Xây dựng cơ sở dữ liệu và phần mềm tra cứu hla của tế bào gốc dây rốn được hiến tặng cho ngân hàng tế bào gốc mekostem

Nội dung text: Xây dựng cơ sở dữ liệu và phần mềm tra cứu hla của tế bào gốc dây rốn được hiến tặng cho ngân hàng tế bào gốc mekostem

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU VÀ PHẦN MỀM TRA CỨU HLA CỦA TẾ BÀO GỐC DÂY RỐN ĐƢỢC HIẾN TẶNG CHO NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC MEKOSTEM Nguyễn Đặng Dũng*; Nguyễn Ngọc Tuấn*; Lê Văn Đông* TÓM TẮT Với Ngân hàng Tế bào gốc (TBG), yêu cầu thiết yếu là cần có dữ liệu về kháng nguyên hßa hợp tổ chức (HLA) của mẫu TBG được lưu giữ, đồng thời có công cụ tìm kiếm và đọ HLA giữa mẫu TBG với bệnh nhân (BN) cần sử dụng TBG cho điều trị. Đề tài này tiến hành nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu về HLA của mẫu TBG dây rốn được hiến tặng cho Ngân hàng Tế bào gốc MekoStem, đồng thời phát triển phần mềm tìm kiếm và đọ HLA. Kết quả: nhóm nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên phản ứng PCR trong định týp HLA, xây dựng được cơ sở dữ liệu HLA của 100 mẫu TBG dây rốn, đồng thời phát triển phần mềm tìm kiếm và đọ HLA, cho phép lựa chọn mẫu TBG dây rốn phù hợp tốt nhất về HLA với BN cần điều trị bằng TBG. Cơ sở dữ liệu và phần mềm này có thể liên thông với cơ sở dữ liệu HLA khác và phù hợp cho sử dụng ở ngân hàng mô, tế bào cũng như dùng cho hoạt động điều phối về hiến ghép mô, tạng và tế bào. * Từ khoá: HLA; Tế bào gốc dây rốn; Xây dựng cơ sở dữ liệu HLA. RESEARCH ON ESTABLISHING HLA DATABASE AND DEVELOPING AN HLA-BASED MATCHING SOFtWARE FOR UMBILICAL CORD-DERIVED STEM CELLS AT MEKOSTEM CELL BANK SUMMARY One of the essential requirements that a Stem cell Bank must fulfill is to have HLA database of the stored stem cell samples. Besides, the bank must have an effective tool for selecting an appropriate cell sample to be used in treatment, based on finding and matching HLA specificities between the cell samples and the patients. In this study, we have successfully applied PCR-based molecular HLA typing technique to establish the HLA database of 100 umbilical cord-derived stem cell samples donated and stored in MekoStem cell Bank. In addition, we have also developed software that allows us to find a stored stem cell sample with HLA specificities which best match with those of the patient who need the stem cell for therapeutic purpose. The database and software are ready for integration with other HLA database and suitable for usage at other cell and tissue banks and also for the coordination of the cell, tissue and organ donation and transplantation programs. * Key words: HLA; Umbilical cord-derived stem cell; Establishing HLA database. * Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Hoàng Văn Lương PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn 21
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 ĐẶT VẤN ĐỀ trình nhận diện và tấn công miễn dịch loại bỏ tế bào ghép bởi cơ thể người nhận ghép Tế bào gốc (TBG) là tế bào chưa có chức (đáp ứng thải ghép), hoặc TBG được cấy năng chuyên biệt, có khả năng tăng sinh ghép sẽ tạo ra tế bào miễn dịch mới tấn mạnh mẽ, có tiềm năng phát triển thành công cơ thể người nhận (bệnh mô ghép nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng chống túc chủ). Mức độ khốc liệt của quá tự thay mới. TBG là nguyên liệu cơ bản để trình tấn công miễn dịch này tỷ lệ thuận với sử dụng trong y học tái sinh nhằm chữa mức độ khác biệt về di truyền giữa chủ một số bệnh của cơ quan tạo máu, một số nhân sinh học của TBG và người được cấy bệnh di truyền bẩm sinh liên quan đến ghép TBG [4]. Vì thế, với ngân hàng TBG chuyển hoá và suy giảm miễn dịch, ung thư công, ngoài việc bảo quản TBG, ngân hàng máu và có thể dùng để chữa được nhiều còn phải có dữ liệu về HLA của các mẫu bệnh nan y như tiểu đường, liệt do chấn thương tuỷ sống, suy tim do tổn thương cơ TBG lưu giữ cùng với công cụ quản lý và tim, một số bệnh ung thư và bệnh lý gen... đọ HLA của BN chờ ghép TBG với mẫu [3]. TBG dự tuyển trong ngân hàng [3]. Dây rốn và nhau thai nối thai nhi với hệ Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn thống tuần hoàn của người mẹ. Dây rốn trên, nghiên cứu này được triển khai nhằm chứa nhiều loại TBG, bao gồm các TBG tạo mục tiêu: Xây dựng cơ sở dữ liệu HLA của máu, TBG biểu mô, TBG trung mô, TBG nội các mẫu TBG dây rốn được sản phụ hiến mô chứa trong máu dây rốn, trong lớp gel tặng cho Ngân hàng Tế bào gốc MekoStem Wharton (Wharton’s jelly) hay trong lớp và phần mềm tra cứu HLA phục vụ cho việc màng bao dây rốn. Các TBG này có thể lựa chọn tế bào để cấy ghép. dùng để chữa bệnh hay làm nguyên liệu để nghiên cứu biệt hoá tạo ra các chế phẩm tế ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP bào phục vụ cho chữa bệnh hoặc phát triển NGHIÊN CỨU thuốc. TBG dây rốn có thể được dùng để điều trị cho chính đứa trẻ có dây rốn đó, 1. Đối tƣợng nghiên cứu. anh chị em ruột, người thân trong gia đình 100 mẫu máu dây rốn hút từ dây rốn do hoặc BN là người ngoài có đặc điểm hòa các sản phụ sinh con tình nguyện hiến dây hợp mô phù hợp với mẫu TBG dây rốn rốn trong Chương trình Xây dựng Ngân hàng được lưu giữ. Từ những lợi ích này, nhiều mẫu TBG công tại Ngân hàng TBG Mekostem. quốc gia trên thế giới đã lập các ngân hàng Đây là các mẫu máu dây rốn tương ứng với để thu thập và bảo quản đông lạnh TBG mẫu TBG dây rốn đã được xử lý thành công dây rốn [3, 5]. và lưu giữ trong ngân hàng, đủ tiêu chuẩn Trên phương diện miễn dịch, khi cấy để sẵn sàng lấy ra sử dụng khi có nhu cầu ghép TBG vào cơ thể người nhận có đặc điểm di truyền khác với TBG, sẽ xảy ra quá và BN phù hợp. 24
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 Tiêu chuẩn tuyển chọn: sản phụ > 18 tuổi, KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ có tiền sử khỏe mạnh, xét nghiệm âm tính BÀN LUẬN với virút viêm gan B, C, virút HIV, HTLV, 1. Kết quả xét nghiệm HLA. CMV, vi khuẩn giang mai và tự nguyện hiến Kết quả xét nghiệm phân tích 100 mẫu, dây rốn; trẻ sinh ra với tuổi thai > 37 tuần, sinh một, không có tai biến trong quá trình xác định được 200 allen HLA-A và 200 sinh đẻ. allen HLA-B của cả 100 mẫu. Với HLA- DB1, tổng số allen xác định được là 196; có Các hóa chất, sinh phẩm, thuốc thử, máy 2 mẫu không xác định được HLA-DRB1. móc cho định týp HLA bằng phương pháp Tổng số loại allen đã xác định được bao sinh học phân tử. gồm 14 allen HLA-A, 21 allen HLA-B và 12 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. allen HLA-DB1. Trong đó, các allen có tần * Xét nghiệm HLA: suất xuất hiện > 10% gồm: HLA-A*11, A*24, Xác định HLA lớp I và lớp II của các mẫu A*33; HLA-B*15, B*46; HLA-DRB1*12, DRB1*09, tế bào bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa DRB1*15. trên phản ứng PCR-SSP với bộ kít SSP- Bạch Khánh Hoà và CS (2008) [6] nghiên ABDR (One Lambda Inc., Mỹ) theo quy trình cứu trên quần thể 170 người Kinh Việt Nam, hướng dẫn của nhà sản xuất. Phân tích kết cùng bằng phương pháp sinh học phân tử, quả bằng phần mềm ADN/LMT405 do hãng phát hiện được số allen nhiều hơn (21 HLA- One Lambda phát triển và cung cấp kèm A, 37 HLA-B và 25 HLA-DRB1). Tuy số allen theo bộ kít xét nghiệm. Toàn bộ quy trình trong nghiên cứu của chúng tôi ít hơn (một xét nghiệm được chuẩn hóa trong một nghiên phần có thể do cỡ mẫu nhỏ hơn), nhưng cứu trước đây của chúng tôi [1] và thực có sự tương tự về allen có tần suất xuất hiện tại Labo Miễn dịch, Trung tâm Nghiên hiện > 10% trong cả hai quần thể được cứu Y Sinh Dược học Quân sự, Học viện nghiên cứu (gồm HLA-A*11, A*24, A*33, Quân y. B*15, B*46, DRB1*12). * Thiết kế phần mềm quản lý các mẫu TBG Một nhóm nghiên cứu khác của Trần trong ngân hàng: Minh Hiếu và CS (2006) khảo sát 1.278 Bằng phương pháp tham khảo phần mềm mẫu máu dây rốn thu thập ở khu vực Thành quản lý tập dữ liệu và tham khảo mô hình phố Hồ Chí Minh cho thấy, tỷ lệ các allen có các công cụ đọ kết quả xét nghiệm HLA theo tần suất xuất hiện cao là HLA-A*11, A802, hướng dẫn năm 2008 của Chương trình A*24, A*33; HLA-B*15, B*46, B840; HLA- Hiến tuỷ xương Quốc gia Hoa Kỳ (National DRB1*12, DRB1*09. Như vậy, mặc dù cỡ Marrow Donor Program HLA Matching mẫu của chúng tôi còn nhỏ, nhưng kết quả Guidelines) [5]. Tiến hành thiết kế phần thu được có sự tương đồng so với kết quả mềm quản lý có công cụ tìm kiếm và đọ của Trần Minh Hiếu và CS thực hiện bằng mẫu tế bào có trong ngân hàng theo thông phương pháp sinh học phân tử [2]. số HLA của BN cần tế bào điều trị. 25
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 Bảng 1: Tần suất các allen HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 trong 100 mẫu nghiên cứu. TẦN SUẤT TẦN SUẤT TẦN SUẤT HLA-A* n HLA-B* n HLA-DRB1* n (200 allen) (200 allen) (196 allen) 01 22 11,00% 7 14 7,00% 3 10 5,10% 02 27 13,50% 12 4 2,00% 4 17 8,70% 03 6 3,00% 13 13 6,50% 7 17 8,70% 11 49 24,50% 15 38 19,00% 8 10 5,10% 24 41 20,50% 18 2 1,00% 9 25 12,80% 26 6 3,00% 27 11 5,50% 10 14 7,10% 29 13 6,50% 35 10 5,00% 11 4 2,00% 30 2 1,00% 37 4 2,00% 12 59 30,10% 31 2 1,00% 38 5 2,50% 13 6 3,10% 33 28 14,00% 39 3 1,50% 14 12 6,10% 34 1 0,50% 40 16 8,00% 15 21 10,70% 68 1 0,50% 44 8 4,00% 16 1 0,50% 74 1 0,50% 46 25 12,50% 92 1 0,50% 48 2 1,00% 51 7 3,50% 52 2 1,00% 54 4 2,00% 55 9 4,50% 57 7 3,50% 58 12 6,00% 95 4 2,00% 2. Phần mềm tra cứu và đọ HLA. Chức năng của Ngân hàng TBG công là có các mẫu TBG được xét nghiệm HLA, sẵn sàng cung cấp để điều trị cho BN chờ ghép có chỉ số HLA phù hợp. Phần mềm quản lý Ngân hàng TBG MekoStem được thiết kế công cụ tìm kết quả HLA của một mẫu TBG nhất định lưu giữ trong ngân hàng và đọ các chỉ số HLA của BN với chỉ số HLA của các mẫu tế bào hiện có trong ngân hàng để tìm ra những mẫu TBG có mức độ phù hợp khác nhau với BN cần TBG để cấy ghép. 25
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 Để tìm thông số HLA của một mẫu tế bào đã lưu giữ và có mã số trong ngân hàng, tại cửa sổ giao diện “Mẫu tế bào HLA”, nhập mã số của mẫu cần tìm vào ô nhập mã số; kết quả tìm kiếm sẽ hiển thị thông tin về 6 allen HLA-A, HLA-B và HLA-DR của mẫu tế bào đó. Hình 1 minh họa cách tra cứu và kết quả HLA của mẫu tế bào có mã số 361. Hình 1: Cửa sổ tìm kiếm HLA của mẫu TBG có mã số 361 trong ngân hàng. Để tìm và đọ thông số HLA của một BN cần TBG để cấy ghép với HLA của mẫu tế bào lưu giữ trong ngân hàng, tại cửa sổ giao diện “Tìm mẫu tế bào phù hợp HLA”, nhập thông số HLA của BN vào cửa sổ nhập dữ liệu HLA của BN ở phía trên để tìm kiếm. Kết quả tìm kiếm sẽ hiển thị thông tin về HLA của mẫu TBG lưu giữ trong ngân hàng có các chỉ số HLA phù hợp với BN. Hình 2 và 3 minh họa kết quả tìm và đọ HLA của BN có các chỉ số HLA là: HLA-A: 24, 02; HLA-B: 55, 48; HLA-DRB1: 04, 12. Hình 2 là kết quả khi nhập cả 6 allen của BN vào cửa sổ tra cứu. Kết quả mẫu TBG số 229 của ngân hàng phù hợp cả 6/6 allen với HLA của BN cần TBG. Hình 2: Cửa sổ đọ dữ liệu HLA (cả 6 allen) của BN với mẫu TBG có trong ngân hàng. 26
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 Phần mềm cho phép tìm kiếm chọn lọc theo số allen từ 1 - 6. Số lượng allen càng nhiều, tính chọn lọc càng cao. Nếu quan tâm nhiều đến HLA-DRB1, có thể nhập thông tin về 2 allen của HLA-DRB1 trước, phần mềm sẽ cho ra kết quả của những mẫu có cùng chỉ số HLA-DRB1. Hình 3 là kết quả tìm kiếm cho thấy có 5 mẫu TBG trong ngân hàng có cùng chỉ số HLA-DRB1 với HLA của BN. Tính năng này cho phép trong trường hợp không phù hợp được tuyệt đối cả 6/6 allen, có thể cân nhắc lựa chọn những mẫu tương đối phù hợp hơn để có thể cấy ghép cho BN nếu cần. Hình 3: Kết quả tìm kiếm mẫu TBG phù hợp về 2 allen HLA-DRB1. Nhiệm vụ của ngân hàng TBG là phân - Mỗi mẫu TBG cần có một mã số riêng lập, bảo quản lâu dài và cung cấp mẫu TBG biệt, thông tin rõ ràng và đầy đủ, cho phép cho yêu cầu điều trị và nghiên cứu khoa tìm kiếm và truy nguyên nguồn gốc của học. Bên cạnh nh÷ng yêu cầu về quản lý mẫu TBG. chất lượng TBG, yêu cầu về quản lý thông tin cũng đóng một vai trò quan trọng trong - Kết quả xét nghiệm HLA-A, HLA-B hoạt động của ngân hàng. Theo yêu cầu và HLA-DRB1, trong đó, HLA-A và HLA-B của Chương trình Người hiến tuỷ xương có thể xét nghiệm bằng phương pháp Quốc gia (NMDP, Mỹ), một ngân hàng TBG huyết thanh học hoặc bằng phương pháp máu dây rốn tối thiểu phải có > 100 mẫu TBG, trong đó, mỗi mẫu tế bào phải có ít sinh học phân tử, còn HLA-DRB1 được nhất những thông tin sau [5]: xét nghiệm bằng phương pháp sinh học phân tử. 27
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 - Quy trình tìm kiếm và cung cấp mẫu TÀI LIỆU THAM KHẢO TBG, trong đó có các công cụ tìm kiếm mẫu tế bào dựa trên những tiêu chí khác nhau, 1. Nguyễn Đặng Dũng, Nguyễn Ngọc Tuấn. đặc biệt là công cụ đọ kết quả HLA và đánh Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử giá mức độ phù hợp về HLA giữa người trong xác định HLA. Tạp chí Y- Dược học Quân nhận cần TBG để cấy ghép và mẫu TBG có sự, 2011, tập 36, số 6, tr.45-51. trong ngân hàng. 2. Trần Minh Hiếu, Bửu Mật, Trần Văn Bé. Căn cứ vào yêu cầu trên cho thấy, kết Khảo sát HLA-A, HLA-B, HLA-DR từ máu cuống quả nghiên cứu của đề tài này đóng góp rốn bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Y học Việt quan trọng giúp Ngân hàng TBG MekoStem Nam. 2006, số 5, tr.4-7. đáp ứng được những yêu cầu thiết yếu của một ngân hàng TBG mà Chương trình 3. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Người hiến tuỷ xương Quốc gia (Hoa Kỳ) Định. Công nghệ TBG. NXB Giáo dục. 2009. đã khuyến cáo. Mặt khác, cơ sở dữ liệu và 4. Vũ Dương Quý, Phạm Mạnh Hùng. Miễn phần mềm tra cứu và đọ HLA này có thể dịch ghép trong “Miễn dịch học”. NXB Y học. liên thông với cơ sở dữ liệu HLA khác, phù 2006, tr.277-290. hợp cho sử dụng ở các ngân hàng mô, tế bào khác. Bên cạnh đó, cách tìm và đọ HLA 5. Bray R. A, Hurley C.K, et al. National này cũng dựa trên cùng nguyên tắc áp Marrow Donor Program HLA Matching Guidelines dụng cho hoạt động điều phối về hiến ghép for unrelated adult donor hematopoietic cell mô, tạng và tế bào. transplants. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 2008, No 14, pp.45-53. KẾT LUẬN 6. Hoa BK, Hang NT, Kashiwase K, Ohashi J, Bằng kỹ thuật sinh học phân tử, đã tiến Lien LT, Horie T, Shojima J, Hijikata M, hành xét nghiệm xác định HLA, xây dựng Sakurada S, Satake M, et al. HLA-A, -B, -C, được cơ sở dữ liệu HLA lớp I và lớp II của -DRB1 and -DQB1 alleles and haplotypes in the 100 mẫu TBG dây rốn lưu giữ tại Ngân Kinh population in Vietnam. Tissue Antigens. hàng TBG MekoStem, đã phát triển được 2008, Vol 71, No 2, pp.127-134. phần mềm tìm kiếm và đọ HLA của một BN bất kỳ với HLA của các mẫu TBG dây rốn hiến tặng đang lưu giữ và có trong cơ sở dữ liệu của Ngân hàng TBG MekoStem. Ngày nhận bài: 16/5/2012 Ngày giao phản biện: 25/7/2012 Ngày giao bản thảo in: 31/8/2012 28
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 29