Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dengue sống giảm độc lực trên nuôi cấy tế bào vero ở quy mô phõng thí nghiệm

Nội dung text: Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dengue sống giảm độc lực trên nuôi cấy tế bào vero ở quy mô phõng thí nghiệm

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮCXIN DENGUE SỐNG GIẢM ĐỘC LỰC TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO Ở QUY MÔ PHÕNG THÍ NGHIỆM Đỗ Tuấn Đạt*; Hoàng Anh Đức* Hoàng Đức Lộc*; Nguyễn Thu Vân* TÓM TẮT Nghiên cứu và thử nghiệm tất cả công đoạn của quy trình sản xuất vắcxin dengue trên nuôi cấy tế bào Vero nhằm tìm ra điều kiện tối ưu và thông số ổn định đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt nhất. Một số nghiên cứu quan trọng được tiến hành để tìm quy trình sản xuất phù hợp nhất như: xác định điều kiện nuôi cấy virut và số mẻ gặt đơn cần thiết để thu hoạch lượng virut tối ưu; tìm hiểu thông số ổn định cho quá trình tinh sạch, cô đặc và tinh chế virut. Kết quả này sẽ là căn cứ để xây dựng một quy trình công nghệ sản xuất ổn định và tối ưu nhất tại Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1. * Từ khoá: Vắcxin dengue; Quy trình công nghệ; Tế bào Vero. ESTABLISHMENT OF PROCEDURE FOR VERO CELL LIVE ATTENTUATED DENGUE VACCINE PRODUCTION IN LABORATORY SCALE SUMMARY All steps of the procedure for Vero cell dengue vaccine production have been researched in order to find optimal conditions with consistent parameters for best quality products. Several pivotal researches have been done for finding the most suitable production procedure such as research for determination of condition and number of single harvests for optimal virus yield; research for finding of clarification, concentration and purification procedures. The results will be the basics for establishment of the most consistent and optimal vaccine production procedure at the Company for Vaccine and Biological Production No 1. * Key words: Dengue vaccine;Technological process; Vero cell. ĐẶT VẤN ĐỀ nhiễm và 70 - 500 triệu ca nhiễm; 2,1 triệu ca bệnh nặng (sốt xuất huyết dengue/hội Bệnh dengue đang trở thành một vấn đề chứng sốc dengue), 21 ngàn ca tử vong đáng lo ngại đối với kinh tế, xã hội và y tế mỗi năm. Miền Trung và Nam Mỹ, một phần công cộng. Ước tính hiện nay, virut dengue vùng Caribê và Đông Nam Á cũng như Tây lưu hành ở hơn 120 quốc gia, 3,6 tỷ người Thái Bình Dương là vùng dịch tễ và siêu (gần 55% dân số thế giới) có nguy cơ lây dịch tễ của virut dengue [5]. Việc cho ra đời và * Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1, Hà Nội Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Đoàn Huy Hậu 55
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 sử dụng rộng rãi vắcxin dengue an toàn và VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP hiệu quả cùng với cố gắng trong giáo dục NGHIÊN CỨU cộng đồng, tuyên truyền biện pháp bảo vệ cá nhân và kiểm soát vector là những việc Phương pháp nghiên cứu bao gồm: các làm thiết thực để giảm thiểu gánh nặng cña bước của quy trình sản xuất và phương pháp c¨n bệnh này. nhằm đánh giá chất lượng của sản phẩm sau mỗi bước của quy trình sản xuất này. Cách đây hơn 70 năm, những nghiên cứu ban đầu để phát triển vắcxin dengue 1. Quá trình nuôi cấy và chuẩn bị tế được tiến hành thông qua thử nghiệm huyết bào Vero. thanh người nhiễm xử lý với mật bò hoặc Tế bào Vero đời 137 từ điều kiện bảo virut trong muỗi sống, được bất hoạt bằng quản của ngân hàng tế bào sản xuất được formalin để phòng ngừa lây truyền virut. cấy chuyển đến đời 142 bằng môi trường Các nghiên cứu sau này phát triển và thử MEM có chứa huyết thanh bê. Xác định nghiệm vắcxin sống giảm độc lực dự tuyển hình thái và số lượng tế bào trên bề mặt bằng cách cấy truyền liên tiếp trên tế bào. chai nuôi cấy bằng phương pháp quan sát Cuối những năm 1980, hướng tiếp cận mới dưới kính hiển vi đảo pha và đếm số lượng trong phát triển vắcxin dengue là gây đột tế bào. biến gen trực tiếp để giảm độc lực chủng dengue và phát triển khảm gen prM và E từ 2. Quy trình gây nhiễm virut vào tế một týp dengue vào thân của virut dengue bào Vero. hoặc các flavivirus khác đã được giảm độc Gây nhiễm chủng virut dengue sản xuất lực hoàn toàn. Kết quả, một số vắcxin dự vào chai nuôi cấy tế bào đời 142 sau khi tế tuyển mới được đánh giá tiền lâm sàng bào kín một lớp. Các điều kiện gây nhiễm không chỉ trên chuột và các loài linh trưởng khác nhau bao gồm: liều lượng, thời gian mà còn trên người ở giai đoạn 1 và 2 [4, 5]. nhiệt độ hấp phụ virut vào tế bào. Quan sát Công nghệ sản xuất vắcxin dengue sống tế bào và phương pháp xác định hiệu giá giảm độc lực được nghiên cứu và phát triển virut sau nuôi cấy sẽ giúp đánh giá hiệu quả tại Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1, là các điều kiện gây nhiễm khác nhau. Cả 4 công nghệ sử dụng dòng tế bào thường chủng virut thuộc 4 týp dengue khác nhau trực Vero để nhân nuôi cả 4 týp virut giảm được gây nhiễm riêng để tìm hiểu điều kiện độc lực bằng các công nghệ tái tổ hợp gen gây nhiễm cho từng chủng. trên virut dengue (rDEN1, rDEN2, rDEN3 và 3. Quy trình nuôi cấy virut và thu hoạch rDEN4) tiếp nhận từ Viện Sức khỏe Hoa Kỳ nước nổi. (NIH) [2, 3]. Nhóm nghiên cứu đã tham khảo, Sản phẩm của quy trình này là virut dengue tìm hiểu quy trình sẵn có, đồng thời đưa ra thuộc các týp khác nhau, do vậy, việc đánh nhiều cải tiến mới với mục tiêu: Tìm ra điều giá điều kiện nuôi cấy và thu hoạch nước kiện tối ưu nhất với các thông số ổn định, nổi khác nhau dựa vào phương pháp xác đảm bảo chất lượng sản phẩm ở từng bước định hiệu giá virut dengue sống giảm độc của quy trình sản xuất. Từ đó, xây dựng lực - phương pháp nhuộm miễn dịch xác quy trình sản xuất vắcxin dengue trên nuôi định đám hủy hoại (immunostain plaque) cấy tế bào Vero tại Việt Nam có chất lượng, sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho hiệu suất và thực tiễn cao. từng týp. Đánh giá thông số của quy trình 57
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 nuôi cấy bao gồm: nhiệt độ nuôi cấy, ngày Quá trình này phải tuân thủ theo đúng thay môi trường duy trì và số mẻ gặt đơn. các hướng dẫn về nuôi cấy tế bào cho sản xuất vắcxin. Tế bào Vero cấy chuyển từ đời 4. Quy trình tinh sạch, cô đặc và bất bảo quản trong ngân hàng tế bào sản xuất - hoạt virut. đời 137 đến đời 142, đời cấy chuyển cuối Sau khi ly tâm, lọc và cô đặc sẽ tìm hiểu cùng trước khi gây nhiễm virut. Đếm số hiệu quả thu hoạch virut. Xác định hiệu giá lượng tế bào trong từng chai nuôi cấy và virut (PFU/ml) theo phương pháp nhuộm quan sát tế bào kín 1 lớp dưới kính hiển vi miễn dịch xác định đám hoại tử. đảo pha. Lượng tế bào trong các đời cấy 5. Quy trình tinh chế virut. chuyển sau thường tăng gấp 6 lần so với đời cấy chuyển trước (từ 1,4 x 107 tế bào ở Mục đích của quy trình này là loại bỏ tối đời 138 đến 2 x 1010 tế bào ở đời 142). Đây đa các thành phần protein tạp từ tế bào và là lượng nhân nuôi tối đa đạt được đối với môi trường nuôi cấy cũng như AND tồn dư dòng tế bào Vero (theo nhiều nghiên cứu của tế bào Vero có trong hỗn dịch virut sau trước đây đã tiến hành) [1]. thu hoạch. Phương pháp tinh chế virut bao gồm: cắt axít nucleic và siêu lọc. Điều kiện 2. Quy trình gây nhiễm virut vào tế để cắt axít nucleic và siêu lọc như nồng độ bào Vero. men, thời gian và nhiệt độ cắt men, pH dung Nghiên cứu xác định liều lượng gây nhiễm dịch đệm sẽ được nghiên cứu và đánh giá tối ưu cho các chủng virut dengue là 0,01 nhằm tìm phương pháp tinh chế virut dengue MOI, với thời gian hấp phụ 1 giờ, ở nhiệt độ hiệu quả nhất. Phương pháp xác định hiệu 370C. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu giá virut và hàm lượng ADN tế bào tồn dư của Viện Sức khỏe Hoa Kỳ [2, 3]. và điện di mẫu trên gel SDS-PAGE được 3. Quy trình nuôi cấy virut và thu hoạch sử dụng để đánh giá hiệu suất và độ tinh nước nổi. sạch của virut sau tinh chế. Các thông số được đề cập đến trong 6. Quy trình pha bán thành phẩm cuối quá trình nuôi cấy và thu hoạch virut như: cùng và sản xuất vắcxin thành phẩm. nhiệt độ nuôi cấy, ngày dự định thu hoạch Đánh giá công thức pha bán thành phẩm virut và số mẻ gặt đơn cần thiết được xác cuối cùng với nồng độ của từng týp virut định đối với từng týp virut dengue khác dengue, từng thành phần trong đệm đông nhau. Xác định hiệu giá virut (PFU/ml) theo khô qua kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin phương pháp nhuộm miễn dịch xác định thành phẩm, đặc biệt, công hiệu của vắcxin đám hủy hoại. Đây là chỉ số quan trọng nhất và xác định độ ẩm tồn dư. để đánh giá hiệu quả của quy trình này [2]. Hình ảnh đám hủy hoại đối với từng chủng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ virut dengue khác nhau thể hiện trong hình 1. BÀN LUẬN Xác định ngày dự định cho mỗi mẻ gặt đơn virut tương tự ở cả 4 chủng dengue. Mẻ thu Đánh giá và nhận định đều dựa trên kết hoạch đầu tiên (H1) tiến hành vào ngày quả nghiên cứu từng quá trình trung gian, thứ 6 sau gây nhiễm virut, sau đó, cứ 3 từ đó tìm ra quy trình sản xuất tổng thể tối ngày/lần thu hoạch virut cho đến mẻ gặt ưu nhất. đơn thứ 4 (H4). Nhiệt độ nuôi cấy và hiệu 1. Quy trình nuôi cấy và chuẩn bị tế giá virut thu được sau mỗi mẻ gặt đơn của bào Vero. 58
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 từng chủng virut dengue được trình bày Sau khi thu hoạch virut, hỗn dịch này trong bảng 1. được ly tâm để loại trừ xác tế bào, qua lọc để loại trừ thành phần tạp nhỏ hơn. Hỗn dịch sau khi tinh sạch được cô đặc bằng màng siêu lọc. Nghiên cứu cho thấy: màng lọc 0,45 µm và màng siêu lọc 300K phù hợp để tinh sạch và cô đặc hỗn dịch virut dengue. Áp dụng các thông số này trong quy trình sản xuất để thu được hỗn dịch virut dengue với hiệu giá cao sử dụng trong Chủng rDEN2 những bước tinh chế tiếp theo. Chủng rDEN1 5. Quy trình tinh chế virut. Phương pháp tinh chế được lựa chọn là cắt axít nucleic bằng enzym và loại trừ protein tạp bằng màng siêu lọc. Khảo sát các điều kiện để cắt axít nucleic cũng như siêu lọc để đưa ra thông số tối ưu nhằm thu được virut có hiệu giá cũng như mức độ tinh khiết cao nhất. Chủng rDEN3 Chủng rDEN4 Hình 1: Hình ảnh đám hủy hoại phát hiện bằng phương pháp nhuộm hóa miễn dịch đối với 4 chủng virut dengue. Bảng 1: Kết quả nuôi cấy và thu hoạch nước nổi đối với các chủng virut dengue khác nhau. Chñng rDEN1 rDEN2 rDEN3 rDEN4 Nhiệt độ nuôi cấy virut 370C 350C 370C 370C H1 6,1 6,1 6,3 6,1 Hiệu giá virut H2 5,0 5,7 5,8 6,4 của mẻ gặt đơn (LgPFU/ml) H3 5,0 5,6 5,0 6,2 H4 4,5 5,4 4,5 6,0 1 2 3 4 5 6 Thang chuẩn Các mẻ gặt đơn của chủng dengue khác nhau đều có hiệu giá đạt yêu cầu đưa vào 1. Hỗn dịch virut sau thu hoạch. 3 sản xuất ở những bước tiếp theo (≥ 10 2. Mẫu sau tinh sạch và cô đặc. PFU/ml). Sau mẻ gặt cuối cùng, do tế bào 3, 4. Mẫu sau cắt axít nucleic. bị hủy hoại nhiều nên không thu hoạch tiếp 5, 6. Mẫu sau siêu lọc tinh chế. virut được. Hình 2: Kết quả điện di sản phẩm sau 4. Quy trình tinh sạch, cô đặc và bất tinh chế virut dengue 2 trên gel SDS-PAGE. hoạt virut. 59
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Sau khi tinh chế, hầu hết protein tạp của KẾT LUẬN tế bào đã bị loại bỏ. Đồng thời, với phương Tất cả công đoạn của quy trình sản xuất pháp xác định hàm lượng protein cho thấy vắcxin dengue trên nuôi cấy tế bào Vero lượng protein trong sản phẩm sau tinh khiết đều được nghiên cứu và thử nghiệm nhằm giảm rõ rệt so với hỗn dịch virut ban đầu. tìm ra điều kiện tối ưu nhất để có được các Sau khi cắt axít nucleic bằng enzym, lượng thông số ổn định, đảm bảo chất lượng sản ADN tế bào Vero tồn dư trong sản phẩm phẩm tốt nhất. Kết quả này góp phần xây virut tinh khiết chỉ còn từ 0 - 0,1 ng/ml (dữ dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin liệu không công bố). Như vậy, với phương dengue sống giảm độc lực hoàn chỉnh tại Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm pháp siêu lọc và cắt axít nucleic bằng enzym số 1. đã thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao. Đồng thời, hiệu giá của chủng virut thu được TÀI LIỆU THAM KHẢO sau khi tinh chế cũng đạt từ 104,4- 106,4 1. Đỗ Tuấn Đạt. Nghiên cứu xây dựng quy PFU/ml, cao hơn nhiều so với hiệu giá yêu trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cầu của 1 liều tiêm vắcxin (103 PFU/ml). Kết cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm. Đề tài cấp nhà nước KC.10.27/06-10, 2010. quả này cho thấy quy trình nghiên cứu cho 2. Blaney JE, Durbin A, Murphy BR, Whitehead sản phẩm có chất lượng và hiệu suất cao. SS. Development of live attenuated dengue virus 6. Quy trình pha bán thành phẩm cuối vaccine using reverse genetics. Viral Immunology. 2006, 19 (1), pp.10-32. cùng và sản xuất vắcxin thành phẩm. 3. Durbin A, Kirkpatrick BD, Pierce KK, Schmidt Sau khi tinh chế, xác định hiệu giá hỗn AC, Whitehead SS. Development and clinical dịch virut đơn týp và pha về hàm lượng 103 evaluation of multiple investigational monovalent PFU/liều tiêm trong đệm đông khô. Trong DENV vaccines to identify components for inclusion in a live attenuated tetravalent DENV vaccine. công thức pha bán thành phẩm vắcxin cuối Vaccine. 2011, pp.7242-7250. cùng bao gồm 4 týp virut dengue. Đông khô 4. Durbin A, Whitehead SS. Dengue vaccine bán thành phẩm cuối cùng và kiểm tra chất candidates in development. Current topics in lượng. Kết quả về chất lượng của vắcxin Microbiology and Immunology. 2010, 388, pp.129-143. thành phẩm sẽ quyết định công thức pha 5. Thomas SJ, Endy TP. Vaccine for the bán thành phẩm cuối cùng nào là tối ưu prevention of dengue: Development update. nhất (dữ liệu không công bố). Human Vaccines. 2011, 7 (6), pp.1-11. Ngày nhận bài: 30/10/2012 Ngày giao phản biện: 15/11/2012 Ngày giao bản thảo in: 6/12/2012 60
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 61