trí Thư viện bộ gen (Genomic library) Toàn bộ genome được cắt bằng enzyme cắt giới hạn Hoặc Phage DNA pái tổ hợp Các dòng Các plasmid Các dòng vi khuẩn tái tổ hợp Phage (a) Thư viện Plasmid (b) Thư viện Phage 27
18. Thư viện bộ gen (Genomic library) Đoạn chèn lớn với Plasmid lớn nhiều gene mục tiêu • Bacterial artificial chromosome (BAC) Các dòng là một plasmid lớn đã BAC được biến đổi để có thể mang được đoạn DNA lớn. • BACs là một loại khác của vector được sử dụng trong xây dựng thư viện DNA. (c) Một thư viện các dòng bacterial artificial chromosome (BAC) Thư viện cDNA – Thư viện cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mRNA của một tế bào. Như vậy không giống với thư viện bộ gen, thư viện cDNA được thiết lập từ một tế bào xác định trong đó gen cần nghiên cứu phải biểu hiện thành mRNA – Thường được lập cho eukaryote – cDNA được tổng hợp từ mRNA trưởng thành (eukaryote) (Không có các đoạn intron) sử dụng enzyme Reverse transcriptase, RNase H , DNA Polymerase I, và nuclease S1. 3/24/2016 56 Nguyễn Hữu Trí 28
19. Tổng hợp cDNA DNA trong nhân mRNAs trong tế bào chất Tổng hợp cDNA DNA trong nhân mRNAs trong tế bào chất Reverse transcriptase Đuôi Poly-A mRNA DNA Primer 29
20. Tổng hợp cDNA DNA trong nhân mRNA trong tế bào chất Reverse transcriptase Đuôi Poly-A mRNA DNA Primer Phân cắt mRNA RNase H DNA trong nhân mRNA trong tế bào chất Reverse transcriptase Đuôi Poly-A mRNA DNA Primer Phân cắt mRNA RNase H DNA polymerase I 30
21. DNA trong nhân mRNA trong tế bào chất Reverse transcriptase Đuôi Poly-A Tổng hợp mRNA cDNA DNA Primer Phân cắt mRNA RNase H DNA polymerase I nuclease S1 cDNA Tuyển chọn dòng mục tiêu • Để có thể phân lập dòng tế bào chủ tái tổ hợp chứa gen mục tiêu trong một thư viện DNA hay một thư viện cDNA, người ta phải sử dụng các phương pháp sàng lọc. • Thông thường các phương pháp sàng lọc được xây dựng dựa trên việc sử dụng mẫu dò DNA. • Mẫu dò DNA (probe) là một đoạn oligonucleotide được đánh dấu và nó bổ sung hoặc bổ sung một phần với gen mục tiêu. 3/24/2016 62 Nguyễn Hữu Trí 31
22. Tuyển chọn dòng mục tiêu - Gen được biểu hiện trong tế bào chủ là vi khuẩn: +Lai miễn dịch (Western blotting, Immunoblotting) + Hoạt tính enzyme + Bổ trợ đột biến (gen ngoại lai đồng dạng với gen của tế bào chủ) - Gen ngoại lai không biểu hiện trong tế bào chủ: + Lai insitu: + Lai khuẩn lạc (colony hybridization): vector là plasmid + Lai plaque (plaque colonization): vector là phage 3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí 63 Tuyển chọn dòng mục tiêu • Một dòng mang gene mục tiêu có thể được xác định bằng cách dùng nucleic acid probe có trình tự bổ sung với gene. Gene mục tiêu 5 GGC TAAC TTAG C 3 Probe 3 C CG A TTG AATCG 5 (Được đánh dấu) • Quá trình này được gọi là lai nucleic acid. 32
23. Tuyển chọn dòng mục tiêu Phân tử Probe được đánh dấu phóng xạ Probe DNA Gene mục tiêu Đĩa nhiều giếng chứa các dòng DNA mạch đơn Film của thư viện từ tế bào • Màng nylon Màng nylon Vị trí của DNA với trình tự bổ sung Vector biểu hiện (expression vector) - Để biểu hiện gen ngoại lai: + Thu protein tái tổ hợp + Nghiên cứu các yếu tố điều hòa thể hiện của gen - Gen ngoại lai được kiểm soát bằng promoter được nhận diện bởi RNA polymerase của tế bào chủ: + Promoter mạnh + Khung dịch mã đúng + Promoter thường dùng: lac, trp (cơ chế tắt mở) 3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí 66 33
24. Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật di truyền - Sản xuất những sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật - Sản xuất vắcxin phòng chống virus - Sản xuất protein của động vật hữu nhũ - Tạo ra các thực vật, động vật chuyển gen - Phân lập và ứng dụng nguồn gen vi sinh trong xử lý môi trường - Tạo các thuốc điều hòa sự thể hiện của gen - Liệu pháp gen chữa trị các bệnh di truyền 3/24/2016 67 Nguyễn Hữu Trí 3/24/2016 68 Nguyễn Hữu Trí 34