Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát hiện trực khuẩn listeria monocytogenes

Nội dung text: Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát hiện trực khuẩn listeria monocytogenes

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2012 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TEST THỬ NHANH PHÁT HIỆN TRỰC KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES Phạm Đức Minh*; Lê Quốc Tuấn* Nguyễn Hùng Long**; Hoàng Văn Lương* TÓM TẮT Chẩn đoán bằng que thử nhanh đã và đang chiếm ưu thế trong y học và các lĩnh vực liên quan. Vi khuẩn (VK) Listeria monocytogenes là một mầm bệnh nguy hiểm gây ngộ độc thực phẩm và nhiều biến chứng khác. Chẩn đoán nhanh và chính xác VK này có ý nghĩa quan trọng trong điều trị và dự phòng bệnh, cũng như trong việc điều tra, khảo sát tình trạng ô nhiễm thực phẩm. Dựa trên nguyên lý phản ứng miễn dịch kháng nguyên-kháng thể diễn ra trên màng mỏng, Học viện Quân y đã bước đầu chế tạo thành công que thử nhanh phát hiện trực khuẩn L. monocytogenes. So với phương pháp nuôi cấy, phương pháp que nhúng có độ nhạy 89%, độ đặc hiệu 100%. Que thử có khả năng phát hiện được VK ở nồng độ 106 CFU/ml, giá thành thấp, dễ sử dụng và có khả năng ứng dụng cao trong thực tiễn. * Từ khóa: Listeria monocytogenes; Que thử nhanh; Nuôi cấy. STUDYING DEVELOPMENT OF RAPID TEST TO DETECT LISTERIA MONOCYTOGENES BACILLUS SUMMARY Diagnosis by rapid tests has became a common technique in medical practice as well as in other related works. Listeria monocytogenes bacillus is a dangerous pathogen causing food-borne disease with severse complications. Quick and accurate detection of this bacterium is very essential in treatment and preventive practice, as well as in surveillanuôi cấye and investigation of food contaminations. Based on thin-membraned immunochromatography technique on thin membrane, our group in Vietnam Military Medical University has been sucessfully developed a rapid test (in form of dip-sticks) for dectection of L. monocytogenes. Compared to culture technique, rapid test showed sensitivity of 89%, specificity of 100% in detection L. monocytogenes at conuôi cấyentration of 106 CFU/ml. The test is cheap, easy to handle and highly applicable in general medical practice. * Key words: Listeria monocytogenes; Rapid test; Culture. ĐẶT VẤN ĐỀ cũng như nhiều công ty sản xuất các sản Bên cạnh những phương pháp chẩn phẩm liên quan đến sinh học phân tử. đoán truyền thống, chẩn đoán nhanh bằng Học viện Quân y đang quản lý một dây que thử nhanh đã và đang chiếm ưu thế chuyền sản xuất que thử nhanh được trong y học và các lĩnh vực liên quan. Với nhập từ công ty Arista (Hoa Kỳ), có khả ưu điểm giá thành thấp, dễ áp dụng, độ năng hoạt động tự động hoàn toàn hoặc chính xác cao, que thử nhanh đang là bán tự động. mục tiêu của nhiều phòng thí nghiệm * Học viện Quân y ** Bộ Y tế Phản biện khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn TS. Nguyễn Đặng Dũng 71
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2012 VK Listeria monocytogenes là một trong Những VK này đều là chủng chuẩn quốc nhiều mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm tế, chủng chuẩn tại các phòng thí nghiệm, quan trọng, đặc biệt là thức ăn chế biến được tăng sinh và bảo quản theo tiêu dùng ngay [5]. Bệnh do Listeriosis có thể để chuẩn quốc gia tại phòng thí nghiệm, Khoa lại những hậu quả nghiêm trọng như: gây Vi sinh vật, Bệnh viện 103. nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, sảy Mẫu thực phẩm: 200 mẫu thực phẩm thai, thai chết lưu và đẻ non ở phụ nữ mang là những sản phẩm có nguồn gốc từ sữa, thai..., đặc biệt ở người có hệ miễn dịch suy thịt như sữa tươi, pho mát, xúc xích, patê, giảm. Trực khuẩn L. monocytogenes là VK được thu thập tại một số cửa hàng thực gram dương, không sinh nha bào, thường phẩm, nhà máy chế biến thực phẩm và các thấy ở đất, nước thải và thực vật, nên dễ hộ gia đình trong thời gian từ 10 - 2010 đến dàng nhiễm vào thực phẩm do quá trình 6 - 2011. chế biến không đảm bảo vệ sinh [6]. VK này có khả năng sinh trưởng, phát triển ở điều 2. Vật liệu nghiên cứu. kiện nhiệt độ thấp nên vẫn có thể tồn tại và * Dụng cụ, thiết bị: dụng cụ và thiết bị phát triển trong tủ lạnh. chuyên dụng của Khoa Vi sinh vật và Trung Hiện có một số phương pháp thường tâm Nghiên cứu Sinh - Y - Dược học quân dùng để phát hiện L. monocytogenes trong sự, Học viện Quân y. Hệ thống sản xuất thực phẩm gồm: nuôi cấy, phương pháp que thử nhanh của hãng Arista (Hoa Kỳ). ELISA; phương pháp khuếch đại gen (PCR)... * Môi trường nuôi cấy và xác định VK: [1, 2, 3]. Que thử nhanh đã được Singer JM nước pepton 0,1%; môi trường thạch Oxford; và Plotz CM (1956) [7] nghiên cứu và phát môi trường thạch Tryptone soya có 0,6% triển. Đến nay, phương pháp dùng que thử cao men (TSA-YE); canh thang Tryptone soya nhanh ngày càng có nhiều ưu điểm do dễ có 0,6% cao men (TSB-YE); thạch máu cừu; áp dụng, giá thành thấp. Từ những yêu cầu đó, chúng tôi nghiên cứu đề tài này nhằm: môi trường Clurk-Lubs; canh thang đường Xây dựng quy trình công nghệ chế tạo que thử Manitol, Xylose, Rhamnose 5%; bộ nhuộm nhanh phát hiện trực khuẩn L. monocytogenes gram. và bước đầu đánh giá khả năng phát hiện trực * Kháng thể: khuẩn L. monocytogenes trong thực phẩm. Bảng 1: Các kháng thể sử dụng trong nghiên cứu. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP HÃNG TÊN KHÁNG VẬT TÝP: KÍ HIỆU NGHIÊN CỨU SẢN THỂ CHỦ ISOTOPE (Catalog#) 1. Đối tƣợng nghiên cứu. XUẤT MAb to Listeria MAb: Nhóm nghiên cứu: VK L. monocytogenes. monocytogenes Chuột IgG2 C86920M Biodesign Nhóm chứng 1: VK thuộc giống Listeria (trừ MAb to Listeria MAb: Chuột C86030M Biodesign L. monocytogenes), gồm: L. grayi, L. innocua, monocytogenes IgG1 L. ivanovii subsp.ivanovii. Anti mouse IgG Dê IgG ABCAM- ABCAM 0500 Nhóm chứng 2: VK gây nhiễm trùng, nhiễm độc thức ăn (không phải giống Listeria), Có 3 kháng thể được gắn lên màng: gồm: S. typhimurium, Escherichia coli, Vibrio kháng thể phát hiện (KT1), kháng thể bắt cholerae, Shigella boydii. giữ (KT2) và kháng thể kiểm tra (KT3). Kháng thể phát hiện (Detection Antibody) là 73
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2012 C86920M, được gắn với hạt vàng, sau đó gắn lên màng chứa cộng hợp (Conjugate pad). Kháng thể bắt giữ (Capture antibody) là C86030M, được gắn lên màng nuôi cấy ở vị trí đường test. Kháng thể kiểm tra là ABCAM-0500, gắn lên màng nuôi cấy ở vị trí vạch đối chứng (control line). * Màng gắn trên que thử: 1. Màng hút mẫu. 2. Màng chứa chất cộng hợp màu (chứa KT1). Mỗi thanh test được cấu tạo bởi 5 bộ 3. Màng phát hiện đầu tiên. phận chính: màng hút mẫu (Sample pad); 4. Màng nitrocellulose. màng chứa chất cộng hợp màu (Conjugate 5 (a). Vạch phát hiện mẫu (chứa KT2). pad); màng nitrocellulose (Nitrocellulose 5 (b). Vạch đối chứng (chứa KT3). membrance); màng hút trên (Absorbent pad) 6. Màng hút trên. và đế nhựa giữ (Plastic adhesive backing 7. Đế nhựa giữ. card) của que thử. Hình 1: Sơ đồ cấu tạo của test * Dung môi xử lý màng: phát hiện nhanh. Các màng đều có chức năng riêng biệt, - Nguyên lý hoạt động của que thử: trước khi gắn lên test, cần xử lý để tối ưu kháng thể phát hiện (KT1) gắn với kháng hóa hoạt động của que thử. Mỗi dung môi nguyên đặc hiệu và gặp kháng thể bắt giữ đặc hiệu cho một loại màng nhất định và (KT2). Nếu phản ứng miễn dịch đặc hiệu làm tăng hoạt tính của màng sau xử lý. xảy ra, cho kết quả vạch dương tính. Tất cả các phức hợp đi tiếp gặp kháng thể kiểm tra 3. Phƣơng pháp nghiên cứu. (KT3) sẽ xuất hiện màu tại vạch đối chứng. * Phương pháp lấy mẫu: - Tối ưu hóa: công đoạn tối ưu hóa sẽ Mẫu thực phẩm lấy ngẫu nhiên từ các cho công thức phối hợp tối ưu giữa nồng độ nhà máy, cơ sở chế biến thực phẩm, cửa kháng thể cũng như hóa chất khác trên que hàng thực phẩm hoặc hộ gia đình. Mẫu sau nhúng, sao cho đảm bảo nguyên tắc “sử khi lấy, bảo quản ở 4oC đến khi phân tích. dụng hàm lượng tối thiểu các chất để tạo được thiết bị có tính năng tối ưu”. * Phương pháp chế tạo que thử nhanh: * Phương pháp vi sinh vật học: - Thiết kế: dựa theo quy trình của công ty Arista (Hoa Kỳ). Đầu tiên, các loại màng Phân lập và định danh VK L. monocytogenes theo tiêu chuẩn Ngành Y tế của Hội Khoa được xử lý bằng dung môi thích hợp, để học - Kỹ thuật An toàn thực phẩm, nhóm khô, tiếp theo, phun kháng thể lên màng, TQTP 52 TCN-TQTP 0002:2003 có hiệu lực cuối cùng, các bộ phận được lắp ghép và từ ngày 25/3/2003-Bộ Y tế. giữ chặt trên một đế nhựa. Quá trình tiến * Phương pháp thử nghiệm que nhúng hành ở điều kiện nhiệt độ khoảng 25oC, độ với mẫu thử: ẩm tương đối < 40%. Sau khi hoàn thành, Que nhúng được thử nghiệm với các cất giữ sản phẩm trong gói hàn nhiệt kín, có mẫu VK chủng chuẩn để xác định độ nhạy vật liệu chống ẩm bảo quản. và độ đặc hiệu, đồng thời thử với các mẫu 74
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2012 thực phẩm để có thể so sánh với phương Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; pháp nuôi cấy về giá trị phát hiện. KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card cho tín * Địa điểm nghiên cứu: Labo Vi sinh và hiệu có thể nhận biết được. các mầm bệnh sinh học, Trung tâm Nghiên * Khả năng phát hiện của que thử trên cứu Sinh - Y - Dược học quân sự, Học viện mẫu VK: Quân y và Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện 103. * Xử lý số liệu: quản lý và phân tích số liệu bằng phần mềm SPSS 16.0. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hình 6: Thử que nhúng với VK L. 5 monocytogenes ở nồng độ 5.10 CFU/ml. 1. Chế tạo và tối ƣu hóa que nhúng. * Nồng độ kháng thể trên màng que thử: Hình 7: Thử que nhúng với VK L. 6 Hình 2: Que thử có hàm lượng KT1: monocytogenes ở nồng độ 10 CFU/ml. 0,25 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. Que thử cho kết quả dương tính (2 vạch) rõ nét với VK L. monocytogenes ở nồng độ 106 CFU/ml. 2. Tính đặc hiệu của que thử Hình 3: Que thử có hàm lượng KT1: Vạch chứng 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. Hình 8: Thử que nhúng với VK L. grayi. Hình 4: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 1 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. Hình 9: L. Innocua Thử que nhúng với VK . Hình 5: Que thử có hàm lượng KT1: Hình 10: Thử que nhúng với VK 0,5 µg/card; KT2: 1,5 µg/card; L. ivanovii subsp.ivanovii. KT3: 0,25 µg/card. (Vị trí 1: vạch chứng; vị trí 2: vạch test) Que thử cho kết quả âm tính (tín hiệu tại vạch chứng) với VK L. grayi và L. innocua. 75
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2012 Tương tự, các thí nghiệm que thử nhanh với cao > 45% sẽ dẫn đến nhòe vạch phun, VK Vibrio cholera, Salmonella Typhimurium, kháng thể bám dính vào màng lai không tốt, Escherichia coli đều cho kết quả âm tính. độ ổn định của que thử không cao. 3. Đánh giá tính năng que nhúng trên 2. Khả năng phát hiện của que thử mẫu thực phẩm. nhanh với trực khuẩn L. monocytogenes. Bảng 2: Kết quả thử nghiệm que thử nhanh Que thử nhanh sau khi tối ưu được thử trên thực phẩm so với nuôi cấy. với VK L. monocytogenes chủng chuẩn ở những nồng độ khác nhau. Kết quả cho QUE THỬ KẾT NUÔI CẤY TỔNG NHANH QUẢ thấy, tín hiệu của que thử có thể phát hiện (+) (-) được bằng mắt thường khi nồng độ VK 6 (+) 16 0 16 trong mẫu thử là 10 CFU/ml. (-) 2 182 184 Kết quả so sánh chẩn đoán giữa hai phương pháp que thử nhanh và nuôi cấy Tổng 18 182 200 đối với một số mẫu thực phẩm cho thấy: Kappa = 0,93; Se = 89%; Sp = 100%; phương pháp que thử nhanh có độ nhạy PPV = 100%; NPV = 99% 89%, độ đặc hiệu 100%. Hệ số Kappa của hai phương pháp là 0,93, nên có thể dùng BÀN LUẬN hỗ trợ và thay thế lẫn nhau. Giá trị chẩn 1. Quy trình chế tạo que thử nhanh. đoán của phương pháp nuôi cấy rất cao, thường được coi là chuẩn vàng, tuy nhiên, Kết quả khảo nghiệm cho thấy, khi nồng nuôi cấy cần thời gian tối thiểu 3 - 5 ngày, độ kháng thể tại màng cộng hợp và màng với nhiều trang thiết bị, dụng cụ, môi NC < 0,5 µg/card, tín hiệu tại que thử không trường, tủ nuôi, kỹ thuật viên lành nghề, chi có hoặc yếu. Tín hiệu rõ khi hàm lượng phí cao hơn nhiều so với phương pháp que kháng thể > 0,5 µg/card và rất rõ khi > 1 thử nhanh. µg/card. Que thử nhanh cho kết quả trong vòng 5 Trong sản xuất que thử, cần quan tâm - 10 phút. Chính vì vậy, trên thực tế que thử đến giá thành sản phẩm, cần sử dụng nhanh giúp ích trong công tác sàng lọc lượng nguyên liệu tối thiểu để đưa ra được nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm mầm sản phẩm đạt yêu cầu. Vì thế, công thức bệnh trước khi tiến hành xét nghiệm sâu phối hợp tối ưu về hàm lượng kháng thể tại hơn, giúp giảm chi phí trong xét nghiệm màng cộng hợp (KT1), vạch kiểm tra (KT2), chẩn đoán. Khi áp dụng phương pháp này vạch đối chứng (KT3) lần lượt là: 0,5; 1; cùng với các phương pháp khuếch đại gen, 0,25 µg/card. đặc biệt là khuếch đại gen định lượng, các Trong tương lai, có thể nghiên cứu dùng nhà khoa học có thể trả lời nhanh và chính kháng thể polyclonal thay thế cho monoclonal xác về chủng loại và số lượng mầm bệnh bị nhằm tăng ngưỡng phát hiện và giảm chi nhiễm trong thực phẩm [4]. phí tạo kit. KẾT LUẬN Độ ẩm khi phun kháng thể là một trong Đã chế tạo thành công que thử nhanh phát những yêu cầu rất quan trọng, nếu độ ẩm hiện trực khuẩn L. monocytogenes. Que thử 76
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2012 6 có khả năng phát hiện được VK ở nồng độ 10 4. Angela Ingianni et al. Isolation and CFU/ml, độ đặc hiệu tuyệt đối. identification of L. monocytogenes in processed meat by a combined cultural-molecular method. So với phương pháp nuôi cấy trong phát American Journal of Infectious Diseases. 2007, hiện trực khuẩn L. monocytogenes, phương 3 (3), pp.159-164. pháp que nhúng có độ đặc hiệu 100%, độ 5. Daniel L Gallagher et al. FSIS risk nhạy 89%, hệ số phù hợp Kappa = 0,93. assessment for L. monocytogenes in deli meats. www.fsis.usda.gov/oppde/rdad/FRPubs/97- TÀI LIỆU THAM KHẢO 013F/ListeriaReport.pdf. 2003. 1. Nguyễn Chi Phương. An toàn thực phẩm: 6. Murray EGD, Webb RE, Swann MBR. A nhiễm khuẩn Listeria. Tạp chí Y học dự phòng. disease of rabbits characterized by a large 2005, số 6, tr.97-99. mononuclear leucocytosis, caused by a hitherto 2. Nguyễn Minh Thực và CS. Bước đầu khảo undescribed bacillus Bacterium monocytogenes sát sự nhiễm L. monocytogenes trong một số (n. sp.). J Pathol Bacteriol. 1926, 29, pp.407-439. thực phẩm trên thị trường Hà Nội bằng kỹ thuật 7. Singer JM, Plotz CM. The latex fixation PCR. Tạp chí Khoa học và Công nghệ. 2008, test. Application to the serologic diagnosis of tập 46, số 2, tr.67-77. rheumatoid arthritis. American Journal of Medicine. 3. Nguyễn Thị Kim Hoa và CS. Ứng dụng kỹ 1956, 21, pp.888-892. thuật PCR trong phát hiện nhanh L. monocytogenes. Tạp chí Khoa học và Công nghệ. 2005, tập 43, số 4, tr.37-45. 77
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2012 78