Xây dựng quy trình phân tích gen NPHS2 ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát

Nội dung text: Xây dựng quy trình phân tích gen NPHS2 ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 62-67 Xây dựng quy trình phân tích gen NPHS2 ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát Phạm Thị Hồng Nhung, Vũ Vân Nga, Nguyễn Thị Thùy Linh, Đỗ Thế Hoành, Phạm Văn Đếm, Đinh Đoàn Long, Vũ Thị Thơm* Khoa Y Dược, Đai học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 03 tháng 8 năm 2017 Chỉnh sửa ngày 24 tháng 10 năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 01 tháng 12 năm 2017 Tóm tắt: Protein podocin được mã hóa bởi gen NPHS2 có vai trò quan trọng trong hiện tượng kháng corticoid trong điều trị hội chứng thận hư. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy trình phân tích các đa hình di truyền thuộc gen NPHS2 trên 149 bệnh nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát. Phương pháp nghiên cứu chính được sử dụng bao gồm tách DNA tổng số từ mẫu ngoại vi, khuếch đại bằng PCR, xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự Sanger. Kết quả nghiên cứu cho thấy chúng tôi đã xây dựng được quy trình xác định được 251 SNP nằm trong 6 exon đầu của gen NPHS2, trong đó có 2 đột biến mới được phát hiện. Các kết quả này sẽ cung cấp công cụ và số liệu cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm xác định vai trò của các đa hình di truyền NPHS2 đối với đáp ứng thuốc corticoid trong điều trị hội chứng thận hư. Từ khóa: NPHS2, podocin, hội chứng thận hư tiên phát. 1. Đặt vấn đề của gen NPHS2, 56 đột biến tập trung từ exon 1 đến exon 6 được chứng minh có liên quan chặt Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) là chẽ tới HCTHTP [6]. Xác định các đột biến nguyên nhân thường gặp nhất gây protein niệu trong gen NPHS2 có thể cho phép các bác sĩ ở trẻ em, yếu tố nguy cơ chính dẫn đến suy lâm sàng tránh các điều trị không cần thiết bằng giảm chức năng thận [1, 2]. HCTHTP thường corticoid, hạn chế nhiều biến chứng do thuốc và rất cảm thụ với liệu pháp steroid, tuy nhiên việc giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân [7]. điều trị kéo dài bằng corticoid gây ra nhiều tác Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu dụng phụ. Bên cạnh đó, một tỉ lệ không nhỏ nào về đa hình gen NPHS2 cũng như quy trình (10-20% trường hợp) bệnh nhân mắc HCTHTP phân tích gen này. Từ nhu cầu lâm sàng, chúng kháng corticoid có nguy cơ cao tiến triển thành tôi tiến hành đề tài nghiên cứu nhằm xây dựng suy thận giai đoạn cuối [3]. quy trình phân tích các đột biến nằm trong 6 Trong vài năm gần đây, nhiều gen đã được exon đầu của gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh chứng minh có liên quan đến HCTHTP kháng nhân mắc HCTHTP. corticoid, đặc biệt là các đột biến thuộc gen NPHS2 mã hóa cho protein podocin [4, 5]. Trong 89 đột biến điểm phát hiện trên 8 exon 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu _______ Tác giả liên hệ. ĐT.: 84-1677968818. Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm: Email: thomtbk5@gmail.com 149 mẫu máu toàn phần lấy từ tĩnh mạch của bênh nhân nhi mắc hội chứng thận hư thu tại 62
2. P.T.H. Nhung và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 62-67 63 Bệnh viện Nhi trung ương. Các mẫu máu chống giây, gắn mồi trong 30 giây, 72˚C trong 1 phút; đông bằng EDTA, bảo quản ở -20oC đến khi thời gian kéo dài cuối 72˚C trong 5 phút. Sản phân tích gen. phẩm PCR được đánh giá bằng phương pháp Tách chiết DNA tổng số:sử dụng E.Z.N.A điện di trên gel agarose 1,5%. blood DNA Mini Kit(Omega, Mỹ) theo quy trình Xác định kiểu gen 6 exon của gen NPHS2 khuyến cáo của hãng. DNA tổng sốđược kiểm tra bằng giải trình tự: 20 µl sản phẩm được gửi và đánh giá thông qua điện di trên gel agarose và giải trình tự tại hãng IDT (Malaysia). Kết quả đo OD tại bước sóng 260 nm và 280 nm. giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit Thiết kế mồi đặc hiệu cho 6 exon của gen version 7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi NPHS2: sử dụng phần mềm PerlPrimer version bệnh nhân. 1.1.1, chúng tôi tự thiết kế các mồi nhân dòng Thí nghiệm được thực hiện trên các thiết bị exon 2, 3 và 4 và đặt tổng hợp tại hãng IDT đạt tiêu chuẩn tại Phòng thí nghiệm của Khoa Y (Mỹ). Các cặp mồi dùng cho nhân dòng exon 1, Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. 5 và 6 sử dụng trình tự công bố bởi Basiratnia năm 2013 [8]. Trình tự mồi được trình bày trong bảng 1. 3. Kết quả Bảng 1. Trình tự mồi nhân dòng gen NPHS2 Tách chiết DNA tổng số: Nồng độ DNA Độ dài thu từ 149 mẫu máu dao động từ 31 - 350 ng/µl, Exon Trình tự mồi sản có độ tinh sạch cao với chỉ số OD260/280thu được phẩm từ 1,7 - 2,1. Kết quả điện di trên gel agarose cho GCA GCG ACT CCA CAG GGA thấy đã thu được lượng DNA tổng số đáng kể, 1 CT 414 bp TCC ACC TTA TCT GAC GCC CC ít bị đứt gãy với băng khá rõ ràng (Hình 1). CTCTGACTACTCTGATTTGACTT 2 438 bp CTCAAATGTGAACAGGAAGCC CTA GGA TCA TTC TTA TGC CA 3 GAGGTCCATATTACA AAT CTG 238 bp C TCC CTG TTT ATA CCTATT GTC 4 C 475 bp CCC ATT CCC TAG ATT GCC Hình 1. Ảnh điện di DNA tổng số trên gel AAA GGA GCC CAA GAA TCA agarose 0,7%. Làn M: Lamda DNA/HindIII AG 5 292 bp marker. Làn 01-11: mẫu DNA tổng số thu của AAA TAT TTC AGC ATA TTG bênh nhân có mã số tương ứng. GCC GTT TAG GCA TGC TCT CCT C Nhân dòng 6 exon đầu thuộc gen NPHS2 6 GATATGGCTATAGTA CTC AGT 228 bp bằng PCR G Chúng tôi tiến hành PCR với 10 nhiệt độ Nhân dòng 6 exon của gen NPHS2 bằng dao động quanh nhiệt độ gắn mồi được hãng khuyến cáo. Kết quả điện di ở hình 2 cho thấy PCR: Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn 0 định, chúng tôi xác định nhiệt độ gắn mồi, nồng 56 C là nhiệt độ cho phép nhân dòng đặc hiệu độ DNA hoạt động tối ưu trong phản ứng PCR với một băng DNA hiện hình duy nhất cho cả 6 sử dụng 0.2 mM dNTP Mix, 0,05 u/µl Pfu exon nghiên cứu. DNA polymerase (Thermo Scientific). Chu Chúng tôi các thực hiện PCR ở các nồng độ trình nhiệt gồm 3 giai đoạn: biến tính ban đầu DNA lần lượt là 5,10,50,100 và 500 ng/µl. Kết 95˚C trong 3 phút; 35 chu kì: 95˚C trong 30 quả điện di ở hình 3 cho thấy với nồng độ DNA từ 50-100 ng/µl phản ứng nhân dòng đặc hiệu
3. 64 P.T.H. Nhung và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 62-67 xảy ra với lượng sản phẩm lớn thể hiện ở các 5 (các SNP nằm giữa rs370260554 và băng DNA sáng rõ. rs766516719) và 17 SNP trên exon 6 (các SNP nằm giữa rs149786692 và rs773598807). Hình 3. Ảnh điện di sản phẩm PCR với nồng độ DNA khác nhau trên 6 exon NPHS2. Làn M: marker, ĐC -: đối chứng âm, kí hiệu trên các giếng: nồng độ DNA các mẫu (ng/µl) Chúng tôi cũng phát hiện 2 đa hình mới chưa được công bố: 1 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp AT ở sau 4 Nu của rs 772151217 trên exon 2 và 1 bệnh nhân có kiểu gen TT ở sau 2 Nu của rs786204708 trên exon 3. Một số kết quả đọc kiểu gen từ giải trình tự của một số mẫu được thể hiện trong Hình 4. Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi trên 6 exon NPHS2. Làn M: marker, ĐC +: đối chứng dương, ĐC -: đối chứng âm, kí hiệu trên các giếng: nhiệt độ gắn mồi sử dụng cho các mẫu (0C). Xác định kiểu gen 6 exon đầu thuộc gen NPHS2 bằng giải trình tự Dựa vào kết quả giải trình tự kết hợp với cơ sở dữ liệu trên NCBI, chúng tôi xác định được 72 SNP trên exon 1 (các SNP nằm giữa rs144425595 và rs568294841), 22 SNP trên exon 2 (các SNP nằm giữa rs574043805 và rs370433996), 32 SNP trên exon 3 (các SNP Hình 4. Một số đa hình phát hiện trên NPHS2. nằm giữa rs778895897 và rs767605271), 37 A. Các kiểu gen của đa hình rs3738423;B. Đột SNP trên exon 4 (các SNP nằm giữa biến mới trên exon 2 và 3 rs41267604 và rs577996273), 49 SNP trên exon
4. P.T.H. Nhung và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 62-67 65 4. Thảo luận chứng thận hư kháng corticoid tại Bệnh viện Ali Asghar (Iran) và nghiên cứu của Maruyama Hiện nay có rất nhiều các phương pháp xác trên cả 8 exon ở 36 trẻ em Nhật Bản mắc định các đa hình di truyền trênAND như kĩ HCTH kháng corticosteroid [9, 10]. Nghiên cứu thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn về HCTH kháng corticosteroid đối với một số (Restriction fragment length polymorphism, nhóm người châu Âu cho thấy tỉ lệ xuất hiện viết tắt là RFLP), kĩ thuật sử dụng đầu dò ADN đột biến gen NPHS2cũng không cao, từ 12-19% (DNA- probe), kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn [11-13]. (single strand conformational polymorphism, Quy trình được xây dựng trong nghiên cứu viết tắt là SSCP), giải trình tự, sắc kí lỏng cao này sẽ là công cụ hỗ trợ các nghiên cứu về mối áp biến tính (Denaturing high performance liên quan giữa kiểu gen NPHS2 và HCTH, một liquid chromatography, viết tắt là DHPLC), mảng nghiên cứu vẫn cần bổ sung thêm nhiều chip ADN (SNP microarray). Tuy nhiên,giải dẫn liệu và hoàn toàn chưa được đánh giá ở trình tự vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định Việt Nam. Nghiên cứu ở trẻ em Ai Cập mắc chính xác cùng lúc tất cả các đa hình trên phân HCTH kháng corticosteroid không có tiền sử đoạn cần phân tích, phù hợp cho các nghiên cứu gia đình cho thấy khả năng liên quan giữa một chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh số đột biến gen NPHS2đến tiên lượng kém lý quan tâm. Bên cạnh đó, giải trình tự xác định thuận lợi của những bệnh nhân này [14]. được sự xuất hiện của đột biến, cung cấp dữ Nghiên cứu 484 bệnh nhân mắc hội chứng thận liệu kiểu gen đầy đủ của đối tượng tham gia hư ở Nam Ấn Độ phát hiện 4 đột biến NPHS2 nghiên cứu. là rs74315345,rs869025495,rs74315342 và Áp dụng phân tích trên 149 bệnh nhân cho rs74315346, chỉ xuất hiện trong nhóm kháng thấy quy trình phân tích gen của chúng tôi có corticoid mà không xuất hiện trong nhóm nhạy tính ổn định, dễ dàng lặp lại với độ chính xác cảm với corticoid [15]. Ở Việt Nam, chúng tôi cao. Phản ứng nhân dòng gen xảy ra với độ khuyến nghị mở rộng thực hiện các nghiên cứu nhạy cao chỉ với lượng DNA lớn hơn 10 ng/µl tiếp theo kết hợp với các dữ liệu cận lâm sàng (hình 3). và lâm sàng về HCTHTP để đánh giá mối liên Nhằm đưa quy trình có thể sử dụng tại các quan giữa các đa hình di truyền NPHS2đối với phòng khám và cơ sở nghiên cứu có thiết bị phù đáp ứng thuốc corticoid trong điều trị HCTH. hợp, chúng tôi đã cố gắng đơn giản hóa quy trình. DNA được tách từ mẫu máu toàn phần, là dạng mẫu dễ thu thập tại các cơ sở khám chữa 5. Kết luận bệnh. Chúng tôi cũng đã tự thiết kế một số cặp mồi để phản ứng nhân dòng gen có thể tiến Chúng tôi đã xây dựng được quy trình phân hành với các điều kiện về thành phần, nhiệt độ tích gen cho exon 1 đến 6 thuộc gen NPHS2 sử dùng chung được cho việc nhân dòng cả 6 dụng mẫu máu toàn phần. Quy trình đã được áp exon.Việc tối ưu được các điều kiện như vậy có dụng thành công trên 149 bệnh nhân nhi mắc ý nghĩa quan trọng trong ứng dụng thực tế vì hội chứng thận hư tiên phát. tiết kiệm được thời gian và công sức thao tác. Trong 149 bệnh nhân nghiên cứu, ngoài hai đột biến mới nằm trên exon 2 và exon 3,chúng Lời cảm ơn tôi thấy có 7 SNP có tính đa hình trên exon 1 - 4 là rs1079292, rs758564490, rs3738423, Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của rs200437667, rs12401711, rs12401708 Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số vàrs528833893; exon 5,6 có tính đồng hình. QG.16.23 để thực hiện nghiên cứu này. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Hasan Otukesh trên 20 bệnh nhân nhi mắc hội
5. 66 P.T.H. Nhung và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 62-67 Tài liệu tham khảo [8] M. Basiratnia, M. Yavarian, S. Torabinezhad, and A. Erjaee: “NPHS2 gene in steroid-resistant [1] Weber S, Gribouval O, Esquivel EL et nephrotic syndrome: prevalence, clinical course, al, “NPHS2 mutation analysis shows genetic and mutational spectrum in South-West Iranian heterogeneity of steroid-resistant nephrotic children.” Iran. J. Kidney Dis. vol. 7, no. 5, syndrome and low post-transplant pp. 357-62, 2013. recurrence”, Kidney Int 2004; 66 : 571- 579. [9] Hasan Otukesh Behzad Ghazanfari, [2] Arbeitsgemeinschaft fur Padiatrische Seyed-Mohammad Fereshtehnejad et al (2009), Nephrologie. Lancet. 1988;1(8582):380–383. “NPHS2 Mutations in Children with Steroid-Resistant Nephrotic syndrome”, Iranian [3] Ruf RG, Lichtenberger A, Karle SM et Journal of Kidney Diseases, 3, tr. 99-102. al, “Patients with mutations in NPHS2 (podocin) do not respond to standard steroid treatment of [10] Maruyama K. Iuima K., Ikeda M et al (2003), nephrotic syndrome”, J Am Soc “NPHS2 mutations in sporadic steroid‐resistant Nephrol 2004; 15 : 722 -732. nephrotic syndrome in Japanese children”, Pediatr [4] Severine Roselli, Imane Moutkine, Olivier Nephrol, 18, tr. 412‐6. Gribouval, Alexandre Brenmerah, Corinne [11] Weber S Gribouval O, Esquivel EL et al (2004), Antignac, “Plasma membrane targeting of Podocin “NPHS2 mutation analysis shows genetic through the classical exocytic pathway: Effect of heterogeneity of steroid resistant nephritic syndrome NPHS2 mutations”, TRafic 2004; 5:37-44. and low post transplant recurrence”, Kidney [5] Maddalena Gigante, Matteo Piemontese, Loreto International Supplements 66(2), tr. 571-579. Gesualdo, Achille Iolasscon, Filippo Acucella, [12] Ruf RG Lichtenberger A, Karle SM, Haas JP, et “Molecular and Genetic Basic of Inherited al. (2004), “Patients with mutations in NPHS2 nephrotic syndrome”, International Journal of (podocin) do not respond to standard steroid Nephrology. 2011; vol(2011):1-15. treatment of nephrotic syndrome”, J. Am. Soc. [6] Kalman Tory, Dora K Menyhard, Stephanie Nephrol., 15, tr. 722-732. Woerner, Fabien Nevo, Olivier Gribouval, Andrea [13] Caridi G. Bertelli R., Di Duca M et al (2003), Kerti, Pal Straner, Christelle Arrondel, Evelyne “Broadening the spectrum of diseases related to Huynh Cong, Tivadar Tulassay, Geraldine Mollet, podocin mutations”, J Am Soc Nephrol, 14, tr. Andras Perczel, Corinne Antignac, “Mutation 1278‐86. dependent recessive inheritance of NPHS2 [14] Bakr A Yehia S, El-Ghannam D, et al (2008), associated steroid resistant nephritic syndrome”, “NPHS2 mutations”, Indian J Pediatr., 75, tr. Nature Genetics. 2013; 46(3): 299-304. 135-8. [7] Karle SM, Uetz B, Ronner V, Glaeser L, [15] Jaffer A, Unnisa W, Raju DS, Jahan P., “NPHS2 Hildebrandt F, Fuchshuber A, “Novel mutations mutation analysis and primary nephrotic in NPHS2 detected in both familial and sporadic syndrome in southern Indians”, Nephrology steroid-resistant nephrotic syndrome”, J Am Soc 2014 Jul;19(7): 398-403. Nephrol 2002; 13: 388 -393.
6. P.T.H. Nhung và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 62-67 67 Establishing the Genotyping of NPHS2 Polymorphisms in Patients with Primary Nephrotic Syndrome Pham Thi Hong Nhung, Vu Van Nga, Nguyen Thi Thuy Linh, Do The Hoanh, Pham Van Dem, Dinh Doan Long, Vu Thi Thom VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Abstract: Podocin protein is encoded by the NPHS2 gene is largely responsible for resistance to corticosteroid in pharmacological treatment of nephrotic syndrome. Therefore, we have constructed the genotyping test of NPHS2 polymorphisms on 149 pediatric patients with primary nephrotic syndrome. Main methods consisted of DNA extraction from peripheral blood samples, polymerase chain reaction (PCR) and Sanger sequencing. In my study, 251 SNPs from 6 exons and 2 new mutations have detected by genotyping test. These results will provide helpful tool and data for further research to determine the role of NPHS2 polymorphisms with corticosteroid response in the treatment of nephrotic syndrome. Keywords: NPHS2, podocin, primary nephrotic syndrome.