Xây dựng quy trình xác định đa hình gen Cyp2c19

Nội dung text: Xây dựng quy trình xác định đa hình gen Cyp2c19

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 XÂY D ỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19 Tri ệu Ti ến Sang*; Đào V ăn Đôn*; Tr ần V ăn Khoa* Tr ươ ng Ng ọc Nam*; Lê Th ị H ải Y ến*; Nguy ễn Hoàng Hi ệp** TÓM T ẮT Mục tiêu: xây d ựng thành công quy trình phát hi ện đa hình gen CYP2C19 . Đối t ượng và ph ươ ng pháp: 10 m ẫu máu t ĩnh m ạch c ủa b ệnh nhân (BN) sau đặ t stent độ ng m ạch vành qua da t ại Khoa Tim m ạch, B ệnh vi ện Quân y 103. S ử d ụng ph ươ ng pháp gi ải trình t ự gen d ựa trên nguyên lý c ủa Sanger. Kết qu ả: đã phát hi ện các đa hình c ủa gen CYP2C19 . Kết lu ận: đã xây dựng thành công quy trình xác định đa hình gen CYP2C19 . * T ừ khóa: Gen CY2C19 ; Đặt stent độ ng m ạch vành; Gi ải trình t ự gen. Construction of Protocol for Screening CYP2C19 Polymophism Gene Summary Objectives: To construct successfully protocol screening CYP2C19 polymorphism gene. Subjects and methods: 10 patients with venous blood transfusions were placed at Department of Cardiology, 103 Hospital using a sequencing method based on Sanger's principle. Results: CYP2C19 polymorphism was detected. Conclusion: CYP2C19 gene polymorphism has been successfully established. * Keywords: Gene CYP2C19; Coronary stent; Sequencing. ĐẶT V ẤN ĐỀ kém. Điều này d ẫn đế n có s ự khác nhau trong ph ản ứng chuy ển hóa thu ốc và đáp Cytochrome - P450 - 2C19 (CYP2C19) ứng gi ữa các cá th ể. là m ột enzym thu ộc siêu h ọ cytochrom P450, tham gia vào quá trình chuy ển hóa Clopidogrel là m ột ti ền thu ốc ch ưa có tác d ụng, sau quá trình chuy ển hóa b ởi các ch ất ngo ại lai, bao g ồm các thu ốc CYP2C19 ở gan, clopidogrel s ẽ được kháng ti ểu c ầu nh ư clopidogrel , thu ốc chuy ển hóa thành ch ất có tác d ụng ch ống ố độ ch ng ng kinh, mephenytoin, omeprazol, kết t ập ti ểu c ầu, ng ăn ng ừa c ục máu diazepam và m ột s ố lo ại thu ốc an th ần... đông và gi ảm hình thành huy ết kh ối. Kh ả n ăng chuy ển hóa c ủa CYP2C19 có Vi ệc xác đị nh được ki ểu gen CYP2C19 th ể được phân lo ại nh ư sau: chuy ển hóa có vai trò r ất quan tr ọng trong tiên l ượng đáp siêu nhanh, chuy ển hóa bình th ường, ứng thu ốc, đặ c bi ệt nh ững thu ốc ch ịu sự chuy ển hóa trung gian, ho ặc chuy ển hóa chuy ển hóa qua enzym này nh ư clopidogrel. * H ọc vi ện Quân y ** B ệnh vi ện Quân y 103 Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Tri ệu Ti ến Sang (trieusangk83@yahoo.com.vn) Ngày nh ận bài: 02/06/2017; Ngày phản bi ện đánh giá bài báo: 11/09/2017 Ngày bài báo được đă ng: 26/09/2017 45
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 Một s ố h ướng d ẫn điều tr ị v ề can thi ệp sten động m ạch vành qua da, đảm b ảo tim m ạch đã đề c ập đế n vi ệc c ần làm xét không nhi ễm khu ẩn, ký hi ệu m ẫu và b ảo nghi ệm gen CYP2C19 tr ước khi ch ỉ đị nh qu ản ở điều ki ện -4OC. dùng clopidogrel. Để làm được điều đó, * Tách chi ết ADN t ổng s ố: mỗi phòng thí nghi ệm c ần t ối ưu hóa quy Nguyên lý: s ử d ụng E.Z.N.A blood trình, ổn đị nh điều ki ện thí nghi ệm tr ước ADN mini kit để tách ADN t ổng s ố. khi áp d ụng quy trình m ột cách th ường quy. Nguyên lý c ủa kít này d ựa trên s ự h ấp Với mong mu ốn đưa ra quy trình xác th ụ ch ọn l ọc c ủa axít nucleic vào màng định ki ểu gen CYP2C19 , góp ph ần nâng silica-gel trong điều ki ện nh ất đị nh v ới 4 cao hi ệu qu ả điều tr ị, gi ảm bi ến ch ứng và giai đoạn chính: phá v ỡ t ế bào để gi ải nâng cao ch ất l ượng cu ộc s ống ng ười phóng ADN; ADN liên k ết v ới màng silica- bệnh, chúng tôi th ực hi ện nghiên c ứu này nh ằm: Xây d ựng quy trình xác định đa gel; lo ại b ỏ t ạp ch ất trên màng silica-gel hình gen CYP2C19. với Wash Buffer; thu ADN. * Ki ểm tra ch ất l ượng ADN t ổng s ố: ĐỐI T ƯỢNG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C ỨU Nguyên lý: ph ươ ng pháp điện di d ựa trên nguyên t ắc ho ạt độ ng nh ờ vào s ức 1. Đối t ượng nghiên c ứu. kéo c ủa điện tr ường tác độ ng vào phân 10 m ẫu máu t ĩnh m ạch c ủa BN sau đặ t tử tích điện và kích th ước l ỗ c ủa th ể n ền. stent động m ạch vành qua da t ại Khoa Sử d ụng m ột dung d ịch đệ m để d ẫn điện Tim m ạch, B ệnh vi ện Quân y 103. và t ạo điện tr ường đề . B ản gel giúp phân Địa điểm nghiên c ứu: Phòng thí tách các phân t ử và thu ốc nhu ộm khác nghi ệm B ộ môn Sinh h ọc và Di truy ền Y nhau để phát hi ện v ị trí phân t ử trên gel học, H ọc vi ện Quân y. sau khi điện di. T ốc độ di chuy ển c ủa 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. ADN trong điện tr ường ph ụ thu ộc vào Áp d ụng ph ươ ng pháp gi ải trình t ự kích th ước đoạn ADN, điện tích, m ức độ dựa trên nguyên lý Sanger, ti ến hành xo ắn và d ạng phân t ử. Nh ư v ậy, so sánh theo 7 b ước: kích th ước các m ẫu ADN v ới thang chu ẩn - X ử lý mẫu. sẽ đánh giá được ch ất l ượng ADN. - Tách chi ết ADN t ổng s ố. * Khu ếch đạ i đoạn gen ch ứa SNP - Ki ểm tra ch ất l ượng ADN t ổng s ố. quan tâm: - Khu ếch đạ i đoạn gen ch ứa các SNP: Nguyên lý: s ử d ụng k ỹ thu ật PCR để CYP2C19*2, CYP2C19*3. khu ếch đạ i ADN. Dùng enzym polymerase - Ki ểm tra ch ất l ượng s ản ph ẩm PCR. để t ổng h ợp ADN m ới t ừ 1 ADN khuôn ban đầu. Thành ph ần chính c ủa ph ản - Tinh s ạch, gi ải trình t ự. ứng g ồm: ADN khuôn, m ồi, dung d ịch - Phân tích, đánh giá k ết qu ả. đệm, 4 lo ại deoxyrinucleotid triphosphate * X ử lý m ẫu: (dNTP), ADN polymerase. V ới 3 giai đoạn Cách l ấy m ẫu: l ấy 4 ml máu t ừ t ĩnh chính: giai đoạn bi ến tính, giai đoạn g ắn mạch BN vào ống l ấy m ẫu EDTA sau đặ t mồi và giai đoạn kéo dài. 46
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 * Ki ểm tra ch ất l ượng s ản ph ẩm PCR: polymerase và dideoxynucleotid (ddNTP) Sử d ụng ph ươ ng pháp điện di, nguyên tham gia vào quá trình t ổng h ợp ADN. Khi lý và cách ti ến hành t ươ ng t ự nh ư điện di ADN polymerase xúc tác kéo dài m ạch ADN m ới g ặp nucleotid không có nhóm ki ểm tra ch ất l ượng ADN sau khi tách 3’OH (dideoxynucleotid), ph ản ứng t ổng chi ết. Điện di trên giá th ể là agarose pha hợp d ừng l ại và t ạo ra các đoạn ADN trong đệm TAE 1X. chênh l ệch nhau 1 nucleotid. Điện di đoạn * Tinh s ạch và gi ải trình t ự ADN: ADN giúp xác định được trình t ự ADN [3]. Nguyên lý: ph ươ ng pháp gi ải trình t ự * Phân tích k ết qu ả: d ựa trên ph ần Sanger d ựa vào ho ạt độ ng c ủa enzym ADN mềm BioEdit. KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU VÀ BÀN LU ẬN 1. K ết qu ả tách chi ết ADN. Bảng 1: Mẫu Nồng độ ADN (ng/µl) A260 /A 280 1 19,42 1,7 2 25,62 1,8 3 19,49 1,85 4 19,33 2,72 5 27,9 1,79 6 26,24 1,9 7 19,6 2,03 8 22,51 2,13 9 24,1 2,04 10 30,98 2,1 Nồng độ ADN trung bình 26.874 ng/µl. T ỷ l ệ A 260 /A 280 trung bình 1.923 (trong kho ảng 1,8 - 2), nhìn chung d ịch chi ết ADN s ạch và đủ n ồng độ cho các nghiên c ứu ti ếp theo. 2. Kết qu ả điện di s ản ph ẩm PCR. Chúng tôi đã thi ết k ế được 2 c ặp m ồi dùng để xác đị nh đa hình gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 , đã t ối ưu được th ời gian và nhi ệt độ ph ản ứng c ủa 2 c ặp m ồi. CYP *2-F: 5’-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3’ CYP *2-R: 5’-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3’ CYP *3-F: 5’- AAATTGTTTCCAACATTTAGCT-3’ CYP *3-R: 5’-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3’ Chu trình nhi ệt ph ản ứng: 96 oC - 1 phút, 25 chu k ỳ [96 oC - 10 giây, 50 oC - 5 giây, 60 oC - 4 phút], 4 oC. 47
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 Thành ph ần ph ản ứng: master mix (promega): 12,5 µl; primer F: 0,5 µl; primer R: 0,5 µl; n ước deion: 6,5 µl; ADN 5 µl. Hình 1: K ết qu ả điện di s ản ph ẩm PCR. (a) Gen CYP2C19*2 Gen CYP2C19*3 (F-/F+: các đối ch ứng âm/d ươ ng; M: Marker; 01 - 06: th ứ t ự các m ẫu) Các m ẫu có ch ất l ượng t ốt cho b ăng điện di sáng, rõ, có 1 b ăng duy nh ất tươ ng ứng v ới b ăng 140 bp (*2), 240 bp (*3). Đố i ch ứng âm không xu ất hi ện b ăng ADN nào, ch ứng t ỏ k ết qu ả PCR đáng tin c ậy. 3. K ết qu ả gi ải trình t ự gen CYP2C19 . * Kết qu ả gi ải trình t ự gen CYP2C19*2: Hình 2: K ết qu ả gi ải trình t ự gen CYP2C19*2 c ủa m ẫu s ố 3. Không xu ất hi ện tín hi ệu A, ch ỉ có tín hi ệu G, gen đồ ng h ợp v ới ki ểu gen *1/*1 quy định chuy ển hóa bình th ường. Hình 3: K ết qu ả gi ải trình t ự gen CYP2C19*2 c ủa m ẫu s ố 1. Đồng th ời xu ất hi ện tín hi ệu A và G, gen d ị h ợp v ới ki ểu gen *1/*2 quy đị nh chuy ển hóa trung bình. 48
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 Hình 4: K ết qu ả gi ải trình t ự gen CYP2C19*2 c ủa m ẫu s ố 5. Không xu ất hi ện tín hi ệu G, ch ỉ có tín hi ệu A, gen đồ ng h ợp v ới ki ểu gen *2/*2 quy định chuy ển hóa kém. * K ết qu ả gi ải trình t ự gen CYP2C19*3: Hình 5: K ết qu ả gi ải trình t ự gen CYP2C19*3 c ủa m ẫu s ố 1. Không xu ất hi ện tín hi ệu A, ch ỉ có tín hi ệu G, gen đồ ng h ợp v ới ki ểu gen *1/*1 quy định chuy ển hóa bình th ường. Hình 6: K ết qu ả gi ải trình t ự gen CYP2C19*3 c ủa m ẫu s ố 6. Đồng th ời xu ất hi ện tín hi ệu A và G, gen d ị h ợp với ki ểu gen *1/*3 quy đị nh chuy ển hóa trung bình. 49
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 4. K ết qu ả b ước đầ u phân tích đa cỡ m ẫu khiêm t ốn nên ch ưa đư a ra được hình gen CYP2C19*2, *3. tần s ố phân b ố ki ểu gen CYP2C19 ở Bảng 4: K ết qu ả phân tích đa hình ki ểu qu ần th ể BN đặ t stent m ạch vành. Chúng gen CYP2C19*3 . tôi ki ến ngh ị ti ếp t ục m ở r ộng c ỡ m ẫu nghiên c ứu để cung c ấp được t ần s ố ki ểu Ki ểu hình Ki ểu gen Tổng Tỷ l ệ gen CYP2C19 mang tính đại di ện cho Chuy ển hóa bình *1/*1 4 4/10 qu ần th ể BN đặ t stent m ạch vành. th ường TÀI LI ỆU THAM KH ẢO Chuy ển hóa trung *1/*2 4 4/10 bình *1/*3 1. Collet J.P, Hulot J.S, Pena A et al. *2/*2 Cytochrome P450 2C19 polymorphism in young patients treated with clopidogrel after Chuy ển hóa kém *2/*3 2 2/10 myocardial infarction: a cohort study. Lancet. *3/*3 2009, 373 (9660), pp.309-317. Dựa vào k ết qu ả phân tích đa hình gen 2. Lee S.S, Lee S.J et al. Comparisons of CYP2C19*2,*3 , b ước đầ u rút ra: t ỷ l ệ BN CYP2C19 genetic polymorphisms between mang ki ểu gen chuy ển hóa bình th ường Korean and Vietnamese populations. bằng v ới BN mang ki ểu gen chuy ển hóa Therapeutic Drug Monitoring. 2007, 29 (4), trung bình (t ỷ l ệ BN có ki ểu gen chuy ển pp.455-459. hóa bình th ường *1/*1 là 4/10, t ỷ l ệ BN có 3. Sanger F, Coulson A.R. A rapid method ki ểu gen chuy ển hóa trung bình *1/*2 for determining sequences in DNA by primed ho ặc *1/*3 là 4/10). Trong đó, t ỷ l ệ gi ữa synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. ki ểu gen *1/*1 và *1/*2, *1/*3 c ũng x ấp x ỉ 1975, 94 (4), pp.441-448. 1:1. 4. Yu Chen, Xiaohong Huang et al. Both KẾT LU ẬN PON1 QQ192R and CYP2C19*2 influence platelet reponse to clopidogrel and ischemic Đã xây d ựng thành công quy trình xét events in Chinese patients undergoing nghi ệm gen CYP2C19*2, *3 trên 10 m ẫu percuteaneous coronary intervention. Int J máu t ĩnh m ạch c ủa BN đặ t stent m ạch Clin Exp Med. 2015, 8 (6), pp.9266-9274. vành qua da. 5. Simon T, Verstuyft C, Mary-Krause M et KI ẾN NGH Ị al. Genetic determinants of response to Do th ời gian th ực hi ện đề tài t ươ ng đối clopidogrel and cardiovascular events. N Engl ng ắn, đề tài phân tích ki ểu gen trên m ột J Med. 2009, 360 (4), pp.363-375. 50