Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phõng bệnh tay chân miệng EV71 trên nuôi cấy tế bào vero ở quy mô phõng thí nghiệm

Nội dung text: Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phõng bệnh tay chân miệng EV71 trên nuôi cấy tế bào vero ở quy mô phõng thí nghiệm

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮCXIN PHÕNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG EV71 TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO Ở QUY MÔ PHÕNG THÍ NGHIỆM Vũ Hồng Nga*; Lương Thùy Dương*; Nguyễn Bích Thủy* Đỗ Tuấn Đạt*; Nguyễn Thu Vân* TÓM TẮT Từng công đoạn trong quy trình sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 trên nuôi cấy tế bào Vero đã được tối ưu hóa nhằm tìm thông số ổn định đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt nhất. Một số nghiên cứu quan trọng đã được tiến hành để tìm quy trình sản xuất phù hợp nhất như nghiên cứu nuôi cấy virut; tinh sạch, cô đặc và bất hoạt virut. Siêu ly tâm trong gradient đường sucrose để thử các phân đoạn có kháng nguyên tinh khiết. Kết quả này sẽ là căn cứ để xây dựng một quy trình công nghệ sản xuất ổn định và tối ưu tại Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1. * Từ khóa: Vắcxin EV71; Quy trình công nghệ; Tế bào Vero. ESTABLISHMENT OF PROCEDURE FOR VERO CELL ENTEROVIRUS 71 VACCINE PRODUCTION IN LABORATORY SCALE SUMMARY Each step of the procedure for Vero cell Enterovirus 71 vaccine production has been optimized in order to find consistent parameter for best quality products. Several pivotal researches have been done for finding the most suitable production procedure such as a cell culture media was screened for virus propagation; research for finding of clarification, concentration and inactivation procedures, research for collecting purified virus by sucrose gradient ultracentrifugation. The results will be basics for establishment of the most consistent and optimal vaccine production procedure at the Company for Vaccine and Biological production No 1. * Key words: Technological process; EV71 vaccine; Vero cell. ĐẶT VẤN ĐỀ tính bao gồm: liệt mềm giống bại liệt, viêm não, viêm màng não vô khuẩn, phù phổi. Virut đường ruột týp 71 (EV71) là căn Các bệnh do EV71 gây ra thường để lại di nguyên gây ra dịch tay chân miệng nghiêm chứng về thần kinh nghiêm trọng và có tỷ lệ trọng ở trẻ em tại châu Á trong những năm tử vong cao. EV71 lần đầu tiên phân lập tại gần đây với bệnh cảnh về thần kinh cấp California (Mỹ) vào năm 1969, thuộc chi các * Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1, Hà Nội Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Đoàn Huy Hậu 50
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 virut đường ruột, họ Picornaviridea. Genom VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP EV71 là ARN đơn dương gồm khoảng 7.500 NGHIÊN CỨU nucleotit. Protein cấu trúc bao gồm VP , 1 1. Chủng virut. VP2, VP3 và VP4; ở hạt virut gây nhiễm VP0 Chủng virut đường ruột týp 71 0822 được được tách thành VP4 và VP2. Trong các nghiên cứu dịch tễ, phân tử hai protein cấu trúc phân lập từ bệnh nhi mắc tay chân miệng tại Việt Nam, tách dòng và cấy truyền chủng VP1 và VP4 được dùng để xác định nhóm gen, EV71 được chia ra thành 3 nhóm gen liên tiếp trên tế bào Vero. Hiệu giá chủng 7 (A, B và C) và phân chia nhỏ hơn với 11 10 TCID 50/ml. nhóm gen (A, B -B , C -C ). Gần đây, các 1 5 1 5 2. Tế bào. chủng lưu hành tại Malaysia, Singapore, Đài Loan, Thái Lan và Trung Quốc thuộc Tế bào Vero (ATCC-CCL81) được Trung tâm Lưu trữ Ngân hàng Tế bào gốc châu Âu nhóm gen B5, C4 và tại Việt Nam chủng EV71 cung cấp. Kiểm tra chất lượng, an toàn dòng thuộc nhóm gen C4 và C5. Do đó, vắcxin EV71 hiệu quả phải tạo ra được kháng thể trung tế bào này đối với dòng tế bào thường trực. hòa bảo vệ chéo các nhóm gen khác nhau. 3. Quy trình nuôi cấy và chuẩn bị tế Nghiên cứu phát triển vắcxin phòng bào Vero. bệnh tay chân miệng EV71 là cách hiệu quả Tế bào Vero đời 139 từ điều kiện bảo nhất để phòng bệnh chủ động. Vì vậy, một quản của ngân hàng tế bào sản xuất được loạt vắcxin phòng tay chân miệng EV71 đã cấy chuyển đến đời 142 bằng môi trường được nghiên cứu như vắcxin hạt virut bất MEM, bổ sung huyết thanh động vật. Xác hoạt nhiệt hoặc formaldehyde; vắcxin tiểu định hình thái và số lượng tế bào trên bề thể dạng virut (virus-like particles-VLP), protein mặt chai nuôi cấy bằng phương pháp quan tái tổ hợp vùng VP1, vắcxin ADN vùng VP1, vắcxin peptide vùng tạo kháng thể trung sát dưới kính hiển vi đảo pha và đếm số lượng tế bào. hòa, vector vi khuẩn hay virut biểu hiện VP1 và vắcxin EV71 sống giảm độc lực thích 4. Quy trình gây nhiễm và nuôi cấy virut. ứng trên tế bào Vero. Kết quả chung cho Chủng EV71 sản xuất gây nhiễm vào thấy: vắcxin bất hoạt toàn virut cho tính sinh các chai tế bào Vero kín một lớp. Các điều miễn dịch cao hơn so với vắcxin VP1 tái tổ kiện gây nhiễm khác bao gồm môi trường, hợp và vắcxin ADN. nhiệt độ nuôi cấy virut và liều virut gây nhiễm. Công nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 được nghiên cứu tại 5. Quy trình tinh sạch, bất hoạt và cô Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1, là công đặc virut. nghệ sử dụng dòng tế bào thường trực Vero Quy trình tinh sạch và cô đặc virut tìm để nhân nuôi virut, từ đó tinh chế kháng hiểu về hiệu quả thu hoạch virut sau khi ly nguyên đặc hiệu. Nghiên cứu này nhằm mục tâm và sử dụng các loại màng lọc, màng cô tiêu: Cung cấp các thông số về môi trường đặc khác nhau. Đánh giá quá trình bất hoạt nuôi cấy virut, tinh sạch, bất hoạt virut sử sau khi sử dụng các loại hóa chất và điều dụng formaldehyde và tinh chế virut nhằm kiện bất hoạt khác nhau. Đánh giá hiệu quả tìm ra quy trình sản xuất vắcxin EV71 có chất lượng, hiệu quả và mang tính thực tiễn. bất hoạt trên tế bào Vero. 6. Quy trình tinh chế virut. 53
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Tinh chế virut EV71 bằng phương pháp Môi trường nuôi cấy trong giai đoạn nuôi siêu ly tâm trong gradient đường sucrose. cấy virut trên tế bào là môi trường không có Phương pháp định lượng kháng nguyên huyết thanh động vật nhằm đảm bảo sản EV71 bằng thử nghiệm ELISA, định lượng phẩm cuối cùng không chứa protein huyết protein bằng đo mật độ quang ở bước sóng thanh động vật theo yêu cầu của Tổ chức 280 nm, điện di trên gel SDS-PAGE, phương Y tế Thế giới. Khảo sát tìm môi trường nuôi pháp kính hiển vi điện tử được dùng để cấy virut không chứa huyết thanh động vật, đánh giá hiệu quả của quy trình tinh chế. nhưng vẫn đảm bảo virut hiệu giá virut cao. 7. Quy trình pha bán thành phẩm cuối Nhiệt độ nuôi cấy 90 35°C cùng. 80 Nhiệt độ nuôi cấy Công thức pha bán thành phẩm cuối 70 37°C cùng và chất lượng của vắcxin được đánh 60 giá qua kết quả kiểm tra chất lượng và tính 50 40 sinh miễn dịch của vắcxin thành phẩm. 30 20 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 10 Hiệu Hiệu giá nguyên virút kháng EU 0 BÀN LUẬN DMEM MEM LH3E M199 Môi trường nuôi cấy virút 1. Quy trình nuôi cấy và chuẩn bị tế bào Vero. Hình 1: Hiệu giá kháng nguyên virut thu Quá trình nuôi cấy này phải tuân thủ được sau gây nhiễm trên môi trường nuôi theo đúng hướng dẫn về nuôi cấy tế bào cấy DMEM, MEM, LH3E, M199 và nhiệt độ cho sản xuất vắcxin. Tế bào Vero sẽ được nuôi cấy 35C và 37C. cấy chuyển từ đời bảo quản trong ngân hàng tế bào sản xuất - đời 139 đến đời 142, Môi trường nuôi cấy MEM cho hiệu giá virut cao nhất ở cả 2 điều kiện nuôi cấy đời cấy chuyển cuối cùng trước khi được gây nhiễm virut. Đếm số lượng tế bào trong 35C và 37C. Nuôi cấy virut tại 37C đều chai nuôi cấy và quan sát tế bào kín một cho hiệu giá kháng nguyên virut cao hơn lớp dưới kính hiển vi đảo pha. Đây là cách nhiệt độ nuôi cấy 35C ở hầu hết môi trường thức để đánh giá chất lượng của tế bào sau nuôi cấy. Lựa chọn môi trường MEM là môi nuôi cấy (dữ liệu không công bố). Xác định trường nuôi cấy virut và nhiệt độ nuôi cấy tỷ lệ tách tế bào qua các lần cấy chuyển, virut 37C là những điều kiện giúp đạt được số ngày nuôi cấy cần thiết để đạt số lượng hiệu giá virut cao. tế bào. * Liều virut gây nhiễm và thời gian nuôi cấy: 2. Quy trình nuôi cấy virut. Mỗi loại tế bào có độ nhạy cảm với virut khác nhau. Nghiên cứu liều gây nhiễm khác Điều kiện nuôi cấy virut tối ưu là những nhau của EV71 trên tế bào vero là cần thiết yếu tố quyết định đến hiệu giá thu hoạch nhằm mục đích tìm được liều gây nhiễm virut sau gây nhiễm. Các tham số về điều thích hợp cho hiệu giá tối đa trong sản xuất kiện nuôi cấy virut bao gồm: môi trường, vắcxin. Khảo sát liều virut gây nhiễm nhằm nhiệt độ nuôi cấy, liều virut gây nhiễm. tìm ra liều gây nhiễm tối ưu cho hiệu giá * Môi trường và nhiệt độ nuôi cấy virut: virut cao nhất. Trong nghiên cứu này, 4 liều gây nhiễm khác nhau được khảo sát là 1; 54
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 0,1; 0,01 và 0,001 TCID50/tế bào. Liều gây hoạt hoàn toàn khi sử dụng formaldehyde o nhiễm này tính theo đơn vị hiệu giá TCID50 với nồng độ 1/2000 ở 37 C sau 7 ngày. của EV71. 4. Quy trình tinh chế virut. Bảng 1: Kết quả gây nhiễm EV71 ở nồng độ virut 1; 0,1; 0,01; 0,001 MOI tại các thời 2 400 điểm gặt 24; 36; 48; 60 giờ. 1.8 350 1.6 300 1.4 1.2 250 (TCID50/ml) 1 200 (TCID50/tế bào) OD 24 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 0.8 150 6,25 5,75 0.6 1 10 10 - - 100 0.4 0.1 106,5 105,75 - - 0.2 50 0 0 5,75 6,25 6,75 0.01 10 10 10 - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 can 4.75 5,75 6,5 6 Phân đoạn ELISA OD280 0.001 10 10 10 10 Hình 2: Kết quả siêu ly tâm tinh chế virut. Liều gây nhiễm 1 và 0,1: lượng virut gây nhiễm cao gây hiện tượng tế bào bị hủy Ở các phân đoạn 1, 2, 3 và 4, xác định hoại nhanh nên virut đạt hiệu giá khá cao hiệu giá kháng nguyên bằng phương pháp ngay sau 24 giờ gây nhiễm, đến thời điểm ELISA có giá trị cao nhất, đồng thời ít lẫn 36 giờ sau gây nhiễm, hiệu giá virut giảm các protein tạp khác (giá trị OD280 thấp). do tế bào bị hủy hoại hoàn toàn, không còn cơ chất cho virut nhân lên. Liều gây nhiễm 0,01 và 0,001: lượng virut gây nhiễm thấp nên hiệu giá virut thu được sau 24 giờ gây nhiễm không cao, tuy nhiên, hiệu giá virut tăng dần theo thời gian sau gây nhiễm và đạt đỉnh vào thời điểm 48 giờ sau gây nhiễm. Kết quả trên cho thấy: liều gây nhiễm 0,01 sau 48 giờ cho kết quả khả quan nhất. Vậy trong quy trình gây nhiễm EV71 vào tế bào Vero sử dụng liều gây nhiễm 0,01 TCID50/tế bào thích hợp nhất, hiệu giá virut đạt cao và không lãng phí chủng. 3. Quy trình tinh sạch, bất hoạt và cô đặc virut. Hỗn dịch virut sau khi thu hoạch được ly Hình 3: Hình ảnh điện di trên gel SDS-PAGE. tâm để loại xác tế bào và được lọc để loại 1- Chuẩn trọng lượng phân tử; 2- Mẫu trước bỏ các tạp chất. Sau quá trình tinh sạch, siêu ly tâm; 3,4- Mẫu sau siêu ly tâm. cô đặc và bất hoạt hỗn dịch virut (dữ liệu Kết quả chạy điện di SDS-PAGE cũng không công bố). Kết quả cho thấy: màng lọc khẳng định, sản phẩm sau quá trình siêu ly 0,8 µm và màng siêu lọc 50K phù hợp để tâm có độ tinh khiết cao, chứa ít protein tạp. tinh sạch và cô đặc EV71. Virut được bất 55
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Khảo sát từng công đoạn của quy trình sản xuất vắcxin EV71 trên nuôi cấy tế bào Vero để tìm ra các thông số tối ưu và ổn định, đảm bảo chất lượng sản phẩm. Đây là cơ sở để xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 tại Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chang JY, Chang CP, Tsai HHP, Lee CD, Lian WC, et al. Selection and characterization Hình 4: Hình ảnh virut đường ruột týp 71 of vaccine strain for Enterovirus 71 vaccine sau tinh chế. development. Vaccine. 2012, 30, pp.703-711. Cùng với kết quả xác định hàm lượng 2. Lee MS, Chang LY. Development of ADN tế bào tồn dư và hình ảnh virút sau enterovirus 71 vaccines. Expert Rev Vaccines. tinh chế dưới kính hiển vi điện tử cho thấy: 2010, 9, pp.149-156. siêu ly tâm trong gradient đường sucrose 3. Liu CC, Guo MS, Lin FHY, Hsiao KN, Chang cho kháng nguyên virut có độ tinh khiết cao, KHW, et al. Purification and characterization of thích hợp để pha chế vắcxin. EV71 viral particles produced from Vero cell 5. Quy trình pha bán thành phẩm cuối grown in a serum-free microcarrier bioreactor cùng. system. PLoS ONEdoi. 2011, 10.1371/Journal- pone.0020005. Sau khi tinh chế, pha kháng nguyên virut với các công thức khác nhau. Kết quả kiểm 4. Huang ML, Ho MS, Lee MS. Enterovirus tra chất lượng và tính sinh miễn dịch của 71 vaccine: when will it be available?. J Formos vắcxin thành phẩm sẽ quyết định công thức Med Assoc. 2011, 110, pp.425-427. pha bán thành phẩm cuối cùng nào là tối 5. Solomon T, Lewthwarte P, Perera D, Cordosa ưu nhất (dữ liệu không công bố). Công thức MJ, McMinn P, et al. Virology, epidemiology, pha bán thành phẩm cuối cùng được lựa pathogenesis and control of enterovirus 71. Lancet chọn sẽ tiếp tục áp dụng trong quy trình sản Infect Dis. 2010, 10, pp.778-790. xuất vắcxin EV71 trên nuôi cấy tế bào Vero. KẾT LUẬN Ngµy nhËn bµi: 30/10/2012 Ngµy giao ph¶n biÖn: 15/11/2012 Ngµy giao b¶n th¶o in: 6/12/2012 56
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 57