Xây dựng phương pháp định tính, định lượng hoạt chất ent - 7 - hydroxy - 15 - oxokaur -16 - en - 18 - yl acetate trong dược liệu khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.)

Nội dung text: Xây dựng phương pháp định tính, định lượng hoạt chất ent - 7 - hydroxy - 15 - oxokaur -16 - en - 18 - yl acetate trong dược liệu khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.)

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 51-59 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng hoạt chất ent-7-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetate trong dược liệu khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.) Nguyễn Văn Thoan1, Bùi Mạnh Hùng2, Nguyễn Thị Hà Ly3, Phương Thiện Thương3,* 1Viện nghiên cứu phát triển Y dược Phương Đông, 19 Nguyễn Ngọc Nai, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam 2TrườngTHPT chuyên Hà Nội - Amsterdam, Số 1, Hoàng Minh Giám, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam 3Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, 3B, Quang Trung, Hoàn Kiếm, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 3 tháng 4 năm 2017 Chỉnh sửa ngày 27 tháng 4 năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 14 tháng 6 năm 2017 Tóm tắt: Hợp chất ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl acetat (CT1) là thành phần chính của dược liệu chỉ được tìm thấy duy nhất trong loài Croton tonkinensis Gagnep. và có nhiều tác dụng dược lý quan trọng nên có thể coi là hoạt chất đặc trưng cho loài này. Tuy nhiên, Dược điển Việt Nam IV (2009) có quy định việc định tính dược liệu khổ sâm cho lá theo dược liệu đối chiếu mà chưa sử dụng chất CT1 làm chất đánh dấu. Kết quả của nghiên cứu này cho biết có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định tính chất CT1 trong dược liệu khổ sâm cho lá. Nghiên cứu cũng đã xây dựng được qui trình định lượng hợp chất CT1 trong dược liệu khổ sâm cho lá bằng kỹ thuật RP-HPLC và đã thẩm định các thông số cần thiết theo hướng dẫn chung của EMA. Kết quả định lượng chất CT1 trong một số mẫu khổ sâm thu hái tại miền Bắc cho thấy hàm lượng chất này trong lá là 0,507-1,274%, trong cành non là 0,318-0,461% và trong cành già là 0,135- 0,176%, gợi ý rằng nên thu hái lá để thu được mẫu có hàm lượng CT1 cao, dược liệu có thể có tác dụng tốt nhất. Các kết quả thu được gợi ý có thể sử dụng chất đối chiếu CT1 cho việc nâng cấp tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu khổ sâm cho lá trong chuyên luận Dược điển Việt Nam. Từ khóa: Crotonis tonkinensis, ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl acetat (CT1), reference compound, qualitative and quantitative analysis. 1. Đặt vấn đề * học chính của khổ sâm cho lá là các diterpenoid thuộc nhóm ent-kaurane, trong đó hoạt chất Trong y học dân gian Việt Nam, cây thuốc khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., chính là ent-7-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18- Euphorbiaceae) được nhân dân nhiều nơi sử yl acetate (ký hiệu là CT1), cũng cho tác dụng dụng làm thuốc chống viêm loét dạ dày, mẩn chống ung thư [4-6] và chống viêm rất mạnh ngứa, ghẻ lở, vẩy nến [1-3]. Qua nhiều nghiên trên mô hình thử in vitro (tế bào) [4-7], và mô cứu của các tác giả trước đây và các nghiên cứu hình in vivo [8]. Ngoài ra, các ent-kauran gần đây của chúng tôi cho biết, thành phần hóa diterpenoid cũng có nhiều tác dụng dược lý quan trọng khác [4, 9, 10]. Các kết quả này gợi ý rằng chất CT1 là hoạt chất chính mang lại tác _______ * Tác giả liên hệ. ĐT: 84-972872418. dụng chống viêm, giảm đau của dược liệu tiềm Email: pththuong@hpmu.edu.vn năng này nên có thể sử dụng làm chất đánh dấu trong các tiêu chí định tính, định lượng. 5 1
2. 52 N.V. Thoan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 51-59 Tìm kiếm trên các tài liệu khoa học đã công 2.2. Hóa chất và dung môi bố cho thấy có ít nghiên cứu về định tính, định lượng hoạt chất chính này trong dược liệu khổ Các dung môi methanol (MeOH), ethanol sâm cho lá. Do đó, Dược điển Việt Nam IV vẫn (EtOH), n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc), chưa có tiêu chí định tính, định lượng sử dụng toluen, benzen được mua của các công ty và đạt hợp chất đánh dấu trong việc kiểm nghiệm tiêu chuẩn phân tích. Các dung môi dùng cho dược liệu này [11]. Với những lý do trên, chúng HPLC, HPTLC được mua của hãng Merck. Bản tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 của định tính, định lượng hợp chất ent-7-hydroxy- hãng Merck. 15-oxokaur-16-en-18-yl acetate (CT1) trong 2.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu dược liệu khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.)” với mục tiêu đóng góp cơ sở khoa Thiết bị chính được dùng cho nghiên cứu học cho việc nâng cấp các tiêu chí định tính, gồm cân kỹ thuật Precisa XT 620M; cân phân định lượng cho chuyên luận Khổ sâm cho lá tích Precisa XT 220A; máy cất quay Buchi trong Dược điển Việt Nam. B481; Máy HPTLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5 và hệ thống CAMAG 2. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu REPROSTAR3 kết nối với máy vi tính; Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Shimadzu, 2.1. Nguyên liệu 2010). Chất ent-7-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18- 2.4. Phương pháp nghiên cứu yl acetate (CT1, Hình 1) được phân lập từ dược 2.4.1. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng liệu khổ sâm cho lá từ một nghiên cứu trước (TLC) đây [12]. Chất CT1 có độ tinh khiết 96% (tính Tiến hành chạy sắc ký TLC để định tính theo phần trăm diện tích pic trên máy chất CT1 trong dịch chiết từ dược liệu bằng HPLC-DAD) và cũng được thể hiện trên nhiều hệ dung môi triển khai rồi lựa chọn hệ có các phổ 1H- và 13C-NMR. Dược liệu dùng sắc ký đồ tốt nhất. Quan sát bản mỏng ở các cho định tính, định lượng chất CT1 là các bước sóng UV 254nm và 366nm; sau đó phun mẫu lá, cành của cây khổ sâm cho lá được thu thuốc thử dung dịch H2SO4 10% (TT) trong o hái ở các địa phương khác nhau vùng Bắc bộ EtOH, sấy ở 120 C đến khi hiện vết. Quan sát (Bảng 6). Các mẫu sau khi thu hái được phơi, các vết xuất hiện ở ánh sáng thường và bước sấy khô ở 50oC và lưu tại Khoa Hóa phân tích sóng UV 366 nm, so sánh giá trị hệ số di chuyển R so với chất đối chiếu CT1 [2]. - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu. f g 12 11 13 20 16 1 14 CH2 2 9 17 10 8 15 O 5 7 3 O 4 6 OH O 18 19 A B C Hình 1. Dược liệu khổ sâm cho lá và hoạt chất chính CT1. (A: cây khổ sâm cho lá; B: dược liệu khổ sâm cho lá; C: chất CT1)
3. N.V. Thoan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 51-59 53 2.4.2. Xây dựng phương pháp phân tích 2.4.3. Xử lý và đánh giá kết quả định tính và định lượng chất CT1 bằng sắc ký Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng lỏng hiệu năng cao (HPLC) phương pháp thống kê thông qua các giá trị Sử dụng phương pháp chiết bằng Soxhlet để trung bình, độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chiết xuất hợp chất từ dược liệu bằng dung môi chuẩn tương đối (RSD) [2]. MeOH. Khảo sát lựa chọn chương trình sắc ký HPLC thích hợp để định tính, định lượng hợp 3. Kết quả nghiên cứu chất CT1 trong dược liệu để tìm các điều kiện phù hợp gồm qui trình chuẩn bị mẫu từ dược 3.1. Xây dựng phương pháp định tính chất CT1 liệu và qui trình phân tích CT1 bằng HPLC pha bằng sắc kí lớp mỏng (TLC) tĩnh (cột), thành phần pha động, bước sóng phát Mẫu thử: Cân khoảng 0,1g bột lá dược liệu hiện, tốc độ dòng pha động, thể tích tiêm mẫu, hoặc 0,5g bột cành dược liệu cho vào bình nón nồng độ dung dịch thử, dung môi pha mẫu. Qui 50ml, thêm 20 ml MeOH, siêu âm 30 phút, lọc trình định lượng được thẩm định theo hướng và cô dịch lọc còn 3ml được dịch chấm sắc ký. dẫn chung của EMA bao gồm các tiêu chí: độ Mẫu đối chiếu: cân khoảng 0,5 mg chất đặc hiệu, tính thích hợp của hệ thống, độ tuyến CT1 và hòa tan trong 1ml MeOH. tính và khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ Tiến hành sắc ký: khảo sát với 04 hệ dung chính xác, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn môi (tỉ lệ thể tích/thể tích): định lượng (LOQ). Áp dụng qui trình được xây Hệ A: Hex–EtOAc (2:1); Hệ B: Toluen– dựng để tiến hành định lượng hợp chất CT1 EtOAc (7:3); Hệ C: EtOAc–EtOH–H2O trong các mẫu dược liệu Khổ sâm cho lá thu hái (8:2:1); và Hệ D: Benzen–EtOAc (95:5, theo và thu mua trên thị trường. DĐVN IV). g Hình 2. Sắc ký đồ TLC của dược liệu khổ sâm cho lá và chất CT1. Chú thích (Hình 2): C: Dịch chiết từ cành; Ch: Chất CT1; L: dịch chiết lá. Hình A và C: Quan sát dưới ánh sáng UV 366nm trước (A) và sau (C) khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH; Hình B: Quan sát dưới ánh sáng UV-254nm trước khi phun thuốc thử; Hình D: Quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH và sấy ở 120 oC.
4. 54 N.V. Thoan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 51-59 Kết quả Quan sát cho thấy hệ dung môi A cho cỡ 0,45µm (bỏ 5ml dịch lọc đầu) được dung kết quả sắc ký đồ tách tốt nhất (chất CT1 có Rf ~ dịch tiêm sắc ký. 0,4) nên được lựa chọn làm hệ dung môi khai * Khảo sát điều kiện chạy sắc ký: sau khi triển. Sắc ký đồ TLC được biểu hiện trong Hình 2 khảo sát các điều kiện và cuối cùng chúng tôi cho thấy hệ dung môi này có thể sử dụng để định đã lựa chọn được điều kiện sắc ký như sau: tính khổ sâm cho lá có chất đối chiếu CT1. - Cột: Bondapak TM C18 (3,9mm × 300mm; 5μm) 3.2. Xây dựng phương pháp phân tích định - Pha động: Acetonitril - Nước cất (65:35) tính, định lượng chất CT1 bằng sắc kí lỏng - Tốc độ dòng: 0,4ml/phút hiệu năng cao (HPLC) - Thể tích tiêm: 10µl 3.2.1. Xây dựng phương pháp - Detector: UV, bước sóng 233nm. Sắc ký đồ HPLC thu được cho các pic của * Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân chính xác chất CT1 tách rõ ràng, sắc ký đồ (Hình 3) của khoảng 5,5mg chất CT1 đối chiếu, hoà tan với mẫu thử lá và cành Khổ sâm cho lá đều có pic 5ml MeOH trong bình định mức 5,0ml (1,1 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu (tR~12,8 mg/ml). Sau đó pha loãng mẫu thành các nồng phút) của chất CT1, nhiễu nền thấp ở cả mẫu độ 5,5; 11,0; 55,0; 110,0; 150,0; 220,0 và 550,0 chuẩn và mẫu thử. Như vậy có thể dùng các điều µg/ml, lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45µm được kiện sắc ký đã lựa chọn để phân tích định tính, dãy các dung dịch chuẩn. định lượng chất CT1 trong dược liệu. * Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,5g bột lá hoặc 2,0g bột cành Khổ sâm cho lá 3.2.2. Thẩm định phương pháp cho vào bình Soxhlet. Thêm 200ml MeOH và 3.2.2.1. Độ đặc hiệu tiến hành chiết tới khi dịch chiết không còn màu. Lọc lấy dịch rồi thu hồi toàn bộ dịch chiết Tiến hành phân tích mẫu blank (methanol), thu được cắn. Hòa tan lại cắn bằng 20 ml mẫu chất CT1, mẫu lá và mẫu cành khổ sâm MeOH và cho vào bình định mức 25ml, rồi cho lá theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Các thêm MeOH đến vạch. Lọc qua màng lọc kích sắc ký đồ thu được như hình 3 (A, B, C, D). h A B C D Hình 3. Sắc ký đồ HPLC của mẫu blank (A), chất CT1 (B), các dịch chiết MeOH của lá (C) và cành (D) Khổ sâm cho lá. Kết quả thu được cho thấy tín hiệu pic của lọc phù hợp cho phân tích CT1 trong dược liệu CT1 xuất hiện tại thời gian lưu (tR~12,8 phút). khổ sâm cho lá. Trên sắc ký đồ mẫu blank, không thấy xuất hiện 3.2.2.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống tín hiệu pic tại thời gian lưu này và trên sắc ký đồ các mẫu thử lá và cành cây khổ sâm cho lá Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc có tín hiệu pic này, tín hiệu này tách khỏi các ký, tiến hành pha 01 mẫu đối chiếu có nồng độ tín hiệu khác xuất hiện trên sắc ký đồ. Điều này 150 µg/ml như mô tả ở trên. Tiến hành sắc ký chứng tỏ, phương pháp có tính đặc hiệu-chọn lặp lại 6 lần với điều kiện đã lựa chọn cho kết quả như bảng 1.
5. N.V. Thoan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 51-59 55 Bảng 1. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 TB RSD tR (phút) 12,940 12,847 12,788 12,868 12,711 12,762 12,82 0,64% Spic (AU.s) 4486896 4547020 4550541 4518464 4547086 4505756 4525961 0,58% U Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian và Độ đúng của phương pháp được xác định diện tích pic lần lượt là 0,64 và 0,58 (đều <2%). bằng phương pháp thêm chuẩn [11], tức là thêm Kết quả cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa vào mẫu L1 đã được xác định hàm lượng một chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và lượng chính xác chất CT1 sao cho tổng nồng độ đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã lượng chất CT1. khảo sát. Cụ thể, pha dung dịch mẫu chất CT1 có nồng độ 11 µg/ml và mẫu thử được pha dung 3.2.2.3. Độ tuyến tính và khoảng tuyến tính dịch thử như trên. Hút chính xác 1ml dịch thử của phương pháp định lượng và 1ml dung dịch chất CT1, lắc cho đồng đều Chuẩn bị một dãy gồm 06 dung dịch mẫu rồi tiến hành định lượng. Hiệu suất thu hồi được tính theo công đối chiếu CT1 như trên rồi tiến hành chạy sắc ký. Kết quả khảo sát (bảng 2), đường chuẩn và thức sau: phương trình hồi quy (hình 4) cho thấy với H(%) = 100%×(2×Cthực-Cnền)/Cchuẩn được thêm vào khoảng nồng độ từ 5,5 đến 550 µg/ml có sự Độ đúng của phương pháp được xác định từ tỉ lệ (%) thu hồi của chất đối chiếu thu được từ tương quan tuyến tính giữa nồng độ của chất kết quả định lượng so với lượng chất chuẩn CT1 (x) và diện tích pic (y) với phương trình thêm vào. Kết quả thu được ghi ở bảng 3 cho hồi quy: y = 33328*x + 27794 (hệ số tương 2 thấy qui trình định lượng chất CT1 có khả năng quan R = 0,999). thu hồi lại cao (> 96%, RSD < 2%), tức là 3.2.2.4. Độ đúng phương pháp này có độ đúng cao. Bảng 2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Nồng độ (µg/ml) 5,5 11 55 110 220 550 Diện tích pic (AU.s) 153184 338339 1878735 3813983 7359854 18333800 Diện tích pic 20000000 18000000 16000000 14000000 12000000 y = 33328*x + 27794 R² = 0,9999 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 0 200 400 600 nồng độ chất CT-1 (µg/ml) Hình 4. Đường chuẩn và phương trình hồi quy của chất CT1. Bảng 3. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp Số lần Lượng CT1 Lượng CT1 trung bình % tìm lại được Số liệu thống kê định lượng thêm vào (µg) tìm lại được (µg) trung bình 6 11 10,6 96,36 RSD = 1,82%
6. 56 N.V. Thoan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 51-59 t 3.2.2.5 Độ chính xác Ba Vì (mẫu L1). Kết quả thu được ở bảng 4 cho thấy hàm lượng trung bình tìm thấy chất CT1 là Độ lặp lại của phương pháp 0,8296%, RSD=0,92%. Như vậy, có thể áp Độ lặp lại của phương pháp được xác định dụng chương trình đã lựa chọn để định lượng bằng cách tiến hành 06 thí nghiệm riêng biệt để chất CT1 trong mẫu dược liệu. định lượng 01 mẫu lá khổ sâm cho lá thu hái ở Bảng 4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu L1 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Số liệu thống kê - mdược liệu (g) 0,5038 0,5098 0,4900 0,5011 0,5064 0,5015 Hàm lượng chất - 0,8356 0,8180 0,8294 0,8315 0,8389 0,8242 CT1 (%) Hàm lượng trung 0,8296 RSD = 0,92 % bình chất CT1 (%) o Độ chính xác trung gian (độ chính xác ngày) hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N; S là chiều Độ chính xác trung gian được đánh giá dựa cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu trên độ lệch chuẩn tương đối của 12 thí nghiệm đường nền). trên cùng một mẫu phân tích trong 2 ngày khác Phân tích mẫu CT1 ở nồng độ 22 μg/ml, nhau - mỗi ngày phân tích lặp lại 6 lần theo sau đó pha loãng dần đến khi dung dịch chuẩn phương pháp đã xác định. Kết quả thu được cho không còn xuất hiện tín hiệu của chất phân tích thấy các giá trị RSD thu được đều nhỏ hơn 2%, (Bảng 5). Nồng độ dung dịch chuẩn là 0,022 chứng tỏ phương pháp phân tích đạt yêu cầu về μg/ml, thì tỷ số giữa chiều cao tín hiệu và nhiễu độ chính xác khác ngày. đường nền: S/N=2H/h=2×0,6/0,4=3, đạt trong 3.2.2.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới khoảng từ 2-3. Như vậy, nồng độ 0,022 μg/ml hạn định lượng (LOQ) được coi là giới hạn phát hiện (LOD) của Để xác định LOD và LOQ, ta phân tích phương pháp. Giới hạn định lượng LOQ = 3,3 × mẫu chuẩn ở nồng độ còn có thế xuất hiện tín LOD = 0,0726 (µg/ml). hiệu của chất phân tích và xác định tỷ lệ tín Bảng 5. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD Nồng độ chất CT1 (μg/ml) 22 2,2 1,1 0,055 0,022 0,0011 S pic 687790 93799 60770 14267 10010 Không có tín hiệu O P 3.3. Kết quả định lượng chất CT1 trong các đơn vị %); C là nồng độ CT1 trong mẫu thử mẫu dược liệu tính được từ đường chuẩn (mg/ml); M là khối Với qui trình sắc ký đã lựa chọn, hàm lượng của mẫu dược liệu đem phân tích (g); b là lượng chất CT1 trong mẫu dược liệu được tính độ ẩm của mẫu dược liệu đem phân tích (%). toán theo công thức: Áp dụng quy trình đã xây dựng được để C x 25 x 100 định lượng một số mẫu lá và cành Khổ sâm cho X (mg/g) = X' (%) = X/10 M x (100 - b) lá thu hái tại miền bắc Việt Nam thu được kết quả trong Bảng 6. Trong đó X và X′ lần lượt là hàm lượng chất CT1 trong dược liệu (X - đơn vị mg/g, X′ -
7. N.V. Thoan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 51-59 57 Bảng 6. Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu lá và cành Khổ sâm Mẫu Khối Hàm lượng CT1 Ký Độ ẩm TT (Địa điểm; ngày lượng cân hiệu (%) SPic (mg/g) (% kl/kl) thu mẫu) (g) (AU.s) Các mẫu lá (ký hiệu L) Ba Vì, Hà Nội; 1 L1 0,5079 10,86 4533845 7,47 0,747 24/03/2013 Mỹ Đức, Hà Nội; 2 L2 0,5056 12,47 3951124 6,65 0,665 15/01/2013 Tp Bắc Giang, Bắc 3 L3 0,5016 11,47 6333118 10,65 1,065 Giang; 28/03/2013 Vụ Bản, Nam 4 L4 0,5090 11,46 3778022 6,24 0,624 Định; 23/03/2013 Thành phố Bắc 5 Ninh, Bắc Ninh L5 0,5101 11,22 4948023 8,15 0,815 20/04/2013 Tp Vĩnh Yên, Vĩnh 6 L6 0,5038 8,62 3136464 5,07 0,507 Phúc; 20/02/2013 Chợ Đồng Xuân, 7 Hà Nội; mua ngày L7 0,5039 12,85 3283216 5,56 0,556 12/04/2013 Phố Lãn Ông, Hà 8 Nội; mua ngày L8 0,5034 7,13 7965238 12,74 1,274 02/04/2013 Các mẫu cành (ký hiệu CN: cành non; CG: cành già) Ba Vì, Hà Nội; 9 CN1 2,0317 11,23 10065576 4,17 0,417 24/03/2013 Mỹ Đức, Hà Nội; 10 CN2 2,0128 12,78 10816935 4,61 0,461 15/01/2013 Tp Bắc Giang, Bắc 11 CN3 2,0268 11,55 10989801 4,59 0,459 Giang; 28/03/2013 Vụ Bản, Nam 12 CN4 2,0369 10,98 7726021 3,18 0,318 Định; 23/03/2013 Tp Bắc Ninh, Bắc 13 CG5 2,0906 10,59 3857283 1,54 0,154 Ninh; 20/04/2013 Tp Vĩnh Yên, Vĩnh 14 CG6 2,1856 9,17 4394492 1,65 0,165 Phúc; 20/02/2013 Chợ Đồng Xuân, 15 Hà Nội; mua ngày CG7 2,0253 6,70 3420539 1,35 0,135 12/04/2013 Phố Lãn Ông, Hà 16 Nội; mua ngày CG8 2,0311 6,69 4464215 1,76 0,176 02/04/2013 b 4. Bàn luận thấy ở bất kì loài thực vật và sinh vật nào khác, và chất này cũng là thành phần chính của dược Đến nay, hợp chất ent-7β-hydroxy-15-oxo liệu khổ sâm cho lá [4]. Do vậy, hợp chất CT1 kaur-16-en-18-yl acetat (CT1) mới chỉ được có thể coi là chất đặc trưng cho loài C. tìm thấy trong loài C. tonkinensis, chưa tìm
8. 58 N.V. Thoan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 51-59 tonkinensis, nên có thể sử dụng để nhận biết và chất đối chiếu CT1 cho việc nâng cấp tiêu đánh giá chất lượng dược liệu này. chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu khổ sâm Dược điển Việt Nam IV (2010) có quy định cho lá trong chuyên luận Dược điển Việt Nam. việc định tính dược liệu khổ sâm cho lá theo dược liệu chuẩn với hệ dung môi Benzen – EtOAc (tỷ lệ 95:5), các dấu hiệu để định tính Tài liệu tham khảo theo định hướng đến thành phần alkaloid và flavonoid mà chưa giúp nhận biết sự có mặt của [1] Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và ent-kauran diterpenoid, là thành phần hóa học động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học chính của các loài này [10]. Nghiên cứu này và Kỹ thuật, Hà Nội, tập II, tr. 87-89. dùng chất đối chiếu CT1 và hệ dung môi Hex – [2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt EtOAc (2:1) đã cho kết quả định tính rõ ràng Nam, NXB Trẻ, TP Hồ Chí Minh, tr. 622-623. bằng TLC. So với tiêu chuẩn DĐVN IV thì đã [3] Đỗ Tất Lợi (2001), Các cây thuốc và vị thuốc xác định rõ ràng hoạt chất chính (CT1) của Việt Nam, NXB Y học, tr. 826. dược liệu khổ sâm cho lá, đồng thời sử dụng [4] Phương Thiện Thương và cộng sự (2011), Tổng quan nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dung môi bớt độc hại hơn (thay benzen bằng n- dụng sinh học của cây khổ sâm cho lá, Tạp chí hexan). Hơn nữa, nghiên cứu này cũng đã Dược liệu 16 (1+2), 9-19. chứng minh rằng có thể sử dụng HPLC và chất [5] Thuong P. T. et al. (2014), ent-Kaurane đánh dấu CT1 để định tính dược liệu Khổ sâm diterpenoids from Croton tonkinensis induce cho lá, gợi ý việc bổ sung cho tiêu chuẩn apoptosis in colorectal cancer cells through the DĐVN IV mới chỉ có định tính bằng phản ứng phosphorylation of JNK mediated by reactive hóa học và TLC nhưng mới so sánh với dược oxygen species and dual-specificity JNK kinase liệu đối chiếu chứ chưa có chất đối chiếu [10]. MKK4, Anti-cancer Agents in Medicinal Chemistry 14, 1051-1061. Nghiên cứu này cũng đã xây dựng được qui [6] Kuo P.C. et al. (2007), Crotonkinins A and B trình định lượng hợp chất CT1 trong dược liệu and related diterpenoids from Croton tonkinensis khổ sâm cho lá và đã được thẩm định các thông as anti-inflammatory and antitumor agents, J. số cần thiết. Kết quả định lượng chất CT1 trong Nat. Prod. 70, 1906-1909. một số mẫu khổ sâm thu hái tại miền Bắc cho [7] Kou P.C. et al. (2013), Anti-inflammatory thấy hàm lượng chất CT1 trong lá là 0,507- diterpenoids from Croton tonkinensis, J. Nat. 1,274%, trong cành non là 0,318-0,461% và Prod. 76, 230-236. trong cành già là 0,135-0,176%. Kết quả cho [8] Nguyễn Văn Thoan và cộng sự (2016), Tác dụng thấy hàm lượng chất CT1 trong mẫu lá cao hơn chống viêm cấp và mạn của hợp chất ent-7- trong mẫu cành non là từ 1,5-2 lần và với cành hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetate từ khổ sâm cho lá, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa già từ 3-7 lần. Trong DĐVN IV có quy định học Y Dược 32 (2), 26-31. của dược liệu là lá và cành, không quy định [9] Dao T.T. et al. (2010), Sirt1 inhibitory cành con hay cành già [11]. Kết quả gợi ý nên diterpenoids from the Vietnamese medicinal thu hái lá để thu được hàm lượng chất CT1 là plant Croton tonkinensis, Planta Med. 76, cao nhất, dược liệu có thể có tác dụng tốt nhất. 1011-1014. [10] Tuan D.T. et al. (2011), ent-Kaurane diterpenoids from Croton tonkinensis stimulate osteoblast differentiation, J. Nat. 5. Kết luận Prod. 74, 2526-2531. [11] Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Nghiên cứu này đã xây dựng được phương Y học, tr. 802-803. pháp định tính và định lượng được hợp chất [12] Trần Thu Hiền và cộng sự (2016), Nghiên cứu chính của khổ sâm cho lá là CT1 trong một số chiết xuất, phân lập hợp chất diterpenoid chính mẫu lá và cành khổ sâm cho lá thu hái tại miền từ cây khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis bắc Việt Nam. Các kết quả gợi ý có thể sử dụng Gagnep.), Tạp chí Dược học 56 (483), 60-62.
9. N.V. Thoan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 51-59 59 Development of a Method for Qualitative and Quantitative Analysis of the Compound ent-7-hydroxy-15-oxokaur-16-en- 18-yl Acetate in the Medicinal Material Crotonis Tonkinensis Nguyen Van Thoan1, Bui Manh Hung2, Nguyen Thi Ha Ly3, Phuong Thien Thuong3 1Research Institute of Oriental Medicine and Pharmacy, Quoc Gia Pharmaceutical Joint-Stock Company, 119 Nguyen Ngoc Nai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam 2Hanoi-Amsterdam High School, 1 Hoang Minh Giam, Cau Giay, Hanoi, Vietnam 3National Institute of Medicinal Materials, 3B Quang Trung, Hoan Kiem, Hanoi, Vietnam Abstract: The compound ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl acetat (CT1) is the major constituent and found uniquely in the medicinal plant Croton tonkinensis Gagnep. This compound was also found to have numerous pharmaceutical activities, therefore, it should be considered as a main bioactive constituent of this plant material. However, the Vietnamese Pharmacopoeia IV (2009) postulates the qualitative analysis of this herb by thin layer chromatography (TLC) using standard sample of herbal Crotonis tonkinensis. In this study, we indicate that the material of this herb could be qualitative analysed by TLC and HPLC by using CT1 as a reference compound. The study also develops a method for quantitative analysis of the compound CT1 in the medicinal materials Crotonis tonkinensis by HPLC (column C18; UV detector at 233 nm; solvent acetonitril-water 65:35). The contents of CT1 in some Crotonis tonkinensis samples collected in northern Vietnam were determined to be 0,51–1,27 % in leaves, 0,32–0,46 % in green stems and 0,14–0,18 % in old stems, indicating that leaves contain highest amount of CT1. The results of this study suggest that the compound CT1 should be used as a reference compound for qualitative and quantitative analysis of the material herb Crotonis tonkinensis in Vietnamese Pharmacopoeia. Keywords: Crotonis tonkinensis, ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl acetat (CT1), reference compound, qualitative and quantitative analysis.