Định lượng đồng thời dexamethason acetat betamethason và prednisolon bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao để kiểm tra một số chế phẩm đông dược

Nội dung text: Định lượng đồng thời dexamethason acetat betamethason và prednisolon bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao để kiểm tra một số chế phẩm đông dược

1. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI DEXAMETHASON ACETAT BETAMETHASON VÀ PREDNISOLON BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỂ KIỂM TRA MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC Đào Văn Đôn*; Nguyễn Hồng Hải** Nguyễn Thị Thủy*; Nguyễn Thị Thanh Phương** TÓM TẮT Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời đồng thời dexamethasone acetate (DA), betamethasone (BE) và prednisolone (PR) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV, pha động ACN:H2O (45:55, v/v), tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích bơm mẫu 10 µl. Quy trình định lượng này đã được thẩm định đầy đủ. Trong khoảng 5 - 200 g/ml, diện tích peak và nồng độ có tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ 1. Giới hạn định lượng của 3 chất DA, BE và PR lần lượt là 1,0 g/ml, 0,5 g/ml và 0,5 g/ml. Độ chính xác < 2%. Độ đúng 92 - 100%. Quy trình này hoàn toàn có thể ứng dụng để kiểm tra DA, BE và PR trong các chế phẩm đông dược trên thị trường. * Từ khóa: Glucocorticoid; Dexamethason acetat; Betamethason; Prednisolon; S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao; Thuốc đông dược. SIMULTANEOUS DETERMINATION OF DEXAMETHASONE ACETATE, BETAMETHASONE AND PREDNISOLONE IN HERBAL MEDICINES BY HPLC Summary A HPLC method for the simultaneous determination of 3 glucocorticoids (dexamethasone acetate, betamethasone and prednisolone) in herbal medicines was validated. Using acetonitrile and water as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6 nm, 5 µm) column, UV detection at 240 nm and flow at 1.5 ml/min, the glucocorticoids were separated satisfactorily within 12 minutes. The quantitation limits of dexamethasone acetate, betamethasone and prednisolone were about 1.0 g/ml, 0.5 g/ml and 0.5 g/ml, respectively. The calibration curve of each glucocorticoid had a correlation coefficient close to 1. The precisions were all less than 2%. The recovery rates of extraction were 92 - 100% for all glucocorticoids. This method can be used to detemine dexamethasone acetate, betamethasone and prednisolone simultaneously in herbal medicines. * Key words: Glucocorticoid; Dexamethasone acetate; Betamethasone; Prednisolone; HPLC; Herbal medicines. * Học viện Quân y * Trung tâm Kiểm nghiệm Hà Nội Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Nguyễn Liêm PGS. TS. Nguyễn Văn Minh 18
2. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Địa hoàng 8 g, Đỗ trọng 8 g, Ngưu tất 8 g, Đương quy 8 g, Phòng phong 8 g, Phục linh Thuốc đông dược được cho là những 8 g, Quế nhục 8 g, Cam thảo 8 g, Tế tân 8 g, thuốc tương đối an toàn, ít tác dụng phụ Tần giao 8 g, Nhân sâm 8 g. nên được nhiều người tin tưởng sử dụng. - Mẫu trắng: 2,0 g mẫu tự tạo ở trên. Tuy nhiên, nhược điểm của thuốc là tác - Mẫu thử: 2,0 g mẫu tự tạo được bổ dụng thường chậm. Lợi dụng tâm lý này sung 1 mg từng chất DA, BE và PR. của người sử dụng, một số cơ sở sản xuất thuốc đông dược đã trộn lẫn thuốc tân * Dung môi, hoá chất: dược vào chế phẩm đông dược để tạo ra - Chất chuẩn: DA, BE, PR do Viện Kiểm được tác dụng nhanh, tuy nhiên người sử nghiệm Thuốc TW sản xuất. dụng vẫn tin là an toàn do loại tân dược trộn quan sát khó có thể phát hiện. Trong - Methanol, acetonitril (Merck) đạt tiêu các loại tân dược, nhóm thuốc glucocorticoid chuẩn HPLC. (GC) là được sử dụng nhiều hơn cả. Đặc - Các hoá chất, dung môi khác: ethanol, biệt là hoạt chất dexamethason acetat (DA), methanol, ethyl acetat, cloroform, diethyl ether, betamethason (BE) và prednisolon (PR) H 2 SO4 đặc... đạt tiêu chuẩn phân tích. vì chúng có tác dụng chống viêm mạnh, dễ * Thiết bị và dụng cụ phân tích: kiếm và rẻ tiền. Ở nước ta, đã có một số nghiên cứu về phát hiện GC trong chế phẩm Các thiết bị phân tích đều được chuẩn đông dược [1, 2]. Nếu áp dụng mỗi quy hóa theo ISO/IEC 17025 - 2005 bao gồm: trình này để kiểm tra từng GC sẽ gây tốn - Thiết bị phân tích: hệ thống HPLC Alliance kém cả về thời gian và vật chất. Thực tế đòi Waters 2695D, 4 kênh dung môi, bơm mẫu hỏi cần có một quy trình phân tích đồng thời tự động, có buồng gia nhiệt cột, detector nhiều GC trong chế phẩm đông dược. Vì PDA, cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm 5 µm)... Phần mềm xử lý số liệu Empower® 2. mục tiêu: Định lượng đồng thời dexamethason acetat, betamethason và prednisolon bằng - Thiết bị dụng cụ khác: cân phân tích HPLC để kiểm tra một số chế phẩm đông Sartorius độ chính xác 0,1 mg, bình chạy dược. sắc ký lớp mỏng, đèn tử ngoại có bước sóng 254 nm và 366 nm, bình phun thuốc NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP thử hiện màu; các dụng cụ thủy tinh, bình NGHIÊN CỨU định mức, pipet có độ chính xác phù hợp. 1. Nguyên vật liệu nghiên cứu. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Đèi tượng nghiên cứu: * Khảo sát quy trình định lượng: - Mẫu tự tạo: chiết và tạo bột cao khô từ Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu [1, 2, 10 thang thuốc “Độc hoạt ký sinh thang”. 3, 4], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý mẫu - Thành phần 1 thang thuốc độc hoạt như sau: tang ký sinh: Độc hoạt 12 g, Tang ký sinh Cân chính xác 2,0 g bột mẫu tự tạo vào 8 g, Xuyên khung 8 g, Bạch thược 8 g, bình nón có nút mài 100 ml và bổ sung 21
3. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 thêm 1 mg từng chất DA, BE, PR. Thêm 20 ml * Điều kiện sắc ký [1, 2, 3, 4]: ethyl acetat vào bình, đun nóng trên bếp Cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), cách thuỷ trong 10 phút. Lọc nóng qua giấy detector PDA quét phổ 200 - 400 nm, tốc độ lọc, chiết tiếp 2 lần như vậy. Tráng giấy lọc dòng 1,5 ml/phút, thể tích bơm mẫu 10 µl. bằng ethyl acetat nóng. Gộp các dịch chiết Tiến hành khảo sát pha động ACN: H2O với ethyl acetat và bốc hơi trên cách thuỷ tới các tỷ lệ 30/70, 45/55 và 60/40 (v/v). cắn. Cắn được hoà tan trong 5 ml MeOH, * Thẩm định quy trình định lượng: lắc siêu âm trong 10 phút. Lọc qua giấy lọc Thẩm định quy trình định lượng theo và chuyển vào bình định mức 10 ml. Tráng ICH, gồm các chỉ tiêu: tính tương thích của bình và rửa cắn trên giấy lọc bằng 3 ml hệ thống sắc ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, MeOH, thêm MeOH đến vạch, lắc đều. Dịch khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát chiết được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác, khi phân tích bằng HPLC. độ đúng. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Khảo sát quy trình định lƣợng. Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo sát điều kiện sắc ký theo quy trình ®ịnh lượng ghi sắc ký đồ. Phân tích kết quả, đã lựa chọn được điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời 3 chất DA, BE, PR như sau: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). Detector PDA; pha động ACN:H2O (45:55, v/v); tốc độ dòng 1,5 ml/phút; thể tích bơm mẫu: 10 µl. 2. Thẩm định quy trình định lƣợng. * Tính tương thích hệ thống sắc ký: Tiêm sắc ký 5 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp các chất DA, BE, PR có nồng độ mỗi chất là 20 µg/ml. Chạy sắc ký theo điều kiện đã chọn. Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký. DA BE PR STT tR (phút) Speak (μV.s) tR (phút) Speak (μV.s) tR (phút) Speak (μV.s) 1 9,656 342818 4,556 388354 3,475 404278 2 9,677 343544 4,549 382184 3,454 399624 3 9,673 340630 4,551 385761 3,483 396339 4 9,664 351654 4,544 389145 3,489 401248 5 9,697 348503 4,539 394348 3,467 406105 X 9,673 345430,2 4,548 387958,4 3,474 401518,8 RSD (%) 0,16 1,31 0,14 1,16 0,40 0,97 Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích peak cả 3 chất đều < 2%. Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng để phân tích mẫu với kết quả tin cậy. 22
4. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 * Độ chọn lọc - đặc hiệu: Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp của DA, BE, PR có nồng độ 5 µg/ml, mẫu trắng và mẫu thử. a PR BE DA b PR BE a DA Hình 1: Sắc ký đồ của DA, BE, PR trong mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng. a. Mẫu chuẩn hỗn hợp DA, BE, PR pha trong MeOH. b. Mẫu trắng không có chất phân tích. c. Mẫu thử có chất phân tích. Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của DA, BE và PR không xuất hiện các peak như ở mẫu chuẩn. Các peak của chất phân tích trong mẫu thử cân đối và tách hoàn toàn khỏi peak tạp. Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt và độ đặc hiệu cao. * Khoảng nồng độ tuyến tính: Pha một dãy dung dịch chuẩn DA, BE, PR nồng độ khoảng 5 - 200 µg/ml và chạy sắc ký. Bảng 2: Kết quả xác định mối tương quan giữa nồng độ và diện tích peak của DA, BE và PR. C (µg/ml) 5 20 50 100 150 200 Speak (DA) (μV.s) 81369 342818 747125 1616455 2540421 3436877 Speak (BE) (μV.s) 90786 388354 824518 1790089 2824083 3813497 Speak (PR) (μV.s) 90296 404278 842144 1838438 2891513 3908626 2 y(DA) = 16481x - 830; R = 0,9985 2 Phương trình hồi quy tuyến tính y(BE) = 18325x - 293; R = 0,9983 2 y(PR) = 17255x + 917; R = 0,9978 22
5. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Hình 2: Đường biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ của DA, BE và PR. Diện tích peak và nồng độ DA, BE, PR trong khoảng khảo sát cã tương quan chặt chẽ víi R2 ≈ 1. * Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới: Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn, ngoại suy giới hạn phát hiện của DA, BE và PR lần lượt bằng 0,3 µg/ml; 0,2 µg/ml và 0,2 µg/ml. Giới hạn định lượng dưới của 3 chất DA, BE và PR lần lượt là 1,0 µg/ml; 0,5 µg/ml và 0,5 µg/ml. * Độ chính xác: Pha các mẫu LQC (10 µg/ml), MQC (80 µg/ml) và HQC (160 µg/ml). Mỗi nồng độ pha 5 mẫu độc lập. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. Bảng 3: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPLC. DiÖn e a ë k (µV*s) b STT DA BE PR LQC MQC HQC LQC MQC HQC LQC MQC HQC 1 161547 1317459 2668028 173099 1425516 3023572 167169 1365628 2736538 2 156487 1352527 2689305 177673 1467955 2991015 165014 1323995 2782875 3 163165 1367089 2605408 179561 1476597 2977847 166869 1302562 2828710 4 158745 1305185 2621529 181071 1463504 2961584 171122 1322851 2763549 5 161808 1339778 2649713 177628 1435685 3056980 162608 1352944 2743346 X 160350 1336408 2646797 177806 1453851 3002200 166556 1333596 2771004 SD 2691,7 25231,1 33976,7 2997,7 22036,1 38162,3 3133,9 25353,2 37011,3 RSD (%) 1,68 1,89 1,28 1,68 1,52 1,27 1,88 1,90 1,34 Độ lệch chuẩn tương đối đều, < 2%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác tốt, đáp ứng yêu cầu phân tích. 23
6. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 * Độ đúng: Chúng tôi sử dụng phương pháp thêm chuẩn (DA, BE và PR) vào 2,0 g mẫu tự tạo, để xác định độ đúng. Bảng 4: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC. LƯỢNG LƯỢNG TỶ LỆ LƯỢNG LƯỢNG TỶ LỆ LƯỢNG LƯỢNG TỶ LỆ LOẠI THÊM THU HỒI THU HỒI THÊM VÀO THU HỒI THU HỒI THÊM VÀO THU HỒI THU HỒI CHẤT VÀO (µg) (µg) (%) (µg) (µg) (%) (µg) (µg) (%) 100 95,87 95,87 1000 935,7 93,57 1500 1397,4 93,16 100 93,12 93,12 1000 915,5 91,55 1500 1383,3 92,22 100 89,28 89,28 1000 917,8 91,78 1500 1415,1 94,34 DA 100 93,75 93,75 1000 903,9 90,39 1500 1367,7 91,18 100 95,16 95,16 1000 949,3 94,93 1500 1349,3 89,95 93,44 92,44 92,17 RSD (%) 2,75 1,94 1,85 100 97,8 97,8 1000 958,1 95,81 1500 1453,1 96,87 100 98,3 98,3 1000 963,4 96,34 1500 1456,8 97,12 100 95,7 95,7 1000 952,5 95,25 1500 1384,2 92,28 BE 100 101,2 101,2 1000 913,8 91,38 1500 1376,3 91,75 100 93,1 93,1 1000 891,7 89,17 1500 1427,4 95,16 97,22 93,59 94,64 RSD (%) 2,78 3,01 2,38 100 97,5 97,5 1000 975,4 97,54 1500 1414,2 94,28 100 98,3 98,3 1000 957,3 95,73 1500 1456,7 97,11 100 99,8 99,8 1000 936,7 93,67 1500 1369,8 91,32 PR 100 102,7 102,7 1000 985,3 98,53 1500 1407,8 93,85 100 97,6 97,6 1000 941,6 94,16 1500 1447,8 96,52 99,18 95,93 94,62 RSD (%) 1,94 2,19 2,19 Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình Tỷ lệ thu hồi của DA, BE và PR khá cao, định lượng đồng thời DA, BE và PR bằng trong khoX ảng từ 92 - 100%, cho thấy: phương phương pháp HPLC. Quy trình xử lý mẫu: pháp chiết đã lựa chọn cho phép chiết gần chiết cách thuỷ bằng ethyl acetat (3 lần × 10 như hoàn toàn DA, BE và PR (tû lÖ chiÕt tõ phút/lần); dịch chiết được cô cách thuỷ đến 92,17 - 99,18%) với giá trị RSD < 3%, chứng tỏ cắn và hoà tan cắn trong MeOH để phân tích phương pháp có độ đúng cao. bằng HPLC. Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 24
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2013 µm), detector UV, pha động ACN:H2O 2. Lê Đào Khánh Long. Góp phần tìm hiểu (45:55, v/v), tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích phương pháp định tính phát hiện betamethason và bơm mẫu 10 µl. Quy trình định lượng này đã dexamethason pha trộn trái phép trong chế phẩm được thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn của đông dược. Khoá luận Tốt nghiệp Dược sỹ đại học. Trường Đại học Y - Dược Thành phố Hồ Chí ICH và có thể ứng dụng để kiểm tra các GC Minh. 2009, tr.21-28. trong các chế phẩm thuốc đông dược trên thị 3. Asean. Identification of dexamethasone, trường. betamethasone, hydrocortisone acetate, betamethasone 17-valerate, and triamcinolone acetonide in cosmetic TÀI LIỆU THAM KHẢO products by TLC and HPLC, ACM MAL 07. 4. Ku, Y. R, Wen, K. C, Ho, L. K., Chang, Y. S. 1. Hoàng Thị Hoa. Nghiên cứu phát hiện Solid phase extraction and high performance liquid dexamethason có thể trộn trái phép trong thuốc chromatographic determination of steroids adulterated in đông dược bằng phương pháp sắc ký. Khóa luận traditional Chinese medicines. Journal of Food and Tốt nghiệp Dược sü đại học. Trường Đại học Dược Drug Analysis. 1999, 7 (2), pp.123-130. Hà Nội. 2007, tr.20-30. 25