Y khoa, dược - Xây dựng mô hình ung thư phổi người

Nội dung text: Y khoa, dược - Xây dựng mô hình ung thư phổi người

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 XÂY DỰNG MÔ HÌNH UNG THƢ PHỔI NGƢỜI Nguyễn Lĩnh Toàn*; Hồ Anh Sơn*; Bùi Khắc Cường* TÓM TẮT Bằng kỹ thuật ghép dị loài, đã ghép thành công tế bào ung thư phổi (UTP) người dòng H211 và tạo khối ung thư phát triển trên chuột thiếu hụt miễn dịch “nude mice”. Kết quả: 100% chuột hình thành khối u sau 1 tuần ghép 106 tế bào ung thư H211. Khối u phát triển đạt kích thước trung bình 300 mm3 sau 4 tuần ghép tế bào. Phân tích giải phẫu bệnh lý chứng minh khối u mới tạo thành trên chuột có tế bào đa diện, tăng sản, nhân quái, nhân chia, h×nh ¶nh của ung th• biÓu m« tÕ bµo v¶y. * Từ khóa: Tế bào ung thư dòng H211; Chuột thiếu hụt miễn dịch; Ghép dị loài. ESTABLISHMENT OF HUMAN LUNG CANCER MODEL SUMMARY By xenograft method, we have sucessfully implanted human lung squamous carcinomar cells into subcutanous thigh of athymic mice. Results showed that 10/10 (100%) mice developed tumor after 1 week of injection H211 cell line with 106 cells/mouse. The mean size of tumors were 300 mm3 after transplated 4 weeks. The tumor histologic analysis indicated that the tumors contained the hyperchromasia, nuclear enlargement with atypia, the squamous carcinoma. * Key words: H211; Nude mice; Xenograft. ĐẶT VẤN ĐỀ Đứng trước thách thức về mức độ ác tính, kháng điều trị của UTP, cần có những Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến phương pháp và dược chất mới để điều trị. nhất trên toàn cầu, số ca mắc mới mỗi năm Để có thể ứng dụng các kỹ thuật, vật liệu tăng trung bình 0,5%. Tỷ lệ mắc UTP rất mới trong điều trị ung thư, cần có mô hình khác biệt giữa các nước. Ở Mỹ, mỗi năm có bệnh lý áp dụng cho thử nghiệm tiền lâm khoảng 178.000 trường hợp mắc mới và sàng. Trước đây, các mô hình ung thư được 160.000 ca tử vong do UTP. Nhìn chung, ở tạo ra trên động vật có nguồn gốc đồng loài, các nước, tỷ lệ mắc UTP ở nam nhiều hơn nhưng có hạn chế là các khối u không nữ. Bệnh lý này cũng là nguyên nhân ung thư gây tử vong hàng đầu. Theo báo cáo mang đặc tính sinh học giống như khối u thống kê ở Mỹ, tỷ lệ UTP sống được 5 năm trên người, điều này gây hạn chế rất lớn chỉ 15%. Ở châu Âu, tỷ lệ sống trung bình trong nghiên cứu cơ chế bệnh lý và áp khoảng 10%, con số này cũng được ghi dụng thử nghiệm điều trị các loại ung thư nhận ở các quốc gia đang phát triển (8,9%). người. Do vậy, yêu cầu cấp thiết cần phải có * Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Hoàng Văn Lương 25
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 mô hình động vật bị ung thư mang những Dòng tế bào UTP người H211 (hình 2) đặc tính sinh học ung thư là nguyên bản do công ty ATCC cung cấp (American Type của tế bào ung thư người. Vì vậy, chúng tôi Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, đã tiến hành xây dựng mô hình UTP ng•êi VA 20108, Hoa Kỳ). trên chuột suy giảm miễn dịch, làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn và ứng dụng tiền lâm sàng về UTP người. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu. * Chuột thiếu hụt miễn dịch (nude mice) và điều kiện nuôi: 10 chuột nhắt đực BALB/c thiếu hụt miễn dịch, không có tế bào lympho T (nude mice, Foxn1nu), nhập khẩu từ Công ty Charlie-River (Hoa Kỳ). Chuột được nuôi trong điều kiện Hình 2A: Tế bào UTP người H211 khi mới phòng sạch, không khí được lọc và có áp gieo trong môi trường. lực dương tính. Duy trì nhiệt độ phòng ở 25 ± 0,50C, độ ẩm 55 ± 5%, ánh sáng được tự động điều khiển bật lúc 7h00, tắt lúc 19h00. Thức ăn (Zeigler, Hoa Kỳ) và nước uống được tiệt trùng trước khi sử dụng. Đặt mỗi lồng chuột trên hệ thống giá có thông khí độc lập và lọc qua màng, bảo đảm khả năng cách ly tốt với mầm bệnh (hình 1). Hình 2B: Tế bào H211 phát triển 40% bề mặt môi trường nuôi sau 1 tuần. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Nuôi cấy và ghép tế bào ung thư vào chuột: Nu«i cÊy tÕ bµo UTP ng•êi H211 (c«ng Hình 1: Hệ thống chuồng nuôi chuột ty ATCC, Hoa Kú) trong m«i tr•êng Eagle's lưu thông khí độc lập. Nhiệt độ và Minimum Essential Medium, bæ sung fetal độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ. bovine serum 10%, 1% penicillin vµ streptomycin * Tế bào ung thư: (invitrogen GmbH, Karlsruhe, CHLB §øc), 27
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 1,5 mcg insulin/ml m«i tr•êng. Diện tích mỗi lần cấy chuyển, trên nhiều chai nuôi cấy đạt chai nuôi cấy 75 cm2, được cấy chứa 106 tế 108 tế bào. Thu hoạch tế bào ung thư bằng bào. Nuôi cấy tăng sinh tế bào và thay môi cách dùng Trypsin-EDTA 1X. Cho 2 - 3 ml 0 trường 3 lần/tuần ở điều kiện nhiệt độ 37 C, môi trường nuôi, lấy 10 µl, đếm số lượng CO2 5%. Khi tế bào phát triển đạt 80% tế bào/ml, sau đó đưa về nồng độ 107 tế diện tích, cấy chuyển sang chai mới. Trước bào/ml (hình 2A, B). ghép, rửa tế bào hai lần bằng dung dịch PBS 1X, sau đó tách ra bằng dung dịch 2. Sự phát triển khối UTP ngƣời trên Trypsin-EDTA 1X. Hút dung dịch tế bào ung nude mice. thư đã chuẩn bị vào bơm tiêm 1 ml, số lượng Tiêm 0,1 ml dung dịch tế bào ung thư 7 10 /ml. Cố định chuột, tiêm 0,1 ml vào dưới 107/ml vào dưới da đùi sau bên phải mỗi da đùi phải (106 tế bào/chuột). Thực hiện chuột. Sau khi tiêm tế bào UTP khoảng trong điều kiện vô trùng tuyệt đối. 1 tuần, có thể nhìn thấy khối u bằng mắt * Theo dõi và xác định sự hình thành khối thường. Sau 2 tuần, khối phát triển ngay tại ung thư trên chuột: chỗ tiêm, kích thước khối u có thể đo được Đánh giá sự phát triển khối u tại vị trí bằng thước. Sau 4 tuần, khối u phát triển rõ tiêm (đùi phải) 2 lần/tuần bằng quan sát, sờ dưới da đùi sau phải, lồi lên, chắc và di nắn, đo kích thước khối u bằng thước chính chuyển cùng khối cơ (hình 3A, B). Sau 4 xác NSK. Sau 4 tuần, giết chuột, bộc lộ khối tuần theo dõi, bóc tách khối u. Kết quả 14 u, bóc tách và đo kích thước khối u hình ngày sau ghép tế bào, 100% chuột hình thành và phát triển sau ghép. thành khối u, kÝch th•íc khèi u ®¹t 82,2 ± * Phân tích giải phẫu bệnh lý khối ung 15,2 mm3. Sau 4 tuÇn, c¸c khèi u ph¸t triÓn thư hình thành trên chuột: ®¹t kÝch th•íc trung b×nh 298,9 ± 41,4 mm3. Khối u sau khi bóc tách được bảo quản trong dung dịch formalin 10%, trong vòng 24 - 48 giờ. Tiếp theo, đúc khối paraffin khối u, cắt lát dày 5 μm, nhuộm HE và đọc phân tích kết quả mô ung thư hình thành dưới kính hiển vi quang học. Phân tích những đặc điểm về hình thái học tế bào, cấu trúc mô hình thành, mạch máu, xâm lấn Tiến hành tại Khoa Giải phẫu Bệnh lý, Bệnh viện 103. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Nuôi cấy, tăng sinh tế bào UTP ngƣời dòng H211. Hình 3A: Khèi UTP trªn ®ïi chuét Tế bào UTP người dòng H211 được sau ghÐp 14 ngµy. nuôi tăng sinh trong chai 75 cm2, số lượng 106 tế bào. Theo dõi tế bào phát triển, khi đạt khoảng 80% diện tích đáy chai, chuyển sang chai nuôi cấy mới với tỷ lệ 1:3. Sau 2 28
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 tróc gåm c¸c tÕ bµo h×nh ®a diÖn, s¾p xÕp thµnh những ®¸m hoÆc æ, ng¨n c¸ch bëi v¸ch x¬ máng. C¸c tÕ bµo u cã bµo t•¬ng hÑp, nh©n kh«ng ®Òu, t¨ng s¾c, chÊt nh©n th«, mét sè cã h¹t nh©n râ, cã nhiÒu nh©n chia bÊt th•êng. u cã c¸c vïng bÞ ho¹i tö d¹ng trøng c¸. Kh«ng thÊy h×nh gai nèi vµ cÇu sõng. U x©m lÊn tæ chøc c¬ v©n. §©y lµ h×nh ¶nh ung th• biÓu m« tÕ bµo v¶y biÖt ho¸ võa, x©m lÊn c¬ v©n. Trên thế giới, nhiều quốc gia phát triển đã áp dụng rộng rãi mô hình ghép tế bào Hình 3B: Khèi UTP trªn ®ïi chuét ung thư người trên động vật, phổ biến dùng sau ghÐp 28 ngµy. chuột nhắt thiếu hụt miễn dịch “nude mice” 3. Hình ảnh giải phẫu bệnh lý khối u. trong nghiên cứu ung thư [2, 8]. Từ yêu cầu thực tế ở nước ta cũng như để tiếp cận và mở rộng hợp tác nghiên cứu, chúng tôi đã triển khai và ứng dụng thành công mô hình ghép tạo khối UTP người trên chuột thiếu hụt miễn dịch “nude mice”. Tế bào UTP người dòng H211 của công ty ATCC (Hoa Kỳ) được tăng sinh, phát triển dùng môi trường chuyên dụng đảm bảo đúng quy trình kỹ thuật và hướng dẫn của nhà cung cấp tương tự những kết quả nghiên cứu trước [2, 4]. Kết quả sau 4 lần cấy chuyển tăng sinh đạt số lượng tế bào đủ để ghép Hình 4A: Tế bào ung thư xâm lấn vào cho 10 chuột. Sau 4 tuần ghép tế bào dưới khối cơ đùi (10X). da đùi chuột, khối u phát triển đạt kích thước trung bình 300 mm3. Dễ dàng quan sát thấy tế bào có nhân quái, nhân chia bất thường, ranh giới không rõ, xâm lấn xuống mô cơ vân và các mạch máu tăng sinh mạnh. Thực nghiệm này cũng cho thấy tỷ lệ phát triển khối u thành công đạt 100% chuột được ghép, kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu khác trên thế giới với tỷ lệ thành công rất cao từ 91 - 100% khi ghép tế bào UTP người vào Hình 4B: Tế bào ung thư h×nh ®a diÖn s¾p cơ thể nude mice [3, 6, 7, 8]. xÕp thµnh c¸c ®¸m hoÆc c¸c æ, ®•îc ng¨n c¸ch bëi v¸ch x¬ máng (40X). KẾT LUẬN H×nh ¶nh gi¶i phÉu bÖnh cho thÊy, cÊu 29
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Từ kết quả nghiên cứu ghép tạo khối 4. Jacob D, Davis J, Fang B. Xenograftic ung thư trên 10 chuột thiếu hụt miễn dịch tumor models in mice for cancer research, a “nude mice”, chúng tôi rút ra kết luận: technical review. Gene Ther Mol Biol. 2004, 8, pp.213-219. Đã tạo thành công khối ung thư bằng 5. Knowles BB, et al. Human hepatocellular ghép tế bào UTP người dòng H211 trên carcinoma cell lines secrete the major plasma chuột thiếu hụt miễn dịch bằng kỹ thuật proteins and hepatitis B surface antigen. ghép dị loài “xenograft”. Tỷ lệ tạo thành Science. 1980, 209, pp.497-499. công khối ung thư trên chuột đạt 100%. 6. Singh S, Trevino JG, Bora-Singhal N, Kích thước khối ung thư điển hình phát Coppola D, Haura E, Altiok S, Chellappan SP. triển đạt 300 mm3 sau 4 tuần ghép tế bào. EGFR/Src/Akt signaling modulates Sox2 Giải phẫu bệnh lý chứng minh hình ảnh ung expression and self-renewal of stem-like side- population cells in non-small cell lung cancer. thư biểu mô điển hình. Mol Cancer. 2012, Sep 25, 11 (1), p.73. 7. Song HZ, Yi J, Chen J, Chen LB. Nimotuzumab TÀI LIỆU THAM KHẢO increases chemosensitivity of human lung adenocarcinoma cell lines to docetaxel. Oncol 1. Anh PT, Duc NB. The situation with cancer Res. 2012, 20 (1), pp.39-47. control in Vietnam. Jpn J Clin Oncol. 2002, 32 Suppl, pp.92-97. 8. Xue TC, Chen RX, Han D, Chen J, Xue Q, Gao DM, Sun RX, Tang ZY, Ye SL. Down- 2. Bastide C, Bagnis C, Mannoni P, Hassoun regulation of CXCR7 inhibits the growth J, Bladou F. A nod scid mouse model to study and lung metastasis of human hepatocellular human prostate cancer. Pros Can & Pros Dis. carcinoma cells with highly metastatic potential. 2002, 5, pp.311-315. Exp Ther Med. 2012, Jan, 3 (1), pp.117-123. 3. Fu Q, Cash SE, Andersen JJ, Kennedy CR, Oldenburg DG, Zander VB, Foley GR, Shelley CS. CD43 in the nucleus and cytoplasm of lung cancer is a potential therapeutic target. Int J Cancer. 2012, Sep 27, doi: 10.1002/ijc. 27873. Ngày nhận bài: 30/10/2012 Ngày giao phản biện: 15/11/2012 Ngày giao bản thảo in: 6/12/2012 30
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 31