Xác định và đánh giá sự tăng sinh vi khuẩn B. subtilis hu58 qua đường tiêu hóa

Nội dung text: Xác định và đánh giá sự tăng sinh vi khuẩn B. subtilis hu58 qua đường tiêu hóa

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ TĂNG SINH VI KHUẨN B. SUBTILIS HU58 QUA ĐƢỜNG TIÊU HÓA Hồ Anh Sơn*; Nguyễn Lĩnh Toàn* Nguyễn Thị Mai Phương**; Đào Chí Dũng*** TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm xác định và đánh giá khả năng tăng sinh bào tử B. subtilis HU58 qua đường tiêu hóa. Kết quả cho thấy trình tự các nucleotide của gen mã hóa ARNr 16s của vi khuẩn B. subtilis HU58 đ ng nhất t i 99 v i dữ liệu của Ngân hàng Gen. Số lượng bào tử B. subtilis HU58 tăng sinh cực đại ở thời điểm 7 giờ và giảm dần sau 7 ngày uống vi khuẩn. * Từ khóa: B. subtilis HU58; Synbiotic; Chuột nhắt. IDENTIFING AND EVALUATING THE PROLIFERATIVE ABILITY OF B. SUBTILIS HU58 VIA DISGESTIVE SYSTEM SUMMARY The research aimed to identify and evaluate the proliferative ability of B. subtilis HU58 via gastro-intestinal tract. The results showed that nucleotide sequence of the gene encoding for ARNr 16s of B. subtilis HU58 was identical up to 99% with the genbank reference. B. subtilis HU58 proliferated maximum at 7 hours and then decreased gradually after 7 days of oral administration. * Key words: B. subtilis HU58; Synbiotic; Mice. ĐẶT VẤN ĐỀ ra từ phối trộn giữa xylooligosaccharides (XOS) từ cám gạo v i bào tử của chủng Trên thế gi i, việc sử dụng thực phẩm chức năng có chứa vi khuẩn có lợi đang vi sinh vật sinh bào tử B. subtilis HU58. được quan tâm do khả năng làm tăng đáp Để có cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo ứng miễn dịch; tăng khả năng thực bào; và đưa sản phẩm ra thị trường, cần xác chống ung thư, chống ỉa chảy, dị ứng; định chính xác sự có mặt của bào từ và ngăn chặn hội chứng loãng xương; giảm khả năng sinh bào tử sau khi động vật chất béo trong huyết thanh và đường thực nghiệm uống chủng vi sinh vật này. trong máu. Sản phẩm này có tên synbiotic thuéc ®Ò tµi “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm synbiotic từ vi khuẩn sinh bào tử và cám gạo” (Mã số: KC04.TN01/11-15) được tạo * Học viện Quân y ** Viện Công nghệ Sinh học *** Viện Y học Cổ truyền Quân đội Người phản hồi (Corresponding): Hå Anh S¬n (hoanhson@yahoo.com) Ngày nhận bài: 12/01/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/03/2014 Ngày bài báo được đăng: 20/03/2014 37
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP mã hoá ARNr 16S. Cặp m i vạn năng NGHIÊN CỨU (universal primers) 27F và 1527R [8] sử 1. Đối tƣợng nghiên cứu. dụng cho xác định trình tự ARNr 16S của Chuột nhắt trắng do Ban Động vật, B. subtilis HU58 có trình tự như sau: Học viện Quân y cung cấp, không phân - 27f: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' biệt giống, khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí - 1527R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' nghiệm, cân nặng 20,0 2,0 g. Nuôi chuột Phản ứng PCR có thành phần g m: 6 l 0 trong điều kiện nhiệt độ 24 ± 2 C, ánh hỗn hợp DTCS Master mix, 1 l khuôn, sáng tự nhiên, nư c và thức ăn được nấu 1 l m i (8UA hoặc 1492R), H2O vô trùng chín, bảo đảm theo nhu cầu. Quá trình nuôi vừa đủ 20 l. Thực hiện phản ứng PCR bắt đầu trư c khi tiến hành thí nghiệm ít theo chu trình nhiệt: 96oC trong 1 phút để nhất 3 ngày. khởi động nóng, tiếp theo là 35 chu kỳ 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. g m 3 bư c: 96oC trong 30 giây để làm Tổng số g m 4 chuột, nuôi riêng từng biến tính ADN, 60oC trong 30 giây để gắn con. Cho mỗi chuột uống một liều duy m i và 60oC trong 4 phút để kéo dài 10 nhất, hòa tan 1 x 10 CFU vi khuẩn trong chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 60oC nư c cất. Lấy phân vào các thời điểm trong 7 phút và giữ ở 4oC cho đến khi khác nhau (tối đa sau 7 ngày). Trư c khi phân tích. thu thập phân, đáy hộp thu thập được trải * Đếm quần thể vi khuẩn trong phân: giấy trắng đã sấy vô khuẩn. Đưa chuột Cân 0,1 g phân pha v i 0,9 ml đệm vào từng hộp riêng lẻ. Thu thập, đánh số PBS, sau đó trộn (votex) kỹ để phân tan các mẫu phân riêng biệt của từng chuột. hoàn toàn và ủ trong tủ ấm ở 650 trong * Xác định trình tự gen mã hóa ARNr 1 giờ. Đếm quần thể vi khuẩn ngay trong 16s của vi khuẩn B.subtilis HU58: ngày. Xác định mật độ vi khuẩn bằng - Tách ADN tổng số: tách ADN tổng số phương pháp pha loãng và cấy trải trên từ các mẫu vi khuẩn trong phân theo đ a thạch chứa môi trường labo agar. phương mô tả của Sambrook và Rusell Ủ các đ a thạch sau khi cấy ở 37oC trong [9]. Xác định hàm lượng ADN bằng cách 48 giờ cho đến khi các khuẩn lạc hình đo độ hấp thụ ánh sáng ở bư c sóng 260 thành hoàn toàn. nm (A260). Kiểm tra các mẫu ADN bằng điện di trên gel agarose 1 , sau đó nhuộm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU bằng ethidium bromide, soi dư i đèn tử 1. Nh n ng vi hu n B. subtilis HU58 ngoại và chụp ảnh. trong phân. - Giải trình tự gen mã hoá ARNr 16S: Trong môi trường labo, các vi khuẩn B. để xác định một cách chính xác chủng B. subtilis HU58 có hình thái đặc trưng v i subtilis HU58 có mặt trong phân chuột, đặc điểm: khuẩn lạc khô, màu xám nhạt, sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen đoạn có nếp nhăn, mép l i lõm. 39
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 HU58. Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb. Giếng 2: ADN B. subtilis HU58. Kết quả phân tách ADN genome từ mẫu vi khuẩn và điện di trên gel agarose cho thấy hình ảnh một băng rõ nét v i kích thư c 10 kb, chứng tỏ chế phẩm ADN thu được có độ sạch cao. Mẫu ADN này được sử dụng cho nhân bản gen mã hóa ARNr 16S của B. subtilis HU58 bằng PCR. ình Hình ảnh khuẩn lạc B. subtilis HU58 trong môi trường labo. bp Các vi khuẩn có hình thái đặc trưng của B. subtilis HU58 phân lập từ phân chuột tiếp tục được nhận dạng chính xác bằng phương pháp đọc trình tự đoạn gene mã hoá ARNr 16S. Mẫu ADN sau khi đã tinh 2000 sạch từ các khuẩn lạc này được sử dụng để nhân bản đoạn gen ARNr 16S của B. subtilis HU58 bằng PCR. bp ình 2B Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR đoạn gen ARNr 16S của chủng vi khuẩn B. subtilis HU58. Giếng 1: Thang chuẩn ADN 10kb. Giếng 2: B. subtilis HU58. 300 Sản phẩm PCR sau khi điện di trên gel agarose 1% cho thấy đoạn ADN nhân bản có kích thư c khoảng 1,8 kb (theo tính toán lý thuyết là 1,7 kb) từ B. subtilis HU58. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 2000 mã hóa cho ARNr 16S của các chủng 1 2 S. subtilis HU58 v i trình tự tương ứng ình 2A Điện di trên gel agarose ADN được công bố trong Genebank (Accession genome của chủng vi khuẩn B. subtilis no. EF101709) bằng phần mềm Bioedit 300 cho thấy đoạn trình tự gen mã hóa ARNr 40
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 16S có tỷ lệ tương đ ng 99% v i đoạn ngân hàng gen khi sử dụng công cụ so gen tương ứng của B. subtilis HU58 trong sánh B AST của NCBI. 10 20 30 40 50 60 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS TCGAGCGGAC GATGGGAGCT TGCTCCCTGA TGTTAGCGGC GGACGGGTGA GTAACACGTG Bacillus subtilis HU58 ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... 70 80 90 100 110 120 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS GGTAACCTGC CTGTAAGACT GGGATAACTC CGGGAAACCG GGGCTAATAC CGGATGGTTG Bacillus subtilis HU58 ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... 130 140 150 160 170 180 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS TTTGAACCGC ATGGTTCAAA CATAAAAGGT GGCTTCGGCT ACCACTTACA GATGGACCCG Bacillus subtilis HU58 ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... 190 200 210 220 230 240 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS CGGCGCATTA GCTAGTTGGT GAGGTAACGG CTCACCAAGG CAACGATGCG TAGCCGACCT Bacillus subtilis HU58 ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... 250 260 270 280 290 300 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS GAGAGGGTGA TCGGCCACAC TGGGACTGAG ACACGGCCCA GACTCCTACG GGAGGCAGCA Bacillus subtilis HU58 ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... 310 320 330 340 350 360 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS GTAGGGAATC TTCCGCAATG GACGAAAGTC TGACGGAGCA ACGCCGCGTG AGTGATGAAG Bacillus subtilis HU58 ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... 370 380 390 400 410 420 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS GTTTTCGGAT CGTAAAGCTC TGTTGTTAGG GAAGAACAAG TACCGTTCGA ATAGGGCGGT Bacillus subtilis HU58 ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... 430 440 450 460 470 480 41
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS ACCTTGACGG TACCTAACCA GAAAGCCACG GCTAACTACG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA Bacillus subtilis HU58 ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... 490 500 510 520 530 540 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS CGTAGGTGGC AAGCGTTGTC CGGAATTATT GGGCGTAAAG GGCTCGCAGG CGGTTTCTTA Bacillus subtilis HU58 ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... ......................... 550 560 570 580 590 600 . ....| . ....| .....| ....| ......| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS AGTCTGATGT GAAAGCCCCC GGCTCAACCG GGGAGGGTCA TTGTGGGGAA CTTGAGTGCA Bacillus subtilis HU58 ......................... . ........................ ......................... ......................... ...GAAACTG GGGA.C.TG. 610 620 630 640 650 660 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS GAAGAGGAGA GTGGAATTCC ACGTGTAGCG GTGAAATGCG TAGAGATGTG GAGGAACACC Bacillus subtilis HU58 .TGC..A.... .GA..G.GGA TTCCAC.T. TA.CGG..AA AT.C.TA.A. AT.TGGAGGA 670 680 690 700 710 720 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| ......| ....| BS AGTGGCGAAG GCGACTCTCT GGTCTGTAAC TGACGCTGAG GAGCGAAAGC GTGGGGAGCG Bacillus subtilis HU58 .CACCA.TG. CGA.GG.GAC TC....GTCT GT.ACTGAC. CT.A.G.GCG AAA.C.T.G. 730 740 750 760 770 780 . ....| . ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| .....| ....| ......| ....| BS AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC CGTAAACGAT GAGTGCTAAG TGTTAGGGGG Bacillus subtilis HU58 G.GC.A.CAG ...TAGA.AC CCTGGT.GT. .ACGCCGT.A AC.ATGAGT. CTAAGT.TTA ình So sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S của chủng B. subtilis trong phân chuột (BS) và B. subtilis HU58 trong Ngân hàng Gen. Như vậy, có thể kết luận các mẫu đếm vi khuẩn có hình thái giống B. subtilis HU58 từ phân chuột chính xác là vi khuẩn này. 42
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 2. Đánh giá h n ng t ng ố ƣợng Sau khi đưa vi khuẩn dạng bào tử vào u n th vi hu n B. subtilis HU58 trong cơ thể chuột qua đường uống, số lượng u t. quần thể vi khuẩn tăng lên mức 1,7 x 1010 Để kiểm tra sự t n tại và nhân lên của CFU g, cao hơn cả lượng bào tử đưa vào bào tử B. subtilis HU58 trong ruột kết, cho ban đầu. Kết quả thu được cho thấy số chuột uống một liều duy nhất bào tử có lượng bào tử duy trì ở mức độ cao trong mật độ 1 x 1010 CFU, ở những khoảng khoảng 48 giờ và bắt đầu giảm dần theo thời gian thích hợp, đếm số lượng bào tử thời gian. Sau 7 ngày, số lượng bào tử đã giảm xuống. có trong 1 g phân chuột bằng cách xử lý nhiệt mẫu phân, sau đó tiến hành đếm BÀN LUẬN khuẩn lạc có hình thái đặc trưng của B. Chúng tôi đã xác định chính xác sự có subtilis HU58 trên đ a thạch. Bằng việc mặt của bào tử B. subtilis HU58 bằng xử lý nhiệt mẫu nghiên cứu ở 65oC trong quan sát hình thái đặc trưng c ng như 30 phút và cấy trải trên môi trường labo giải trình tự gen mã hóa cho ARNr 16S và môi trường tạo bào tử DSM (Difco), của vi khuẩn này, sau đó đối chiếu v i dữ số lượng khuẩn lạc không phải B. subtilis liệu trong Ngân hàng Gen. Kết quả: 99 (khuẩn lạc nhiễu) đã giảm rõ rệt, do đó, tương đ ng. Số lượng bào tử thải qua bư c đếm bào tử trở nên thuận lợi hơn phân chuột cao hơn số lượng được đưa vào, có thể do bào tử đã nảy mầm trong nhiều. ruột, sau đó phát triển và lại tái tạo bào tử. Nếu ruột động vật không phải là môi 2.5x1010 trường phù hợp, bào tử sau khi đưa vào s bị thải ra theo đường phân và những bào tử đã nảy mầm s chết trong ruột. 2.0x1010 Mức độ thay đổi l n về số lượng hình thành bào tử và bào tử có mặt trong tất Gi i hạn phát hiện cả các mẫu phân chuột thí nghiệm cho 1.5x1010 thấy ruột là môi trường thích hợp để chúng cư trú 2, 3, 4 . Nghiên cứu của 0 7 24 31 48 72 168 1.0x1010 Collins và CS trư c đây c ng chứng minh Sè l•îng bµo tö vi khuÈn (CFU/1gph©n) khuÈn vi tö bµo Sè l•îng B. subtilis có thể sinh trưởng, phát triển Thêi gian và tạo bào tử trong điều kiện yếm khí của ruột già 1, 5, 6, 7 . Theo Hoa vµ CS 4 , 5.0x109 ình 4 Số lượng bào tử vi khuẩn B. bào tử sau khi nảy mầm s thể hiện chức subtilis HU58 thay đổi theo thời gian. năng probiotic tương tự như các probiotic 1.0x105 dạng vi khuẩn khác. Như vậy, bào tử vi 42
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 khuẩn B. subtilis HU58 đã nảy mầm, phát intestines. J Nagoya City Med Assoc 1980, 30, triển và hình thành bào tử trong đại tràng pp.456-469. của chuột trư c khi được thải ra ngoài 4. Hoa TT, Duc LH, Isticato R, Baccigalupi môi trường qua phân. Cơ sở của nhận L, Ricca E., Van P.H. and Cutting, S.M. The định này: 1) Tổng số bào tử được thải ra fate and dissemination of Bacillus subtilis spores l n hơn lượng đưa vào; 2) ượng bào tử in a murine model. Appl Environ Microbiol. giảm dần theo thời gian; 3) Nếu đây là kết 2001, 67, pp.3819-3823. quả của sai số thí nghiệm ở mỗi bư c 5. Irina B. Sorokulova, Iryna V. Pinchuk, thực hiện, số lượng bào tử phải giảm một Muriel Denayrolles, Irina G. Osipova, Jen M. Huang, Simon M. Cutting, Maria C. Urdaci. cách nhanh chóng và đột ngột. The safety of two Bacillus probiotic strains KẾT LUẬN for human use. Dig Dis Sci 2008, 53, pp.954-963. Qua nghiên cứu xác định và đánh giá khả năng tăng sinh bào tử B. subtilis HU58 6. Le H. D, Huynh A. H, Barbosa T.M, qua đường tiêu hóa, chúng tôi rút ra một Henriques A.O, and Cutting S.M. Characterization số kết luận sau: of Bacillus probiotics available for human use. Appl Environ Microbiol. 2004, 70 (4), pp.2161-2171. - Đã xác định chính xác sự có mặt của bào tử B. subtilis HU58 bằng giải trình tự 7. Nguyen K. M. T, Nguyen Q. U, Huynh A. đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S của vi H, Le H. D, Tran T. H, Claudia R. S, Adriano khuẩn và so sánh v i Ngân hàng Gen. O. H and Cutting S.M. The Intestinal life cycle of Bacillus subtilis and close relatives. J Bacteriol - Bào tử vi khuẩn B. subtilis HU58 đã 2006, 188 (7), pp.2692-2700. nảy mầm, phát triển và hình thành bào tử trong đường tiêu hóa của chuột trư c khi 8. Rainey F. A, Ward-Rainey N, Kroppenstedt được thải ra ngoài môi trường qua phân. R. M & Stackebrandt E. The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage: proposal TÀI LIỆU THAM KHẢO of Nocardiopsiaceae fam. nov. Int J Syst Bacteriol. 1996, 46, pp.1088-1092. 1. Collins M.D, Gibson G.R. Probiotics, 9. Sambrook J, Russell D.W. Molecular prebiotics and synbiotics: approaches for cloning: A laboratory manual (3rd ed.). Cold modulating the microbial ecology of the gut. Spring Harbor Laboratory Press. 2001. Am J Clin Nutr. 1999; 69 (5), pp.1052S-1057S. 2. Gabriella C. and Cutting S. Bacillus probiotic: Spore germination in the gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol. 2002, 68 (5), pp.2344-2352. 3. Hisanga S. Studies on the germination of genus Bacillus spores in rabbit and canine 43
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 44