Khảo sát đặc điểm phân tử gen lmp-1 của virut epstein-barr và methyl hóa promoter của gen rassf1a ở một số mẫu ung thư vòm họng tại Việt Nam

Nội dung text: Khảo sát đặc điểm phân tử gen lmp-1 của virut epstein-barr và methyl hóa promoter của gen rassf1a ở một số mẫu ung thư vòm họng tại Việt Nam

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN LMP-1 CỦA VIRUT EPSTEIN-BARR VÀ METHYL HÓA PROMOTER CỦA GEN RASSF1A Ở MỘT SỐ MẪU UNG THƢ VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM Lê Thanh Hà*; Nguyễn Lĩnh Toàn**; Võ Thị Thương Lan*** * Nguyễn Đình Phúc**** ; Lê Thanh Hòa***** TÓM TẮT Từ mô sinh thiết của 15 bệnh nhân (BN) được chẩn đoán ung thư vòm họng (UTVH), tách chiết ADN hệ gen EBV. Bằng phản ứng PCR, dòng hóa và giải trình tự, đã thu nhận được toàn bộ 5 chuỗi ARN thông tin của gen LMP-1 (1083 - 1182 bp). Kết quả phân tích gen cho thấy vùng exon 1 ổn định cao và biến đổi tập trung vào các vùng exon 2 và 3. Đồng thời, nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật Methylation-specific PCR (MSP) để khảo sát mức độ methyl hóa trên 15 mẫu mô bệnh này. RASSF1A là một gen ức chế khối u được chọn để khảo sát mức độ methyl hóa. Kết quả cho thấy: trong 15 mẫu bệnh phẩm UTVH, 12 mẫu (80%) có methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A. Khi so sánh tỷ lệ này với một số công trình nghiên cứu khác trên thế giới, chúng tôi nhận thấy methyl hóa trong nghiên cứu này chiếm tỷ lệ cao. Nghiên cứu đang được tiếp tục triển khai trên số lượng bệnh phẩm lớn hơn nhằm góp phần giải thích cơ chế bệnh sinh của UTVH do EBV. * Từ khóa: LMP-1; Kỹ thuật MSP; Methyl hóa ADN; Ung thư vòm họng. Characteristics of LMP-1 GENE molecular OF EPSTEIN- BARR VIRUS AND METHYLATION AT PROMOTERS OF RASSF1A FROM samples of NASOPHARYNGEAL CARCINOMA IN VIETNAM SUMMARY Genomic DNA of Epstein-Barr virus was extracted from biopsy tissue of 15 patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC). Using PCR, cloning and sequencing, the entire mRNA of the LMP-1 gene (1083 - 1182 bp) was obtained. The results showed that the genetic analysis of exon 1 has high stability and mutations focused on the exons 2 and 3. We used Methylation-Specific PCR (MSP) to analyze the methylation in tissues from these patients. RASSF1A (tumor suppressor gene) was selected for examining the methylation. Hypermethylation in RASSF1A was found in 12 samples (80%). Generally, the hypermethylation of this gene in this study were rather high compared with other equivalent studies. Our research is being carried out with larger samples in order to evaluate the use of DNA methylation status of these candidate genes as a potential biomarker for Vietnamese NPC. * Key words: LMP-1; MSP technique; DNA methylation; Nasopharyngeal carcinoma. * Bệnh viện 103 ** Học viện Quân y *** Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội **** Viện Tai Mũi Họng Trung ương ***** Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Trần Văn Khoa TS. Nguyễn Đặng Dũng
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Tần số methyl hóa của một số gen có thể phát hiện bằng phương pháp MSP Ung thư vòm họng là một khối u ác tính (Methylation-Specific PCR) [5]. Phương xuất phát từ lớp biểu mô phủ của vùng vòm pháp này dựa trên sự khác biệt giữa các mũi họng. Nó là một trong những dạng ung trình tự ADN bị methyl hóa và không methyl thư hàng đầu ở các vùng địa lý như Nam sau khi xử lý ADN bằng dung dịch muối Trung Quốc, Đông Nam Á, Bắc Cực, Trung natribisulfit. Quá trình xử lý ADN bằng Đông, Bắc Phi và Việt Nam. UTVH có natribisulfite làm thay đổi trình tự ADN bằng nguyên nhân phức tạp và đang được các cách chuyển đổi tất cả cytosin không bị nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu. Hiện nay, methyl hóa thành uracil, trong khi cytosin nguyên nhân của bệnh được tập trung đã bị methyl hóa sẽ không thay đổi. Hai cặp thành ba nhóm chủ yếu là virut Epstein-Barr mồi đặc hiệu được sử dụng để khuếch (EBV), di truyền và các yếu tố môi trường, đại những vùng gen quan tâm bằng phản tập quán sinh hoạt. ứng PCR. Nhiễm tiềm tàng EBV là hiện tượng khởi Mục tiêu của đề tài: đầu cho quá trình tiến triển ung thư. Đặc trưng của truyền nhiễm EBV chủ yếu là - Xác định đặc điểm cấu trúc phân tử biểu hiện của gen tiềm tàng, bao gồm gen LMP-1 của một số chủng EBV phân lập EBNA-1, LMP-1, LMP-2 và EBER [6]. Trong từ BN UTVH ở Việt Nam. các gen và protein ảnh hưởng đến sự tiến - Phân tích liên quan bệnh lý của gen mã triển thành ung thư, LMP-1 có vai trò đặc hóa LMP-1 protein với quá trình methyl hóa biệt quan trọng và đã được chứng minh là gen RASSF1A trên BN ung thư vòm mũi họng. có khả năng đơn phương gây ung thư trên chuột thực nghiệm [6]. LMP-1 chính là gen ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP tiềm ẩn đầu tiên của EBV được phát hiện NGHIÊN CỨU có chức năng chuyển đổi dòng và thay đổi 1. Đối tƣợng nghiên cứu. kiểu hình của tế bào [7]. Tách chiết 15 mẫu ADN từ mô sinh thiết RASSF1A (Ras association domain family khối u của BN UTVH ký hiệu: H2, S9, S18, 1 isoform A) là một gen ACUT nằm trong H9, S1, B1, B2, B7, B9, B10, B12, E61, vùng 3p21.3 trên nhiễm sắc thể số 3 của bộ H14, M12, M14 được chẩn đoán xác định gen người [4]. RASSF1A ức chế sự tăng dựa vào các triệu chứng lâm sàng và kết trưởng khối u trong cả in vitro, in vivo và quả giải phẫu bệnh lý tại Bệnh viện Tai Mũi được xem là một gen ACUT điển hình. Gen Họng Trung ương. này được xác định vào năm 2000, nhưng 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. đến nay đã có hơn 150 nghiên cứu chứng minh quá trình methyl hóa bất thường xảy * Biến đổi bisulfite: ra tại các đảo CpG thuộc vùng promoter ADN tổng số sau khi được từ tách chiết của RASSF1A diễn ra trong rất nhiều loại từ 15 mẫu bệnh phẩm chia làm 2 phần: một ung thư, như UTVH, phổi, vú, thận, dạ dày, phần dùng làm khuôn để chạy phản ứng bàng quang, tế bào thần kinh đệm [1]. PCR đối với gen LMP-1, phần còn lại sẽ
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 được xử lý với bisulfite và tinh sạch bằng Tiến hành phản ứng PCR 15 mẫu cho Epitect Kit (Qiagen, Cat. No 59104). cặp mồi LMP1-F và LMP1-R. Sản phẩm thu * Thực hiện phản ứng PCR đối với gen được của 5 mẫu S1, S9, S18, H2, H9 sẽ sử LMP-1 và MSP để khảo sát quá trình dụng cho giải trình tự. 15 mẫu ADN sau khi methyl hóa các đảo CpG thuộc vùng xử lý bằng bisulfite, tiến hành phản ứng promoter của gen RASSF1A: MSP với các mồi và điều kiện sau: Bảng 1: Trình tự nucleotid các cặp mồi cho phản ứng PCR và MSP. TRÌNH TỰ NUCLEOTID TÊN MỒI ĐIỀU KIỆN PCR (5 phút > 3 phút) LMP1-F ATGGAACGCGACCTTGAGAG o o 94 C 5 phút, 35 chu kỳ gồm các bước: 94 C 1 phút, 55oC 1 phút, 72oC 1 phút, 72oC 10 phút. LMP1-R TTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAAC GL-F CAACTTCATCCACGTTCACC o o 94 C 5 phút, 40 chu kỳ gồm các bước: 94 C 30 giây, 57oC 30 giây, 72oC 30 giây, 72oC 5 phút. GL-R GAAGAGCCAAGGACAGGTAC RASSF1A-M210-F GGGTTTTGCGAGAGCGCG o o 94 C 5 phút, 40 chu kỳ gồm các bước: 94 C 30 giây, 63oC 30 giây, 72oC 30 giây, 72oC 5 phút. RASSF1A-M211-R GCTAACAAACGCGAACCG RASSF1A-Un-F1 GGGGTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG 0 0 94 C 5 phút, 40 chu kỳ gồm các bước: 94 C 30 phút, 630C 20 phút, 720C 30 phút, 720C 5 phút RASF1A-Un-R1 TAAACACTAACAAACACAAACC RASSF1A-Un-F2 GAGAGTGTGTTTAGTTTTGTTTTTG 94oC 5 phút, 40 chu kỳ gồm các bước: 94oC 30 giây, 60oC 30 giây, 72oC 30 giây, 72oC 5 phút. RASF1A-Un-R2 CCACAAAACAAACCCCAACTTCAA (* Dòng hoá sản phẩm, tách dòng và giải trình trình tự): Sản phẩm PCR đoạn gen LMP-1 của 5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ mẫu S1, S9, S18, H2, H9 sau khi tinh sạch, BÀN LUẬN được dòng hoá vào plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen Inc.). Chọn lọc và tách chiết 1. Kết quả phân tích đặt điểm gen ADN plasmid tái tổ hợp theo quy trình LMP -1. của hãng Bioneer (Hàn Quốc). Trình tự Để phát hiện gen LMP-1 trong 15 mẫu nucleotid của ADN của plasmid tái tổ hợp mang khung gen LMP-1 được giải trình trên bệnh phẩm, sử dụng cặp mồi đặc hiệu máy tự động ABI-3100 Genetic Analyzer. LMP1-F/LMP1-R. Kết quả điện di cho 12 Xử lý chuỗi nucleotid bằng các chương trình mẫu dương tính (H2, S9, S18, H9, S1, B1, SeqEd1.03, AssemblyLIGN1.9, MacVector B2, B7, E61, H14, M12, M14) và 3 mẫu âm 8.2 (Accelrys Inc.) và so sánh đối chiếu tính (B9, B10, B12) với tỷ lệ dương tính là bằng chương trình GENEDOC 2.6.002 80% (12/15 BN). (
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013  1100 bp Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen LMP-1 với cặp mồi LMP1-F/LMP1-R của 15 mẫu. M: chỉ thị phân tử ADN (ở đây sử dụng hệ gen Lamda cắt bằng enzym giới hạn HindIII); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương: H2, S9, S18, H9,S1, B1, B2, B7, B9, B10, B12, E61, H14, M12, M14: sản phẩm chạy PCR của 15 mẫu BN tương ứng. Toàn bộ chuỗi nucleotid của đoạn ADN thu nhận từ 5 mẫu H2, S9, S18, H9,S1 được giải trình trên máy tự động ABI-3100 Genetic Analyzer. Hình 2, 3 so sánh trình tự nucleotid và axít amin ARN thông tin gen LMP-1 của 5 chuỗi H2, S9, S18, H9, S1. Ngoài thay đổi về nucleotid và axít amin mang tính chất sai khác điểm (point-mutation), hai vùng có sai khác thêm vào - bớt đi giữa các chuỗi: vùng thứ nhất (nt.861-959) mất 33 nucleotid (nt.861-893) của chuỗi S1 mã hoá cho 11 axít amin (QDPDNTDDNGP), đồng thời thêm vào 66 nucleotid (nt.894-959) của chuỗi H2 mã hoá cho 23 axít amin (QDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGPH); vùng thứ hai (nt.1087-1116) thêm vào 30 nucleotid (nt.1087-1116) của chuỗi S18 mã hoá cho 10 axít amin (HSHDSGNGGG). Hình 2: So sánh trình tự nucleotid một đoạn gen LMP-1 (800-1302) của 5 chuỗi H2, S9, S18, H9 và S1.
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Hình 3: So sánh trình tự các axít amin được mã hóa bởi gen LMP-1 của 5 chuỗi H2, S9, S18, H9 và S1. Như vậy, những đột biến mất đoạn của chuỗi S1 (nt.861-893), thêm đoạn của chuỗi H2 (nt. 894-959) và S18 (nt.1087-1116) dẫn đến thay đổi lớn về cấu trúc đầu C tận của protein LMP-1 sản phẩm do gen này mã hóa. Vùng này có vai trò rất quan trọng trong cơ chế gây UTVH của EBV nói chung và của gen LMP-1 nói riêng [6]. Một số nghiên cứu đã chứng minh vai trò của LMP1 trong việc ức chế biểu hiện gen RASSF1A là một gen ức chế ung thư có vai trò quan trọng trong việc phát triển tế bào ung thư [9]. 2. Kết quả khảo sát quá trình methyl hóa các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A ở mẫu UTVH. H2 S9 S18 H9 S1 (+) T B T B T B T B T B (-) Hình 4: Sản phẩm PCR với cặp mồi GL-F/GL-R nhân bản gen β-globin từ khuôn ADN trước (T) và sau khi xử lý với bisulfite (B) của 5 mẫu H2, S9, S18, H9, S1. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%. L1: Thang chuẩn ADN 100 bp; (-): Đối chứng âm (không có ADN khuôn); (+): Đối chứng dương (có ADN của gen β-globin).
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Hình 5: Sản phẩm PCR với cặp mồi GL-F/GL-R nhân bản gen β-globin từ khuôn ADN trước (A) và sau khi xử lý với bisulfite (B) của 10 mẫu: B1, B2, B7, B9, B10, B12, E61, H14, M12, M14. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1.5% (A) hoặc điện di trên gel acrylamide 8% (B); M: Thang chuẩn ADN SY-60 bp; (-): Đối chứng âm (không có ADN khuôn); (+): Đối chứng dương (có khuôn là plasmid mang đoạn gen β-globin). Kết quả này cho thấy ADN trước xử lý đều cho phép nhân bản một băng ADN đặc hiệu cho gen đơn bản β-globin. Các mẫu sau xử lý hầu như không phát hiện được băng nào cho thấy hầu hết ADN tổng số đã được xử lý hoàn toàn với bisulfite. --- H21 S9 2 S18 3 H9 4 S1 5 M M * M _ B1 B2 _ B7 B9 B10 B12 E61 H14 M12 M14 M 169 bp Hình 6: Sản phẩm MSP nhân bản promoter gen RASF1A từ khuôn ADN bị xử lý với bisulfite của 15 mẫu UTVH với cặp mồi methyl RASSF1A-M210-F/RASSF1A-M211-R. Sản phẩm PCR được điện di trên gel acrylamide 12%. M: Thang chuẩn ADN SY-100 bp; (-): Đối chứng âm (không có ADN khuôn). Kết quả cho thấy: 3 mẫu S9, B2 và M14 promoter của gen RASSF1A trong số 15 không bị methyl hóa, 12 mẫu còn lại đều có mẫu bệnh phẩm UTVH (3 mẫu LMP-1 âm methyl ở promoter gen RASSF1A. Như vậy, tính B9, B10, B12 vẫn cho kết quả methyl tỷ lệ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc hóa dương tính và ngược lại, 3 mẫu LMP-1 vùng promoter của gen RASSF1A trong 15 dương tính S9, B2 và M14 vẫn cho kết quả mẫu bệnh phẩm UTVH là 80%, cao hơn so methyl hóa âm tính), nhưng tỷ lệ dương tính với một số công trình nghiên cứu khác trên với LMP-1 và tỷ lệ methyl hóa tại các đảo thế giới (từ 50 - 70%) [3]. CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A Mặc dù chưa có sự tương thích tuyệt đối trong 15 mẫu nghiên cứu cao (80%), cho giữa kết quả chạy PCR gen LMP-1 và thấy sự liên quan giữa 2 quá trình này trong methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng cơ chế bệnh sinh của UTVH do EBV gây
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 nên như một số nghiên cứu đã công bố [9]. và thêm đoạn chuỗi H2 (nt. 894-959), S18 Mặt khác, vai trò của LMP-1 gây methyl hóa (nt.1087-1116) dẫn đến thêm các đoạn các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen axít amin tương ứng là 23 axít amin RASSF1A còn phụ thuộc vào cấu trúc của (QDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGPH)..và protein LMP-1 liên quan đến đột biến của 10 axít amin (HSHDSGNGGG). gen này [6]. Kết quả nghiên cứu methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A cho thấy: trong số 15 mẫu bệnh phẩm UTVH, 12 mẫu dương tính (80%), tỷ lệ này cũng cao tương đương với tỷ lệ dương tính gen LMP-1 trong các mẫu sinh thiết UTVH là 80% (12/15 BN). Khi so sánh tỷ lệ này với một số công trình nghiên cứu Hình 7: Sản phẩm nested-MSP nhân bản khác trên thế giới, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ promoter gen RASF1A từ khuôn ADN bị xử methyl hóa của nghiên cứu này cao [3]. lý với bisulfite của các mẫu UTVH với cặp mồi unmethyl. Sản phẩm PCR với cặp mồi TÀI LIỆU THAM KHẢO RASSF1A-Un-F1/RASSF1A-Un-R1.được dùng làm khuôn với cặp mồi RASSF1A-Un- 1. Agathanggelou A, Wendy N, Farida L. F2/RASSF1A-Un-R2 và được điện di trên gel Role of the Ras-association domain family 1 acrylamide 12%. M: Thang chuẩn ADN 100 bp; tumor suppressor gene in ®uman cancers. (-): Đối chứng âm (không có ADN khuôn). Cancer Res. 2005, 65, pp.3497-3508. Kết quả cho thấy tất cả 15 mẫu đều có 2. Brooks J, Cairns C, Zeleniuch J. Promoter băng đặc hiệu cho ADN không bị methyl methylation, the detection of breast cancer. Cancer hóa. Đây là sản phẩm đặc trưng cho tế bào Causes Control. 2009, 20 (9), pp.1539-1550. lành lẫn trong mẫu ung thư. Chứng tỏ ADN 3. Challouf S, Ziadi S, Zaghdoudi R, Ksiaa F, được xử lý bisulfite tốt và các cặp mồi được Ben Gacem R, Trimeche M. Patterns of aberrant thiết kế đặc hiệu chính xác đối với vùng DNA hypermethylation in nasopharyngeal carcinoma promoter RASSF1A. in Tunisian patients. Clin Chim Acta. 2012, Apr, 413 (7-8), pp.795-802. KẾT LUẬN 4. Donninger H, Vor MD, Clark GJ. The Gen LMP-1 của 5 chuỗi H2, S9, S18, RASSF1A tumor suppressor. Journal of Cell H9, S1 được dòng hóa và giải trình tự gen, Science. 2007, 120, pp.3163-3172. qua phân tích kết quả cho thấy trên gen 5. Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin LMP-1 tồn tại ngoài những đột biến điểm BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a thường gặp, còn có những đột biến mất novel PCR assay for methylation status of CpG đoạn nucleotid (nt.861-893) chuỗi S1 dẫn islands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996, Sep, đến mất 11 axít amin (QDPDNTDDNGP) 93 (18), pp.9821-9826.
8. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 6. Kaye KM, Izumi KM, Kieff E. Epstein-Barr 9. Man C, Rosa J, Lee LT, Lee VH, Chow BK, virus latent membrane protein 1 is essential for Lo KW, Doxsey S, Wu ZG, Kwong YL, Jin DY, B lymphocyte growth transformation. Proc Natl Cheung AL, Tsao SW. Latent membrane protein Acad Sci USA. 1993, 90, pp.9150-9154. 1 suppresses RASSF1A expression, disrupts microtubule structures and induces chromosomal 7......Kilger E, Kieser A, Baumann M, Hammerschmidt W. Epstein-Barr virus-mediated aberrations in human epithelial cells. Oncogene. B-cell proliferation is dependent upon latent 2007, May, 26 (21), pp.3069-3080. membrane protein 1, which stimulates an 10. Nephew KP, Huang TM. Epigenetic gene activated CD40 receptor. EMBO J. 1998, 17, silencing in cancer initiation, progression. Cancer pp.1700-1709. Letters. 2002, 190, pp.125-133. 8. Lo KW, Chung GT, To KF. Deciphering the molecular genetic basis of NPC through molecular, cytogenetic and epigenetic approaches. Semin Cancer Biol. 2012, Apr, 22 (2), pp.79-86. Ngày nhận bài: 26/10/2012 Ngày giao phản biện: 5/1/2013 Ngày giao bản thảo in: 6/2/2013
9. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013