Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nénbao phim 100 mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò diode - array

Nội dung text: Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nénbao phim 100 mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò diode - array

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 41-49 Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nénbao phim 100 mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò diode-array Nguyễn Thị Thanh Bình*, Đặng Ngọc Anh, Trần Mai Anh, Nguyễn Thanh Hải Khoa Y Dược, Đai học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 30 tháng 10 năm 2017 Chỉnh sửa ngày 14 tháng 11 năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 06 tháng 12 năm 2017 Tóm tắt: Trong nghiên cứu này chúng tôi đã xây dựng được quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100 mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò diode-array theo hướng dẫn của Cơ quan quản lý thuốc châu Âu và Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các yêu cầu kỹ thuật để đăng ký dược phẩm sử dụng trên người. Pha tĩnh được sử dụng là cột silica gel pha đảo C8 (5 μm, 120 Å, 4,6×150 mm), pha động là hỗn hợp acetonitril : nước : acid acetic băng với tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5, tốc độ dòng 1 ml/phút. Mẫu được tiêm với thể tích 10 µl, thời gian sắc ký 8 phút, bước sóng phát hiện 247 nm. Thời gian lưu của flurbiprofen là 3,73 phút. Kết quả thực nghiệm cho thấy trong khoảng nồng độ từ 2 - 20 μg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ dung dịch x (μg/ml) theo phương trình y = 0,680x với hệ số xác định R2 = 0,9993. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,05 và 0,15 μg/ml. Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với flurbiprofen, có độ đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, độ lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại ≤ 1,71%, độ lệch chuẩn tương đối của độ chính xác trung gian ≤ 2,34%. Từ khóa: Flurbiprofen, định lượng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, đầu dò diode-array. 1. Đặt vấn đề khoa nhằm ngăn ngừa và làm giảm co đồng tử trong lúc mổ [1-5]. Một tính chất đáng lưu ý Flurbiprofen là dẫn xuất của axit propionic của flurbiprofen là rất kém tan trong nước, thuộc nhóm thuốc chống viêm không steroid chính vì vậy, việc bào chế các hệ dẫn thuốc (NSAID) với tác dụng giảm đau, hạ sốt. kích thước nano có cấu trúc lipid như nanolipid Flurbiprofen được sử dụng bằng đường uống để rắn, nhũ tương nano, là hướng nghiên cứu điều trị tấn công trong các bệnh viêm gân cấp đang được quan tâm trên thế giới [6-9]. tính, viêm xương khớp cấp tính, đau thắt lưng. Viên nén và gel dùng ngoài chứa flurbiprofen có tác dụng điều trị triệu chứng của bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính khớp. Thuốc nhỏ mắt flurbiprofen được sử dụng tại chỗ trước các phẫu thuật nhãn _______ Tác giả liên hệ. ĐT.: 84-1687768293. Email: binhnguyen@vnu.edu.vn Hình 1. Công thức cấu tạo flurbiprofen. 4 1
2. 42 N.T.T. Bình và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 41-49 Hiện nay flurbiprofen được sử dụng rộng (ACN) đạt tiêu chuẩn HPLC được mua từ nhà rãi ở nhiều nước, đặc biệt là các nước châu Âu sản xuất Merck KGaA, Đức. Nước (H2O) được và Bắc Mỹ dưới nhiều tên thương mại khác tinh chế bằng thiết bị Thermo Scientific nhau như Antadys, Flufen, Maprofen, Ocufen, GenPure UV-TOC đạt điện trở suất 18,2 M Zentofen, Tuy nhiên, các thuốc này lại chưa Ω.m. Mẫu dược phẩm được định lượng là viên phổ biến ở Việt Nam, trong dược điển Việt nén bao phim Anadys 100 mg (Theramex, Nam IV cũng không có chuyên luận về Pháp; lot: 2M653 05 2015). flurbiprofen. Cho đến thời điểm hiện tại, trong nước chưa có nghiên cứu nào về flurbiprofen 2.2. Thiết bị, dụng cụ được công bố. Như vậy, phát triển các nghiên Thiết bị được sử dụng là hệ thống HPLC cứu về flurbiprofen là một hướng mới tại Việt Ultimate 3000 - Dionex (Thermo Scientific, Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thêm một Hoa Kỳ) trang bị bốn bơm cao áp và bộ phận lựa chọn thuốc trong điều trị. Xây dựng phương tiêm mẫu tự động. Đầu dò DAD 3000 Dionex pháp định lượng flurbiprofen theo tiêu chuẩn sử dụng đèn Deuterium cho khoảng UV và quốc tế là công việc hết sức cần thiết nhằm tungsten cho khoảng VIS. Cột silica gel pha đảo kiểm soát chất lượng thuốc đồng thời tạo tiền Thermo Scientific Acclaim 120 C18 và C8 có đề cho các nghiên cứu tiếp theo như bào chế, cùng kích thước hạt 5 μm, 120 Å, đường kính đánh giá tương đương sinh học, theo dõi dược 4,6 mm, chiều dài 150 mm. Thiết bị xử lý tín động học của thuốc. hiệu là hệ thống máy vi tính với hệ điều hành Các phương pháp định lượng flurbiprofen Microsoft Windows 7 trang bị phần mềm điều trong dược phẩm và trong dịch sinh học đã khiển Chromeleon Dionex phiên bản được công bố bao gồm chuẩn độ [10], quang 7.1.2.1478. phổ [11], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12-16], sắc ký khí [17]. Trong nghiên cứu này, 2.3. Phương pháp nghiên cứu chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình định lượng hoạt chất trong dạng bào chế thông dụng Trong suốt quá trình thực nghiệm, tất cả các nhất hiện nay của flurbiprofen là viên nén bao mẫu đều được phân tích 3 lần, lấy giá trị trung phim 100 mg bằng phương pháp HPLC ghép bình. Số liệu được xử lý thống kê bằng phần đầu dò diode-array (DAD) theo hướng dẫn của mềm Microsoft Office Exel 2007. Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Tối ưu hoá điều kiện sắc ký: Medicines Agency - EMA) [18] và Hội nghị Sử dụng dung dịch chuẩn flurbiprofen nồng quốc tế về hài hoà hoá các yêu cầu kỹ thuật để độ 20 µg/ml để khảo sát. Quét phổ hấp thụ của đăng ký dược phẩm sử dụng trên người dung dịch trên trong khoảng 190 - 800 nm để (International conference on Harmonisation of tìm bước sóng hấp thụ cực đại. Khảo sát các Technical Requirements for Registration of điều kiện sắc ký khác nhau như: pha tĩnh: cột Pharmaceuticals for Human use -ICH) [19]. silica gel pha đảo C18 và C8; pha động: hỗn hợp các dung môi ACN, H2O và CH3COOH với các tỷ lệ khác nhau; thể tích tiêm mẫu: 5, 10, 15, 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 20, 40 µl. Duy trì tốc độ dòng 1 ml/phút. Xác định điều kiện sắc ký cho pic đạt độ đối xứng 2.1. Hóa chất, dung môi tốt, tỷ lệ diện tích pic trên nồng độ và chiều cao pic trên nồng độ lớn nhất. Flurbiprofen đạt tiêu chuẩn chất chuẩn theo Xác định tính đặc hiệu của phương pháp dược điển châu Âu (code: EPF0285200), natri Để xác định tính đặc hiệu của phương pháp, hydroxid (NaOH), acid clorhydric (HCl), acid flurbiprofen được xử lý với các yếu tố khác acetic (CH3COOH), hydro peroxid (H2O2) đạt nhau như acid, base, oxy hoá, nhiệt độ và ánh tiêu chuẩn tinh khiết phân tích, acetonitrile sáng nhằm làm phân huỷ mẫu. Cụ thể như sau:
3. N.T.T. Bình và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 41-49 43 - Acid hoặc base: Lấy 0,5 ml dung dịch cao gấp 10 lần đường nền đường nền ở tất cả 3 flurbiprofen 1000 µg/ml cho vào ống nghiệm. lần sắc ký. Thêm 2 ml dung dịch HCl 5 M hoặc 2 ml dung Thẩm định độ đúng dịch NaOH 5 M, đun nóng ở nhiệt độ 80 ± 5oC Độ đúng của phương pháp được thẩm định trong 3 giờ, để nguội về nhiệt độ phòng, rồi bằng cách đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy dung trung hoà hỗn hợp bằng lượng acid hoặc base dịch chuẩn trong khoảng tuyến tính đã phân tương ứng. tích. Tỷ lệ phục hồi được tính bằng tỷ lệ phần - Oxi hoá: Lấy 0,5 ml dung dịch trăm giữa nồng độ xác định được từ thực flurbiprofen 1000 µg/ml cho vào ống nghiệm. nghiệm so với nồng độ dung dịch chuẩn. Thêm 2 ml dung dịch H2O2 6%, đun nóng ở Thẩm định độ chính xác nhiệt độ 80 ± 5oC trong 3 giờ. Độ lặp lại: tiến hành định lượng 3 dung dịch - Nhiệt độ: Lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 2, 8, 20 µg/ml, flurbiprofen 1000 µg/ml cho vào ống nghiệm. mỗi dung dịch 3 lần trong cùng một ngày. Xác Thêm 2 ml dung dịch pha động, đun nóng ở định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa các nhiệt độ 80 ± 5oC trong 3 giờ. lần đo. - Ánh sáng: Lấy 0,5 ml dung dịch Độ chính xác trung gian: tiến hành định flurbiprofen 1000 µg/ml cho vào ống nghiệm, lượng 3 dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là cho tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong 5 giờ. 2, 8, 20 µg/ml, mỗi dung dịch 3 lần, lặp lại thí Hỗn hợp sau phản ứng được pha loãng nghiệm trong 3 ngày khác nhau. Xác định giá thành 25 ml trong pha động, lọc qua màng trị RSD giữa các lần đo ở 3 ngày. cellulose tái sinh 0,45 µm (Minisart® RC, Định lượng flurbiprofen trong viên nén bao Sartorius, Đức) rồi tiến hành sắc ký. Dựa vào phim 100 mg thời gian lưu và độ tinh khiết của pic để xác Cân 10 viên chế phẩm, tính khối lượng định khả năng phân tách của flurbiprofen khỏi trung bình viên đã loại bỏ lớp bao phim rồi sản phẩm phân huỷ (nếu có). nghiền mịn trong cối sứ. Cân lượng bột thuốc Xác định tính tuyến tính và miền giá trị tương đương với 50 mg flurbiprofen cho vào Từ chất chuẩn flurbiprofen ban đầu, pha bình định mức 50 ml, thêm pha động sắc ký đến dung dịch có nồng độ 1000 µg/ml trong vạch, siêu âm 15 phút và lọc qua giấy lọc giấy acetonitrile. Pha loãng dung dịch trên trong pha lọc Whatman® 40. Pha loãng 1 ml dung dịch động để tạo thành dãy gồm 6 dung dịch chuẩn 100 lần trong pha động, lọc qua màng cellulose có nồng độ 2, 4, 8, 12, 16, 20 µg/ml. Tiến hành tái sinh 0,45 µm. Tiến hành định lương sắc ký các dung dịch chuẩn để xây dựng flurbiprofen theo phương pháp đã được thẩm phương trình hồi quy giữa diện tích pic tín hiệu định. Dựa vào phương trình hồi quy để xác định y (mAU.min) và nồng độ chất phân tích x nồng độ C μg/ml của dung dịch định lượng. (µg/ml). Xác định giá trị R2. Sử dụng trắc Hàm lượng phần trăm flurbiprofen so với hàm nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc lượng ghi trên nhãn được tính bằng công thức nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của 100(C/10). Lặp lại thí nghiệm 3 lần, lấy kết quả phương trình. trung bình. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định 3. Kết quả và bàn luận lượng (LOQ) của phương pháp được xác định bằng phương pháp pha loãng dung dịch chuẩn. 3.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký LOD là nồng độ flurbiprofen thấp nhất cho pic có chiều cao gấp 2-3 lần đường nền ở tất cả 3 Trên phổ hấp thụ UV-VIS của flurbiprofen lần sắc ký. LOQ là nồng độ cho pic có chiều trong khoảng 190 - 800 nm có một cực đại tại
4. 44 N.T.T. Bình và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 41-49 247 nm (hình 2). Bước sóng này được chọn làm bước sóng phát hiện. Hình 3. Sắc ký đồ của flurbiprofen tại điều kiện tối ưu. 3.2. Tính đặc hiệu Khi xử lý mẫu với acid, base, chất oxy hoá, nhiệt độ và ánh sáng trong các điều kiện như đã mô tả, flurbiprofen chỉ bị phân huỷ dưới tác động của tác nhân oxy hóa H2O2. Trên sắc ký đồ xuất hiện thêm một pic mới có thời gian lưu 1,68 phút, tách ra hoàn toàn khỏi pic flurbiprofen. Độ phân giải của hai pic này là Hình 2. Phổ hấp thụ UV-VIS của flurbiprofen 10,75. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh trong khoảng 190 - 800 nm. khiết thông qua sự trùng phổ hấp thụ theo thời gian lưu cho thấy cả hai pic đều tinh khiết với Trong quá trình khảo sát, khi sử dụng pha độ tương xứng đạt trên 999 (hình 4). Phân tích tĩnh là silica gel C18 và pha động là hỗn hợp thống kê cho thấy không có sự khác biệt về thời ACN : H2O với các tỷ lệ tăng dần từ 60 : 40 đến gian lưu của flurbiprofen trong các mẫu được 80 : 20, thời gian lưu của flurbiprofen giảm dần xử lý và trong mẫu chuẩn (t = 0,23 < t0,05(28) = từ 5,13 xuống 2,65 phút. Tuy nhiên, pic có hình 2,048). Các kết quả trên cho phép khẳng định dạng không cân xứng với hệ số bất đối As = tính đặc hiệu của phương pháp phân tích. 0,69 - 2,02. Việc thêm 2,5% CH3COOH vào 3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị pha động có tác dụng chuyển flurbiprofen về dạng không ion hóa, và do đó tình trạng kéo Phân tích mối tương quan giữa diện tích pic đuôi của pic được cải thiện nhưng không hoàn y (mAU.min) và nồng độ dung dịch toàn mất hẳn. Thêm CH COOH vào pha động flurbiprofen x (µg/ml) trong khoảng 2 - 20 3 µg/ml thu được phương trình y = 0,680x + đồng thời thay pha tĩnh bằng silica gel C đã 8 0,022 với hệ số xác định R2 = 0,9993, độ lệch giúp giải quyết được tình trạng này. Qua khảo chuẩn S = 0,00885 (bảng 1). sát cũng đã xác định được thể tích tiêm mẫu Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình cho tỷ lệ diện tích pic trên nồng độ và chiều cao được chứng minh là có tính tương thích pic trên nồng độ lớn nhất là 10 µl. (F = 5907,328 > F0,05 = 10,13). Qua trắc nghiệm Từ thực nghiệm đã chọn được điều kiện sắc Student, hệ số a = 0,68 có ý nghĩa về mặt thống ký tối ưu như sau: Pha tĩnh là silica gel C8 5 kê (t = 76,86 > t0,05 = 2,132), hệ số b = 0,022 μm, 120 Å trong cột 4,6 mm x 150 mm, pha không có ý nghĩa về mặt thống kê (t = 0,85 < động ACN : H2O : CH3COOH tỷ lệ 65 : 32,5 : t0,05 = 2,132). Từ đó, phương trình hồi quy được 2,5, thể tích tiêm mẫu 10 µl, tốc độ dòng 1 đưa về dạng y = 0,680x. ml/phút, đầu dò ghi nhận tín hiệu tại bước sóng Như vậy, trong khoảng nồng độ được khảo 247 nm, thời gian sắc ký 8 phút. Flurbiprofen sát, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa có thời gian lưu 3,73 phút, pic cân xứng diện tích pic và nồng độ flurbiprofen. Độ lệch (As = 1,08), số đĩa lý thuyết là 3491. Sắc ký đồ của các giá trị thực nghiệm so với giá trị hồi được thể hiện trong hình 3. quy rất gần với 0 chứng tỏ khoảng tin cậy của phương trình hồi quy hẹp.
5. N.T.T. Bình và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 41-49 45 g Hình 4. Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydro peroxid (a) và độ trùng phổ hấp thụ theo thời gian lưu của các pic: sản phẩm phân hủy (b), flurbiprofen (c). Bảng 1. Phân tích hồi quy tương quan giữa diện tích pic và nồng độ flurbiprofen Nồng độ flurbiprofen Diện tích pic x (µg/ml) y (mAU.min) 2,00 1,38 4,00 2,73 8,00 5,53 12,00 8,24 16,00 10,68 20,00 13,76 Khoảng định lượng 2 - 20 µg/ml Phương trình hồi quy y = 0,680x + 0,022 Độ lệch chuẩn S 0,00885 Hệ số xác định R2 0,9993 l 3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Kết quả thu được cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng với các giá trị của độ phục hồi Bằng phương pháp pha loãng đã xác định đều nằm trong khoảng ≤ 100 ± 2%. được giới hạn phát hiện của phương pháp LOD = 0,05 µg/ml và giới hạn định lượng của 3.6. Độ chính xác phương pháp LOQ = 0,15 µg/ml. Độ lặp lại 3.5. Độ đúng Khi tiến hành sắc ký 3 dung dịch chuẩn có Tỷ lệ phục hồi của dãy dung dịch nồng độ lần lượt là 20, 8, 2 µg/ml, mỗi dung flurbiprofen có nồng độ trong khoảng tuyến dịch 3 lần trong cùng một ngày, giá trị RSD tính đã phân tích được trình bày trong bảng 2. giữa các lần đo đều nhỏ hơn 1,71% (bảng 3).
6. 46 N.T.T. Bình và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 41-49 Bảng 2. Tỷ lệ phục hồi của dãy dung dịch flurbiprofen chuẩn trong khoảng tuyến tính Nồng độ dung dịch chuẩn Nồng độ thực Tỷ lệ phục hồi (µg/ml) nghiệm (µg/ml) (%) 2,00 2,03 101,47 4,00 4,01 100,37 8,00 8,13 101,65 12,00 12,12 100,98 16,00 15,71 98,16 20,00 20,24 101,18 Bảng 3. Độ lệch chuẩn tương đối giữa các lần đo trong cùng một ngày Nồng độ dung Diện tích pic Diện tích pic trung RSD dịch chuẩn SD (mAU.min) bình (mAU.min) (%) (µg/ml) 1,38 2,00 1,34 1,35 0,02 1,71 1,34 5,55 8,00 5,53 5,53 0,03 0,46 5,50 13,78 20,00 14,22 14,00 0,22 1,57 13,99 l Độ chính xác trung gian phát xạ huỳnh quang [11], sắc ký lỏng ghép đầu Tiến hành sắc ký 3 dung dịch chuẩn có dò khối phổ hai lần liên tiếp (LC-MS/MS) [13], nồng độ lần lượt là 20, 8, 2 µg/ml, trong 3 ngày sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ (GC-MS) [17]. khác nhau, giá trị RSD giữa các ngày đều nhỏ So với các phương pháp này, giá trị RSD của hơn 2,34% (bảng 4). phương pháp được xây dựng thấp hơn, điều này Bảng 5 thể hiện độ chính xác của một số cho phép khẳng định đây là phương pháp có độ phương pháp định lượng flurbiprofen đã được chính xác cao. báo cáo như đo độ hấp thụ quang [11], đo độ Bảng 4. Độ lệch chuẩn giữa các lần đo trong 3 ngày khác nhau Nồng độ dung dịch chuẩn Diện tích pic Diện tích pic trung RSD Ngày SD (µg/ml) (mAU.min) bình (mAU.min) (%) 1 1,34 2,00 2 1,40 1,38 0,03 2,34 3 1,39 1 5,53 8,00 2 5,46 5,55 0,10 1,73 3 5,65
7. N.T.T. Bình và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 41-49 47 1 14,00 20,00 2 13,72 13,89 0,15 1,06 3 13,94 Bảng 5. So sánh độ chính xác của một số phương pháp định lượng flurbiprofen Phương pháp Độ lặp lại Độ chính xác trung gian Đo độ hấp thụ quang RSD ≤ 3,10 % RSD ≤ 3,20% Đo độ phát xạ huỳnh quang RSD ≤ 2,05% RSD ≤ 3,80% LC-MS/MS RSD ≤ 2,20% RSD ≤ 3,40% GC-MS RSD ≤ 2,65% RSD ≤ 3,64% Phương pháp được xây dựng RSD ≤ 1,71% RSD ≤ 2,34% L 3.7. Định lượng flurbiprofen trong viên nén bao Như vậy hàm lương flurbiprofen trong chế phim 100 mg phẩm bằng 94,0% hàm lượng ghi trên nhãn, đạt tiêu chuẩn USP 40–NF 35. Áp dụng phương pháp được xây dựng để định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim Anadys 100 mg (Theramex, Pháp). USP 4. Kết luận 40-NF 35 quy định viên nén flurbiprofen phải chứa 90 - 110% so với hàm lượng ghi trên nhãn Trong nghiên cứu này chúng tôi đã xây [12]. Theo tài liệu này, flurbiprofen trong viên dựng được quy trình định lượng flurbiprofen nén được chiết bằng pha động sắc ký là hỗn hợp trong dạng bào chế thông dụng nhất hiện nay là ACN và đệm phosphate pH 3,0 (43: 57). Sử viên nén bao phim 100 mg theo các hướng dẫn dụng 25 ml pha động cho mỗi lượng bột thuốc của ICH và EMA. Phương pháp HPLC - DAD tương đương 75 mg flurbiprofen, sau đó pha sử dụng pha tĩnh là cột silica gel C 5 μm, 120 loãng một phần dung dịch thu được 20 lần trong 8 Å, kích thước 4,6×150 mm, pha động là hỗn pha động rồi tiến hành sắc ký. hợp ACN : H O: CH COOH với tỷ lệ 65 : 32,5 Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tỷ 2 3 : 2,5, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu lệ dung môi chiết cao gấp 3 lần: 50 ml pha động 10 µl, thời gian sắc ký 8 phút, bước sóng phát cho lượng bột thuốc chứa tương đương 50 mg hiện 247 nm. Bằng cách xử lý mẫu với nhiều flurbiprofen. Sau đó pha loãng 1ml dung dịch yếu tố khác nhau để tạo sản phẩm phân hủy đã 100 lần với pha động để thu được dung dịch có chứng minh được tính đặc hiệu của phương nồng độ lý thuyết 10 µg/ml. Tiến hành sắc ký 3 pháp. Trong khoảng nồng độ 2 - 20 μg/ml, có lần, lấy diện tích pic trung bình để tính nồng độ C sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích μg/ml của dung dịch định lượng. Lặp lại thí pic và nồng độ dung dịch theo phương trình nghiệm 3 lần, kết quả được thể hiện trong bảng 6. y = 0,680x với hệ số xác định R2 = 0,9993. Sử Bảng 6. Kết quả định lượng flurbiprofen trong viên dụng phương pháp pha loãng mẫu đã xác định nén bao phim Anadys 100 mg (Theramex, Pháp; lot: được LOD và LOQ lần lượt là 0,05 và 0,15 2M653 05 2015) μg/ml. So sánh với một số nghiên cứu định Diện tích lượng flurbiprofen khác đã được công bố cho Nồng Hàm pic trung thấy phương pháp được xây dựng có độ đúng Lần độ C lượng bình và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± (µg/ml) (%) (mAU.min) 2%, độ lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại 1 6,33 9,31 93,1 ≤ 1,71% và độ lệch chuẩn tương đối của độ 2 6,48 9,53 95,3 chính xác trung gian ≤ 2,34%. 3 6,37 9,37 93,7 Nghiên cứu có thể được ứng dụng trong công tác kiểm nghiệm, đảm bảo chất lượng
8. 48 N.T.T. Bình và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 41-49 thuốc đồng thời là tiền đề quan trọng để phát amyloid-β 42 generation in an in vitro blood-brain triển các nghiên cứu tiếp theo như định lượng barrier model. Alzheimer's research & therapy. flurbiprofen trong các dạng bào chế khác, bào 2013: 5 (6): 51-63. chế, đánh giá tương đương sinh học, dược động [9] Zhao X, Li W, Luo Q, Zhang X. Enhanced bioavailability of orally administered flurbiprofen học của các thuốc giảm đau kháng viêm chứa by combined use of hydroxypropyl-cyclodextrin flurbiprofen. and poly (alkyl-cyanoacrylate) nanoparticles. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 2014; 39 (1): Lời cảm ơn 61-67. [10] European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia 9th edition. 2017. Các tác giả xin cảm ơn Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tài trợ kinh phí cho [11] Bilal Y, Emrah A. Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric nghiên cứu (đề tài mã số CS.17.01). Methods for the Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations. Journal of Pharmaceutical Analysis. 2015; 4 (4): 1-8 Tài liệu tham khảo [12] United States Pharmacopeial Convention. United States Pharmacopoeia 40–NF 35. 2017 [1] Calapai G, Imbesi S, Cafeo V, Ventura SE, [13] Chenghan M, Bin L, Qiangfeng Y, Jing J, Ting X, Minciullo PL, et al. Fatal hypersensitivity reaction et al. Liquid chromatography-tandem mass to an oral spray of flurbiprofen: a case report. J spectrometry for the quantification of flurbiprofen Clin Pharm Ther. 2013; 38(4): 337-338. in human plasma and its application in a study of [2] Geerts H. Drug evaluation: (R)-flurbiprofen--an bioequivalence. Journal of Chromatography B. enantiomer of flurbiprofen for the treatment of 2015; 993-994: 69-74. Alzheimer's disease. Idrugs. 2007; 10 (2): 121-133. [14] Lee HI, Choi CI, Byeon CY, Lee JE, Park SY, et [3] Mironov GG, Logie J, Okhonin V, Renaud JB, al. Simultaneous determination of flurbiprofen Mayer PM, Berezovski MV. Comparative study and its hydroxy metabolite in human plasma by of three methods for affinity measurements: liquid chromatography-tandem mass spectrometry capillary electrophoresis coupled with UV for clinical application. Journal of detection and mass spectrometry, and direct chromatography B. 2014; 971: 58-63. infusion mass spectrometry. J Am Soc Mass [15] Murray KK, Boyd RK, Eberlin MN, Langley Spectrom. 2012; 23 (7): 1232-120. GJ, Li L, NaitoY. Definitions of terms [4] Zhou SF, Zhou ZW, Yang LP, Cai JP. Substrates, relating to mass spectrometry (IUPAC inducers, inhibitors and structure-activity Recommendations 2013). Pure Appl. Chem. relationships of human Cytochrome P450 2C9 2013; 85: 1515-1609. and implications in drug development. Curr Med [16] Mano N, Narui T, Nikaido A, Goto J. Separation Chem. 2009; 16 (27): 3480-3675. and determination of diastereomeric flurbiprofen [5] Drugbank. Flurbiprofen. acyl glucuronides in human urine by LC/ESI-MS Consulted jun 20th 2017. with a simple column-switching technique. Drug Metabol Pharmacokin. 2002; 17: 142-149. [6] Bhaskar K, Anbu J, Ravichandiran V, Venkateswarlu V, Rao YM. Lipid nanoparticles for [17] Yilmaz B, Emrah A. Determination of transdermal delivery of flurbiprofen: formulation, in flurbiprofen in pharmaceutical preparations by vitro, ex vivo and in vivo studies. Lipids in health GC-MS. Arabian Journal of Chemistry. 2015; and disease. 2009; 8: 6-21. accepted. [7] Gonzalez-Mira E, Egea MA, Souto EB, Calpena [18] European Medicines Agency. Guideline on AC, Garcia ML. Optimizing flurbiprofen-loaded bioanalytical method validation. 2011; 9-10. NLC by central composite factorial design for [19] The International Council for Harmonisation of ocular delivery. Nanotechnology. 2010; 22 (4): Technical Requirements for Pharmaceuticals for 045101. Human Use. Validation of analytical procedures: [8] Meister S, Zlatev I, Stab J, Docter D, Baches S, et text and methodology Q2(R1). 2005; 6-13. al. Nanoparticulate flurbiprofen reduces .
9. N.T.T. Bình và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 41-49 49 Validation of a High-Performance Liquid Chromatographic Method with diod array detection for the Quantification of Flurbiprofen in 100 mg Film-coated Tablet Nguyen Thi Thanh Binh, Dang Ngoc Anh, Tran Mai Anh, Nguyen Thanh Hai VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Abstract: A high-performance liquid chromatographic method was developed for the quantification of flurbiprofen in 100 mg film-coated tablet in accordance with the direction of the European Medicines Agency and the International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. 10 µl of flurbiprofen solution was injected onto a C8 reverse phase column (5 µm, 120 Å, 4.6×150 mm). The mobile phase employed was acetonitrile : water : glacial acetic acid (65 : 32.5 : 2.5, v/v/v) at a flow rate of 1 ml/min. The column effluent was monitored within 8 minutes by diot array detection at 247 nm. The retention time of flurbiprofen was found to be 3.73 minutes. In the concentration range of 2 - 20 μg/ml, there was a tight linear correlation between peak area y (mAU.min) and sample concentration x (μg/ml) according to the equation y = 0,680x as the squared correlation coefficient R2 was 0.9993. The limit of detection and limite of quantification were respectively 0.05 and 0.15 μg/ml. The method was specific to flurbiprofen with good precision and accuracy. The percentage recovery was ≤ 100 ± 2%, the relative standard deviation of the repeatability was ≤ 1.71% and the relative standard deviation of the intermediate precision was ≤ 2.34%. Keywords: Flurbiprofen, quantification, high-performance liquid chromatography, diode-array detection.