Xây dựng phương pháp định lượng polyphenol toàn phần trong đài hoa bụp giấm (hibiscus sabdariffa l.) bằng quang phổ uv - vis

Nội dung text: Xây dựng phương pháp định lượng polyphenol toàn phần trong đài hoa bụp giấm (hibiscus sabdariffa l.) bằng quang phổ uv - vis

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 XÂY D ỰNG PH ƯƠ NG PHÁP ĐỊNH L ƯỢNG POLYPHENOL TOÀN PH ẦN TRONG ĐÀI HOA B ỤP GI ẤM (Hibiscus sabdariffa L.) B ẰNG QUANG PH Ổ UV-VIS Tr ần Huy Hoàng*; Ph ạm V ăn Hi ển*; Đặng Tr ường Giang* Nguy ễn Hoàng Ngân*; V ũ Bình D ươ ng*; Ph ạm Qu ốc Bình** TÓM T ẮT Mục tiêu: xây d ựng và th ẩm đị nh ph ươ ng pháp định l ượng polyphenol toàn ph ần trong đài hoa B ụp gi ấm b ằng quang ph ổ UV-VIS. Ph ươ ng pháp : định l ượng polyphenol toàn ph ần b ằng ph ươ ng pháp đo quang d ựa trên ph ản ứng t ạo màu v ới thu ốc th ử folin-ciocalteu; th ẩm đị nh ph ươ ng pháp định l ượng theo H ướng d ẫn c ủa ICH. Kết qu ả: đã th ẩm đị nh ph ươ ng pháp trên các tiêu chí: tính t ươ ng thích h ệ th ống, độ đặ c hi ệu, kho ảng tuy ến tính, độ đúng, độ chính xác. Các tiêu chí đều đáp ứng yêu c ầu c ủa ph ươ ng pháp định l ượng theo quy đị nh. Kết lu ận: đã xây dựng và th ẩm đị nh được ph ươ ng pháp định l ượng polyphenol toàn ph ần trong đài hoa B ụp gi ấm b ằng quang ph ổ UV-VIS. * T ừ khóa: B ụp gi ấm (Hibiscus sabdariffa L.) ; UV-VIS; Polyphenol toàn ph ần. UV-VIS Spectrometry Quantification of Total Polyphenols from Calyces of Hisbicus Sabdariffa L. Summary Objectives: To validate a quantitative analysis procedure of total polyphenols in the calyces of Hisbicus sabdariffa L. using UV-VS method. Methods: Determining total polyphenols using UV-VIS method based on reaction between polyphenols and folin-ciocalteu reagent; validate this procedure according to ICH guidelines. Results: The quantitative analysis was performed by reaction between total polyphenols and folin-ciocalteu reagent with detective wavelength of 765 nm; the method was ensured to the system suitability testing, precision, linearity, recovery, accuracy. Conclusion: The quantitative analysis procedure of total polyphenols from Hisbicus sabdariffa using UV-VIS method was validated. * Keywords: Hibiscus sabdariffa L.; UV-VIS; Total polyphenol total. ĐẶT V ẤN ĐỀ hoa, qu ả để tr ị b ệnh Scorbut. Theo nghiên Cây B ụp gi ấm có tên khoa h ọc Hibiscus cứu ban đầ u c ủa chúng tôi, nhóm ho ạt sabdariffa L., h ọ Bông (Malvaceae). Ng ười ch ất chính trong đài hoa B ụp gi ấm là ta th ường dùng đài hoa có v ị chua làm polyphenol. K ết qu ả này c ũng phù h ợp gia v ị thay gi ấm, ch ế n ước gi ải khát, siro. với nghiên c ứu c ủa các tác gi ả trên th ế gi ới Lá dùng nh ư ch ất th ơm, k ết hợp v ới đài [2]. Polyphenol là nhóm h ợp ch ất quan tr ọng, * H ọc vi ện Quân y ** H ọc vi ện Y D ược h ọc C ổ truy ền Vi ệt Nam Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Vũ Bình D ươ ng2978 (vbduong@gmail.com) Ngày nh ận bài: 10/07/2017; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 13/09/2017 Ngày bài báo được đă ng: 26/09/2017 7
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 có nhi ều tác d ụng: ch ống oxy hóa, ch ống 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. ung th ư, ch ống béo phì, h ạ huy ết áp [3]. Định l ượng polyphenol toàn ph ần Cây B ụp gi ấm được s ử d ụng nhi ều trong trong d ịch chi ết d ược li ệu b ằng ph ươ ng th ời gian g ần đây ở Vi ệt Nam. Tuy nhiên, pháp đo quang sau khi ph ản ứng v ới ượ ệ ư ậ d c li u này ch a có chuyên lu n trong thu ốc th ử folin-ciocalteu [4, 5]. Hàm Dược điển Vi ệt Nam IV. Vi ệc đị nh l ượng lượng polyphenol toàn ph ần được tính polyphenol toàn ph ần trong đài hoa B ụp theo axít gallic. gi ấm có ý ngh ĩa quan tr ọng trong ki ểm tra, ki ểm soát ch ất l ượng c ủa d ược li ệu. - Dung d ịch chu ẩn axít gallic: cân chính xác 10,0 mg axít gallic chu ẩn, hòa NGUYÊN LI ỆU VÀ PH ƯƠ NG PHÁP tan trong n ước c ất để được 100 ml dung NGHIÊN C ỨU dịch chu ẩn g ốc (n ồng độ 100 µg/ml). 1. Nguyên li ệu, hoá ch ất và thi ết b ị. - Dung d ịch th ử: cân 0,5 g d ược li ệu Nguyên li ệu (độ ẩm 9,34%) cho vào bình c ầu, chi ết Đài hoa cây B ụp gi ấm ( Hibiscus bằng thi ết b ị chi ết siêu âm ở nhi ệt độ sabdariffa L.,) do Công ty TNHH H ồng 60 0C, th ời gian 30 phút b ằng 60 ml n ước Đài Vi ệt, Qu ận 4, TP. H ồ Chí Minh cung cất. L ọc thu d ịch chi ết, đị nh m ức 50 ml cấp, đạ t TCCS. bằng n ước c ất (dung d ịch th ử T). * Hóa ch ất và dung môi: - Ph ản ứng v ới thu ốc th ử folin- - Ch ất chu ẩn axít gallic, hàm l ượng ciocalteu: hút chính xác 1,0 ml dung d ịch ≥ 98% (Công ty Sigma Aldrich, M ỹ). th ử cho vào ống nghi ệm, thêm 5,0 ml - Thu ốc th ử folin-ciocalteu (Công ty thu ốc th ử folin-ciocalteu đã chu ẩn b ị ở Sigma Aldrich, M ỹ). trên, l ắc đề u trong 2 phút. Để yên ở nhi ệt - Các dung môi, hóa ch ất trong phòng độ phòng trong 10 phút. Thêm 4,0 ml thí nghi ệm: ethanol, natri carbonat đạ t dung d ịch Na 2CO 3 7,5%. L ắc đề u trong tiêu chu ẩn phân tích. 2 phút, đậy kín, để yên ở nhi ệt độ phòng * Thi ết b ị: trong 60 phút. - T ủ sấy d ược li ệu. * Th ẩm đị nh ph ươ ng pháp: - Máy đo hàm ẩm t ự độ ng SHIMADZU Th ẩm đị nh theo quy đị nh c ủa ICH [6] MOC 63u (Nh ật). các ch ỉ tiêu sau : - Máy đo quang UV-Vis Biochrom Libra + Độ ch ọn l ọc đặ c hi ệu. S70 PC (Anh). + Tính t ươ ng thích h ệ th ống. - Cân phân tích Metler độ chính xác + Xác định kho ảng tuy ến tính: trên m ột 0,1 mg (Thu ỵ S ỹ). dãy dung d ịch chu ẩn có n ồng độ t ừ 10 - - Máy chi ết siêu âm gia nhi ệt Sineo, 50 µg/ml. Xây d ựng ph ươ ng trình h ồi quy Uwave - 1.000 (Trung Qu ốc). bi ểu di ễn s ự ph ụ thu ộc tuy ến tính gi ữa - Pipet chính xác, bình định m ức các lo ại. nồng độ và độ h ấp th ụ. 2 - C ốc có m ỏ, bình nón, ống nghi ệm Yêu cầu: R ≥ 0,99. các lo ại và d ụng c ụ khác đạ t tiêu chu ẩn + Độ đúng: s ử d ụng ph ươ ng pháp phòng thí nghi ệm. thêm chu ẩn, sau đó xác đị nh độ thu h ồi. 8
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 Tỷ l ệ % tìm l ại chu ẩn được xác đị nh theo công th ức: Tỷ l ệ (%) tìm l ại = = + Độ chính xác: chu ẩn b ị các m ẫu chu ẩn ở 3 m ức n ồng độ . M ỗi n ồng độ chu ẩn b ị 3 m ẫu. Xác đị nh n ồng độ theo đường chu ẩn c ủa m ẫu trong cùng 1 ngày và khác ngày. + Tính toán k ết qu ả: t ừ độ h ấp th ụ c ủa dung d ịch, tính n ồng độ polyphenol toàn ph ần trong các dung d ịch th ử theo axít gallic. Hàm l ượng polyphenol toàn ph ần trong đài hoa B ụp gi ấm theo axít gallic được tính theo công th ức: 3 C ự x V x k x 10 th c Hàm l ượng polyphenol toàn ph ần (mg/g) = x 100 m x (100-H) Trong đó: Cth ực: n ồng độ polyphenol toàn ph ần trong dung d ịch th ử (µg/ml). V: th ể tích dung d ịch th ử (ml). k: h ệ s ố pha loãng. m: kh ối l ượng c ủa d ược li ệu (g). H: hàm ẩm c ủa b ột d ược li ệu đài hoa B ụp gi ấm (%). KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU * Xác định kho ảng tuy ến tính: 1. Th ẩm đị nh ph ươ ng pháp. Lấy chính xác 1, 2, 3, 4, 5 ml dung * Tính t ươ ng thích h ệ th ống: dịch chu ẩn g ốc cho vào các bình định Pha dung d ịch axít gallic chu ẩn có mức 10 ml. Đị nh m ức t ới v ạch b ằng n ước nồng độ 10 µg/ml t ừ dung d ịch chuẩn cất. L ắc đề u, thu được các dung d ịch có gốc. Hút chính xác 1,0 ml dung d ịch này, nồng độ thay đổ i t ươ ng đươ ng 10, 20, 30, th ực hi ện ph ản ứng v ới thu ốc th ử folin- 40, 50 µg/ml axít gallic. Hút chính xác ciocalteu. Đo độ h ấp th ụ ở b ước sóng 1,0 ml các dung d ịch trên cho vào ống 765 nm. Th ực hi ện đồ ng th ời 5 m ẫu. Độ nghi ệm được đánh s ố t ừ 1 - 5 t ươ ng ứng. hấp th ụ đo được là 0,158 ± 0,00084 (RSD Th ực hi ện ph ản ứng v ới thu ốc th ử folin- = 0,53%). Kết qu ả này cho th ấy: độ l ệch ciocalteu. Song song làm m ột m ẫu tr ắng. chu ẩn t ươ ng đối (RSD) v ề độ h ấp th ụ c ủa dung d ịch chu ẩn sau khi ph ản ứng v ới Đo độ h ấp th ụ c ủa các m ẫu ở b ước sóng thu ốc th ử folin-ciocalteu < 2%. Nh ư v ậy, 765 nm. M ối t ươ ng quan gi ữa n ồng độ và ph ươ ng pháp phân tích này t ươ ng thích độ h ấp th ụ c ủa axít gallic chu ẩn được th ể với h ệ th ống quang ph ổ UV-VIS. hi ện trong b ảng 1 và hình 1. 9
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 Bảng 1: Độ h ấp th ụ c ủa dung d ịch chu ẩn ở các n ồng độ (n = 3). STT C (µg/ml) A ( ± SD) 1 10 0,156 ± 0,001 2 20 0,301 ± 0,001 3 30 0,445 ± 0,002 4 40 0,578 ± 0,002 5 50 0,708 ± 0,001 Hình 1: Đồ th ị bi ểu di ễn s ự ph ụ thu ộc c ủa độ h ấp th ụ vào n ồng độ axít gallic chuẩn. Kết qu ả: độ h ấp th ụ và n ồng độ axít gallic có t ươ ng quan tuy ến tính ch ặt v ới h ệ s ố tươ ng quan R 2 = 0,9994 và ph ươ ng trình h ồi quy tuy ến tính là A = 0,0138 x C - 0,0231. Trong đó: A: độ h ấp th ụ c ủa dung d ịch; C: n ồng độ c ủa dung dịch axít gallic chu ẩn (µg/ml). 2. Kh ảo sát độ đúng c ủa ph ươ ng pháp. Th ực hi ện theo ph ươ ng pháp thêm chu ẩn. Thêm l ần l ượt 1,0 ml dung d ịch chu ẩn có nồng độ là 10, 20 và 30 (µg/ml) vào các ống nghi ệm ch ứa 1,0 ml dung d ịch th ử T. M ỗi mức n ồng độ thêm làm 3 m ẫu. Th ực hi ện ph ản ứng v ới thu ốc th ử folin-ciocalteu, sau đó đo quang. D ựa vào ph ươ ng trình đường chu ẩn, tính l ượng chu ẩn tìm l ại. T ừ đó, xác định ph ần tr ăm tìm l ại chu ẩn. Bảng 2: Kết qu ả kh ảo sát độ đúng c ủa ph ươ ng pháp. TT Lượng thêm vào (µg) Lượng tìm l ại (µg) Tỷ l ệ (%) tìm l ại 1 10,00 10,05 100,50 2 10,00 10,07 100,70 3 10,00 10,07 100,70 4 20,00 20,58 102,90 5 20,00 20,57 102,85 10
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 6 20,00 20,61 103,05 7 30,00 29,86 99,53 8 30,00 29,84 99,47 9 30,00 29,88 99,60 = 101,03% RSD = 1,49% Ph ươ ng pháp định l ượng có độ đúng cao v ới t ỷ l ệ % ch ất chu ẩn tìm l ại t ừ 99,47 - 103,05%, trung bình 101,03% và RSD = 1,49%. 3. Kh ảo sát độ chính xác c ủa ph ươ ng pháp. Bảng 3: Kết qu ả đánh giá độ chính xác trong ngày và khác ngày. Độ chính xác MC1 (7,5 µg/ml) MC2 (17,0 µg/ml) MC3 (35,0 µg/ml) Trong ngày (n = 3) 7,46 ± 0,13* 17,17 ± 0,07* 34,80 ± 0,17* ( ± SD, µg/ml) RSD = 1,68% RSD = 0,42% RSD = 0,48% Khác ngày (n = 6) 7,37 ± 0,14* 17,11 ± 0,13* 34,58 ± 0,29* ( ± SD, µg/ml) RSD = 1,91% RSD = 0,73% RSD = 0,85% (*: N ồng độ ngo ại suy t ừ đường chu ẩn) Chu ẩn b ị các m ẫu chu ẩn ở 3 m ức n ồng độ (7,5; 17,0; 35,0 µg/ml). M ỗi n ồng độ chu ẩn b ị 3 m ẫu. Xác đị nh n ồng độ theo đường chu ẩn c ủa các m ẫu trong cùng 1 ngày và khác ngày. Kết qu ả cho th ấy độ l ệch chu ẩn t ươ ng đối ở các điểm kh ảo sát trong ngày và khác ngày đều < 2%. Nh ư v ậy, ph ươ ng pháp có độ chính xác cao và đạt yêu cầu phân tích. 4. Hàm l ượng polyphenol toàn ph ần trong m ẫu đài hoa B ụp gi ấm. Bảng 4: Hàm l ượng polyphenol toàn ph ần trong đài hoa B ụp gi ấm. STT Hàm l ượng polyphenol toàn ph ần 1 28,51 2 29,86 3 29,69 ± SD 29,35 ± 0,73 Áp d ụng quy trình đã th ẩm đị nh để xác đị nh hàm l ượng polyphenol toàn ph ần trong mẫu d ược li ệu nghiên c ứu. K ết qu ả th ực nghi ệm cho th ấy, hàm l ượng đạ t 29,35 ± 0,73 mg/g (theo kh ối l ượng d ược li ệu khô tuy ệt đố i) tính theo axít gallic. 11
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 BÀN LU ẬN (101,63%) và độ l ặp l ại t ốt (RSD = Polyphenol là nhóm h ợp ch ất có ho ạt 3,89%). Do v ậy, ph ươ ng pháp này có th ể tính sinh h ọc m ạnh, có nhi ều tác d ụng được ứng d ụng để xây d ựng ch ỉ tiêu định nh ư ch ống oxy hóa, kháng virut, ch ống lượng d ược li ệu và các ch ế ph ẩm t ừ đài ung th ư, gi ảm lipid máu, có m ặt trong hoa B ụp gi ấm. nhi ều loài d ược li ệu [7]. Polyphenol là KẾT LU ẬN hợp ch ất có ngu ồn g ốc t ự nhiên và t ồn t ại Đã xây d ựng được ph ươ ng pháp trong th ực v ật có tác d ụng b ảo v ệ c ơ th ể, quang ph ổ UV-VIS d ựa vào ph ản ứng t ạo giúp c ơ th ể ch ống l ại nhi ều lo ại b ệnh màu v ới thu ốc th ử folin-ciocalteu để đị nh khác nhau do g ốc t ự do gây ra. Đặ c điểm lượng polyphenol toàn ph ần trong đài hoa chung c ủa chúng là trong phân t ử có Bụp gi ấm. Phươ ng pháp xây d ựng phù vòng th ơm (vòng benzen) ch ứa m ột ho ặc nhi ều nhóm hydroxyl (-OH) g ắn tr ực ti ếp hợp v ới h ệ th ống quang ph ổ UV-VIS, vào vòng benzen. Tùy thu ộc vào s ố đảm b ảo độ ch ọn l ọc đặ c hi ệu, độ đúng lượng và v ị trí t ươ ng h ỗ c ủa các nhóm cao v ới t ỷ l ệ thu h ồi 101,63% và độ chính OH v ới b ộ khung hóa h ọc mà tính ch ất lý xác cao (RSD < 2,0%). Áp d ụng ph ươ ng - hoá h ọc ho ặc ho ạt tính sinh h ọc thay đổ i pháp đã xây d ựng ở trên để xác định hàm [1]. Nhi ều nghiên c ứu cho th ấy lượng polyphenol toàn ph ần trong m ẫu polyphenol là thành ph ần chính trong d ịch đài hoa B ụp gi ấm, cho th ấy hàm l ượng chi ết n ước và ethanol c ủa đài hoa B ụp polyphenol toàn ph ần trong d ược li ệu này gi ấm [8]. Dịch chi ết polyphenol c ủa đài đạt 29,35 ± 0,73 mg/g tính theo axít gallic hoa B ụp gi ấm có tác d ụng h ạ lipid máu, (theo d ược li ệu khô tuy ệt đố i). hạ đường huy ết trên động v ật th ực nghi ệm và trên ng ười [9]. Do đó, hàm TÀI LI ỆU THAM KH ẢO lượng polyphenol toàn ph ần là tiêu chí 1. Nguy ễn V ăn Thông. Nghiên c ứu c ấu quan tr ọng để đánh giá ch ất l ượng c ủa trúc, kh ả n ăng ch ống oxy hóa c ủa m ột s ố dược li ệu này. polyphenol và d ẫn xu ất trên n ền fullerene (c60) b ằng ph ươ ng pháp hóa tính toán. 2016, Để xác đị nh hàm l ượng polyphenol tr.5-9. toàn ph ần, có th ể s ử d ụng nhi ều ph ươ ng pháp nh ư HPLC, đo quang. Tuy nhiên, 2. Fakaye T. Toxicity and immunomodulatory activity of fractions of Hibiscus sabdariffa Linn chúng tôi đã s ử d ụng ph ươ ng pháp đo (family Malvaceae) in animal models. African quang để xác định hàm l ượng polyphenol Journal of Traditional, Complementary and toàn ph ần vì d ễ th ực hi ện, nhanh chóng Alternative Medicines. 2008, 5 (4), pp.394-398. và tính chính xác cao. Ngoài ra, so v ới 3. Dickel M.l, Rates S.M.K, Ritter M.R. ph ươ ng pháp HPLC, đo quang còn ít t ốn Plants popularly used for loosing weight kém h ơn. purposes in Porto Alegre, South Brazil. Kết qu ả th ẩm đị nh cho th ấy ph ươ ng Journal of Ethnopharmacology. 2007, 109 (1), pháp đã xây d ựng có độ đúng cao pp.60-71. 12
7. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 4. Blainski A., Lopes G.C., De Mello J.C.P. 7. Herranz-López M. et al. Synergism of Application and analysis of the folin-ciocalteu plant-derived polyphenols in adipogenesis: method for the determination of the total perspectives and implications. Phytomedicine. phenolic content from Limonium Brasiliense L. 2012, 19 (3), tr.253-261. Molecules. 2013, 18 (6), pp.6852-6865. 8. Ramirez ‐Rodrigues et al. Physicochemical and phytochemical properties of cold and hot 5. Meda A. et al. Determination of the total water extraction from Hibiscus sabdariffa. phenolic, flavonoid and proline contents in Journal of Food Science. 2011, 76 (3). Burkina Fasan honey, as well as their radical 9. Peng C.H. et al. Hibiscus sabdariffa scavenging activity. Food chemistry. 2005, 91 polyphenolic extract inhibits hyperglycemia, (3), pp.571-577. hyperlipidemia, and glycation-oxidative stress 6. ICH Guide. Validation of analytical while improving insulin resistance. Journal of procedures: Methodology. International Conference agricultural and food chemistry. 2011, 59 (18), on Harmonization. Fed. Reg . 1997, 62 (2643). tr.9901-9909. 13