Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của interleukine - 12 người tái tổ hợp trên mô hình chuột mang khối ung thư phổi

Nội dung text: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của interleukine - 12 người tái tổ hợp trên mô hình chuột mang khối ung thư phổi

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ CỦA INTERLEUKINE-12 NGƢỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT MANG KHỐI UNG THƢ PHỔI Ngô Thu Hằng*; Nguyễn Thái Biềng*; Nguyễn Thị Thịnh** Lương Cao Đồng***; Hồ Anh Sơn*; Nguyễn Lĩnh Toàn* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá tác dụng kháng ung thư của interleukin-12 (IL-12) tái tổ hợp trên mô hình chuột mang ung thư phổi (UTP). Đối tượng và phương pháp: ghép tế bào (TB) UTP chuột Lewis vào dưới da đùi phải 19 chuột nhắt trắng BALB/c, khi khối u phát triển với kích thước khoảng 7 - 10 mm đường kính, chia chuột ngẫu nhiên thành 3 nhóm: nhóm chứng không điều trị và 2 nhóm được điều trị với đơn liều protein IL-12 tái tổ hợp (0,1 và 0,6 µg/chuột). Kết quả: 19/19 chuột hình thành khối u sau 1 tuần ghép 106TB ung thư với tỷ lệ thành công 100%. Sau 5 tuần theo dõi, tỷ lệ chuột sống của nhóm chuột điều trị protein IL-12 là 10/12 (83,33%), chuột thoái lui u 9/12 (75%), chuột sống và thoái lui u của nhóm không điều trị 3/7 (42,86%). 2/12 (16,67%) chuột chết của nhóm điều trị, 4/7 (57,14%) chuột chết của nhóm không điều trị. Kết luận: IL-12 tái tổ hợp có tác dụng kháng ung thư trên mô hình chuột mang khối UTP. * Từ khóa: Tế bào ung thư phổi; Chuột Lewis; Chuột nhắt BALB/c; Protein IL-12 tái tổ hợp. Study on Anti-Cancer Effect of Human Recombinant Interleukin-12 Protein in Lung Cancer Mouse Model Summary Objectives: To evaluate the anti-cancer effect of human recombinant interleukin-12 (IL-12) protein in lung cancer mouse model. Subjects and methods: Mouse Lewis lung cancer cells were inoculated subcutaneously in the right thighs of 19 BALB/c mice; when the tumors grew up to a size of 7 - 10 mm in diameter, mice were randomly divided into 3 groups: control group and 2 experimental groups, which received a single doses of recombinant IL-12 protein, 0.1 và 0.6 µg/mouse, respectively. Results: 19/19 mice developed tumors after 1 week inoculation 106 tumor cells per mouse, the successful rate reached 100%. After 5 weeks of experiment, number of surviving mice and having tumor regression in IL-12 treated groups were 10/12 (83.33%) and 9/12 (75%), respectively; the number of mice alive with regression tumors in control group was 3/7 (42.86%). The number of dead mice in recombinant IL-12 protein treated groups was 2/12 (16.67%); the number of dead mice in control group was 4/7 (57.14%). Conclusion: recombinant IL-12 protein has anti-cancer effect in mouse model of lung cancer. * Key words: Lung cancer cells; Lewis mouse; BALB/c mouse; Recombinant interleukin-12 protein. * Học viện Quân y ** Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông *** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhsonhp@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/08/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 30/11/2015 65
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ - Protein tái tổ hợp IL-12 người là sản phẩm của đề tài cấp Nhà nước mã số Ung thư phổi là loại ung thư biến nhất KC04.11/11-15. trên toàn cầu, số ca mắc mới mỗi năm tăng trung bình 0,5%. Ở Việt Nam, tỷ lệ - Động vật nghiên cứu được nuôi trong bệnh nhân (BN) mắc UTP đang có xu điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày hướng gia tăng, mỗi năm cả nước có hơn trước khi tiến hành ghép TB, đảm bảo 20.000 BN mới và có tới 17.000 trường thức ăn và nước uống theo nhu cầu. hợp tử vong. UTP là nguyên nhân gây tử * Dụng cụ, thiết bị, hóa chất nghiên cứu: vong hàng đầu trong số các BN ung thư - Môi trường nuôi cấy TB ung thư EMEM [8]. Mặc dù có nhiều phương pháp điều trị UTP, nhưng hiệu quả chưa cao [9]. Theo (eagle's minimal essential medium), FBS báo cáo thống kê ở Mỹ, tỷ lệ UTP sống (fetal bovine serum) 10%; dung dịch được 5 năm chỉ chiếm 15%. Ở châu Âu, penicillin và streptomycin 1%; trypsin-EDTA tỷ lệ này khoảng 10%, con số này cũng (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, CHLB Đức). được ghi nhận ở các quốc gia đang phát - Vật tư cần thiết phục vụ cho nuôi cấy triển là 8,9% [8]. Để góp phần nghiên cứu TB: chai nuôi, plate 96 giếng, pipet, chai tác dụng chống UTP và đáp ứng yêu cầu đựng môi trường, lọc vi khuẩn (ATCC, phục vụ nghiên cứu tiền lâm sàng UTP, Hoa Kỳ). chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhằm: - Hệ thống phòng thí nghiệm phục vụ Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của nuôi cấy TB: phòng sạch, tủ ấm CO , kính IL-12 người tái tổ hợp trên mô hình chuột 2 hiển vi soi ngược, máy ly tâm, tủ mát 40C, mang khối UTP (protein IL-12 tái tổ hợp 0 0 là sản phẩm của đề tài cấp Nhà nước tủ âm -20 C, -80 C, bình chứa nitơ lỏng KC04.11/11-15. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Kỹ thuật nuôi cấy TB UTP chuột Lewis: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nuôi cấy TB UTP chuột Lewis trong 1. Đối tƣợng, vật liệu, chất liệu nghiên môi trường EMEM, bổ sung FBS 10%, cứu. penicillin và streptomycin 1%. TB được * Đối tượng, vật liệu nghiên cứu: nuôi cấy tăng sinh ở điều kiện nhiệt độ o - TB UTP chuột Lewis (mã LLc1/LL/2; 37 C, CO2 5%, thay môi trường 2 lần/tuần. ATCC, Hoa Kỳ). Mỗi chai nuôi cấy có diện tích 75 cm2. - Chuột nhắt trắng BALB/c 8 - 10 tuần Khi TB phát triển đạt 80% diện tích chai tuổi, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm (Charles nuôi, tiến hành cấy chuyển sang chai nuôi River Laboratories, Hoa Kỳ). cấy mới với tỷ lệ 1:3. 66
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Thu hoạch TB ung thư nuôi cấy trong - Nhóm IL-12t: chuột mang u được chai nuôi bằng Trypsin EDTA, sau đó ly điều trị bằng protein IL-12 tái tổ hợp liều tâm để loại bỏ môi trường thu TB. Xác 0,1 µg/con, liều duy nhất. định mật độ TB trong môi trường bằng - Nhóm IL-12c: chuột mang u được cách sử dụng buồng đếm Neubauer và điều trị bằng protein IL-12 tái tổ hợp liều kính hiển vi quang học. Chuẩn nồng độ 0,6 µg/con, liều duy nhất. TB về 107TB/ml. Theo dõi, đánh giá sự phát triển, ghi * Tạo khối UTP chuột trên chuột nhắt nhận thay đổi trọng lượng, kích thước trắng BALB/c: khối u, tỷ lệ thoái u (khối u không quan Dung dịch TB ung thư đã chuẩn bị sát được bằng mắt thường), thời gian được hút vào bơm tiêm 1 ml với số chuột chết ở các nhóm. lượng 107 TB/ml. Cố định chuột và tiêm * Xử lý số liệu: xử lý thống kê sử dụng 0,1 ml dưới da đùi phải (106TB/chuột). phần mềm SPSS 15.0. Cạo sạch lông chuột vùng đùi phải trong suốt quá trình thí nghiệm. Theo dõi toàn KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU trạng, cân nặng, sự xuất hiện, tiến triển 1. Tình trạng toàn thân chuột trong và thoái triển của khối u tại vị trí tiêm quá trình thí nghiệm. (đùi phải) 2 lần/tuần bằng quan sát và Sau khi tiêm TB UTP chuột Lewis, đo kích thước khối u bằng thước chính chuột thí nghiệm vẫn ăn uống, hoạt động xác NSK. bình thường, nhanh nhẹn, lông mượt, Tính thể tích khối u theo công thức: mắt trong, hậu môn khô, không thấy biểu V = (D x R2) x 0,5 hiện đi lỏng. Chuột tăng cân so với trước Trong đó: khi thí nghiệm. Nhóm chứng có 4 chuột chết (vào ngày 28, 32, 35 sau khi tiêm + V: thể tích khối u (mm3). TB); nhóm IL-12t có 1 chuột bị chết (vào + D: chiều dài của khối u (mm). ngày thứ 35 sau tiêm TB); nhóm IL-12c + R: chiều rộng của khối u (mm). có 1 chuột chết (vào ngày 25 sau khi * Đánh giá tác dụng kháng ung thư của tiêm TB). IL-12 trên mô hình chuột mang khối UTP: Sau 35 ngày thí nghiệm, tỷ lệ chuột Khi khối u phát triển với kích thước sống ở nhóm điều trị: 10/12 con (83,33%); khoảng 7 - 10 mm đường kính, chia ngẫu ở nhóm không điều trị 3/7 con (42,86%). nhiên chuột thành 3 nhóm: Tỷ lệ chuột sống đạt 68,42% chung - Nhóm chứng: chuột mang u không cho cả nhóm chuột điều trị và không điều trị. điều trị. 67
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 2. Diễn biến trọng lƣợng cơ thể ở chuột nghiên cứu. Bảng 1: Trọng lượng cơ thể chuột nghiên cứu (g). Ngày Thông N1 N8 N15 N21 N28 N35 Nhóm số n 7 7 7 7 7 3 Nhóm chứng (1) 21,27 ± 22,99 ± 25,03 ± 26,76 ± 25,82 ± 21,93 ± X ± SD 3,29 4,02 3,63 4,41 4,81 1,50 n 6 6 6 6 6 5 Nhóm IL -12t (2) 21,45 ± 23,50 ± 23,75 ± 24,87 ± 26,47 ± 26,82 ± X ± SD 3,49 4,19 4,09 3,01 3,95 2,18 n 6 6 6 6 5 5 Nhóm IL -12-c (3) 21,78 ± 22,50 ± 24,25 ± 25,73 ± 24,42 ± 24,82 ± X ± SD 0,88 1,57 1,33 2,08 0,36 0,79 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 < 0,05 p p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 Sau ghép TB UTP chuột Lewis, trọng lượng cơ thể chuột 3 nhóm đều tăng so với trước thí nghiệm. Ở nhóm IL-12c, trọng lượng trung bình của ngày 28 giảm do 01 con có u to chết. Nhóm chứng, từ ngày 28 - 35, 4 chuột chết vì u to nên trọng lượng trung bình của chuột giảm. Thời điểm ngày thứ 35, trọng lượng chuột ở nhóm IL-12t và nhóm chứng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05); các thời điểm khác trọng lượng trung bình chuột ở các nhóm khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). 3. Số lƣợng chuột thoái u tại các thời điểm. Bảng 2: Tỷ lệ chuột thoái u của các nhóm. Ngày N8 N11 N15 N21 N28 N35 Nhóm n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) 0/7 0/7 2/7 2/7 2/7 3/7 Nhóm chứng (1) (0) (0) (28,57) (28,57) (28,57) (42,86) 0/6 1/6 2/6 2/6 3/6 4/6 Nhóm IL-12t (2) (0) (16,67) (33,33) (33,33) (50) (66,67) 0/6 0/6 2/6 3/6 4/6 5/6 Nhóm IL-12c (3) (0) (0) (33,33) (50) (66,67) (83,33) p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 Chuột bắt đầu thoái u từ ngày 11 sau khi tiêm IL-12 tái tổ hợp. Tỷ lệ thoái lui khối u của nhóm chứng có xu hướng chậm hơn so với hai nhóm điều trị bằng IL-12 tái tổ hợp tại các thời điểm nghiên cứu. Số lượng chuột thoái u tại nhóm điều trị đều cao hơn nhóm chứng tại các thời điểm từ ngày 11 đến ngày 35 tính từ khi tiêm IL-12 tái tổ hợp, nhưng khác biệt này chưa có ý nghĩa thống kê. 68
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 4. Kết quả thể tích trung bình khối u ở chuột nghiên cứu. 3 Bảng 3: Thể tích trung bình khối u (mm ). Ngày Thông N1 N4 N8 N11 N15 N18 Nhóm số n 7 7 7 7 6 6 Nhóm chứng 587,62 ± 1059,75 ± 1789,58 ± 1506,07 ± 2808,95 4063,50 ± (1) X ± SD 371,34 480,11 1155,55 1086,53 ± 1187,88 2338,34 n 6 6 6 5 4 4 Nhóm IL-12t 436,17 ± 881,25 ± 1231,73 ± 1391,31 ± 1617,16 ± 1143,73 ± (2) X ± SD 145,58 650,73 906,54 1184,25 302,24 903,49 n 6 6 6 6 4 4 Nhóm IL-12c 437,58 ± 1178,80 ± 1322,77 ± 857,75 ± 928,06 ± 789,80 ± (3) X ± SD 156,47 480,38 667,44 688,22 1145,02 1025,91 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 < 0,05 p p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 < 0,05 p 3,1 < 0,05 Thể tích trung bình khối u ở cả 3 nhóm chuột tăng dần sau khi ghép TB ung thư vào chuột. Thể tích nhóm chuột IL-12c dao động nhẹ từ ngày 11 đến 18 do hiện tượng thoái u. Thể tích khối u ở nhóm chứng (chuột mang u không điều trị) lớn hơn có ý nghĩa thống kê so với thể tích khối u hai nhóm chuột điều trị (tại các thời điểm ngày thứ 15 và 18; p < 0,05). 5. Diễn biến số lƣợng chuột chết tại các thời điểm. Bảng 4: Tỷ lệ chuột chết của các nhóm. Ngày N21 N25 N28 N32 N35 Nhóm n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) 0/7 0/7 2/7 3/7 4/7 Nhóm chứng (1) (0) (0) (28,57) (42,86) (57,14) 0/6 0/6 0/6 0/6 1/6 Nhóm IL-12t (2) (0) (0) (0) (0) (16,67) 0/6 1/6 1/6 1/6 1/6 Nhóm IL-12c (3) (0) (16,67) (16,67) (16,67) (16,67) p2,1 > 0,05 p2,1 > 0,05 p2,1 > 0,05 p p3,1 > 0,05 p3,1 > 0,05 p3,1 > 0,05 p3,1 > 0,05 Chuột đầu tiên chết ở nhóm 3 vào ngày 25 sau khi tiêm IL-2 tái tổ hợp, sau đó số lượng chuột chết tăng dần theo thời gian ở 2 nhóm còn lại. Số lượng và tỷ lệ chuột chết của nhóm chứng cao hơn so với hai nhóm điều trị bằng protein IL-12 tái tổ hợp tại các thời điểm ngày 28, 32, 35, sự khác biệt này chưa có ý nghĩa thống kê. 69
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 BÀN LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng 1. Nguyễn Lĩnh Toàn, Hồ Anh Sơn, Bùi ung thư của IL-12 tái tổ hợp trên mô hình Khắc Cường. Xây dựng mô hình UTP người, chuột mang khối UTP cho thấy IL-12 tái Tạp chí Y - Dược học quân sự. Số chuyên đề KC 10. 2012, tr.25-30. tổ hợp có tác dụng kháng ung thư trên mô hình chuột mang khối UTP: giảm kích 2. Nguyen Thai Bieng et al. Establishment of mouse Lewis lung cancer on mouse model. thước khối u, tăng tỷ lệ thoái lui khối u, Journal of Military Pharmaco-Medicine. 2014, tăng tỷ lệ sống sót. 39 (7). IL-12 tham gia vào quá trình biệt hóa 3. Dietrich A, Stockmar C et al. The impact TB T nguyên thủy thành TB Th1, kích of intraoperative vaccination with IL-12 modified thích sự phát triển và hoạt động chức autologous tumor cells in the Lewis lung năng của TB T. IL-12 thúc đẩy TB T duy carcinoma mouse model (abstract). J Cancer trì sản xuất IFN-γ, tăng tiết IFN-γ nội sinh Res Clin Oncol. 2012, Jun,138 (6), pp.901-906. cần thiết cho hiệu quả ức chế khối u [4, 4. Yuzhalin AE, Kutikhin AG. Interleukin-12: 5]. IL-12 còn có vai trò chống tạo mạch và clinical usage and molecular markers of cancer susceptibility. Growth Factors. 2012, 30, ngăn chặn sự hình thành mạch máu mới pp.176-191. được cảm ứng bởi IFN-γ [5, 6]. Tác dụng 5. Sangro B et al. Gene therapy of cancer kháng ung thư của IL-12 được chứng based on interleukin 12. Curr Gene Ther. minh trong nhiều nghiên cứu tiền lâm 2005, 5, pp.573-581. sàng sử dụng các mô hình động vật gây 6. Tamandani DM, Shekari M, Suri V. ung thư thực nghiệm. Khi tiêm IL-12 trực Interleukin-12 gene polymorphism and cervical tiếp vào chuột mang khối u có thể trì cancer risk. Am J Clin Oncol. 2009, 32, pp.524- hoãn, giảm trong một số trường hợp có 528. tác dụng ức chế hoàn toàn khối u phát 7. Shen F, Li JL et al. Interleukin-12 prevents triển; tăng tỷ lệ sống của chuột mang khối colorectal cancer liver metastases in mice. ung thư [3, 7, 10]. Điều này phù hợp với Onco Targets Ther. 2013, 13 (6), pp.523-526. kết quả nghiên cứu của chúng tôi. 8. Ferlay J, Shin HR, Bray F et al. Kết quả này cũng rất có ý nghĩa trong Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer. 2010, việc nghiên cứu tác dụng điều trị của IL-12 127 (12), pp.2893-2917. tái tổ hợp trên UTP thực nghiệm. 9. Jiang Liu, Michael R Johnston. KẾT LUẬN Experimental animal models for studying lung cancers (abstract). Lung Cancer Metastasis. IL-12 người tái tổ hợp liều 0,1 và 2010, pp.241-265. 0,6 µg/chuột có tác dụng kháng ung thư 10. Yin XL, Duan H, Peng ZP, Sun SL, Li SL. trên mô hình chuột mang khối UTP, làm Treatment of murine Lewis lung cancer with giảm kích thước khối u, giảm tỷ lệ chuột recombinant interleukin-12. Ai Zheng. 2006, chết, tăng tốc độ thoái lui khối u. 25 (9), pp.1087-1091. 70