Xác định hàm lượng lycopen trong một số dược liệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Xác định hàm lượng lycopen trong một số dược liệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYCOPEN TRONG MỘT SỐ DƢỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Văn Thịnh*; Vũ Tuấn Anh*; Đặng Trường Giang* TrÇn ThÞ Oanh**; Chử Đức Thành* TÓM TẮT Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector PDA được nghiên cứu thẩm định để định lượng lycopen trong một số dược liệu. Phương pháp phân tích sử dụng cột Phenomenex Develosil C30 (10 mm x 250 mm), 5 µm với pha động, bao gồm methyl-tert butyl ether (MtBE), ethyl acetate, methanol (45:45:10, % v/v), tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Giới hạn định lượng được xác định từ 1 - 100 mg/ml. Các giá trị độ lệch chuẩn tương đối của quy trình phân tích nhỏ hơn 4,5%. Sử dụng phương pháp để định lượng lycopen trong gấc và cà chua đã sấy khô cho kết quả lần lượt là 0,271% và 0,072%. * Từ khóa: Lycopen; Màng gấc; Cà chua; Sắc ký lỏng hiệu năng cao. HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF LYCOPENE IN SOME PLANT MATERIALS SUMmARY A simple and sensitive isocratic method of HPLC with photodiode array detector was developed and validated for determination of lycopene in some plant materials. The method utilizes Phenomenex Develosil C30 column (10 mm x 250 mm), 5 µm particle size and a mobile phase consisting of methyl-tert butyl ether (MtBE), ethyl acetate, methanol (45:45:10, % v/v) at a flow rate of 1.0 ml/min. The method was validated for the concentration range 1 - 100 mg/ml. Relative standard deviations were less than 4.5%. The contents of lycopene in the dried aril of Momordica cochinchinesis and dried tomato determined by the validated method were about 0.271% and 0.072% respectively. * Key words: Lycopene; Gac aril; Tomato; HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ pháp phân tích đơn giản và có khả năng xác định hàm lượng lycopen trong dược Trên thế giới, lycopen được ứng dụng liệu có chứa các carotenoid khác rất cần rộng rãi trong công nghiệp sản xuất dược cho việc kiểm soát chất lượng sản phẩm và phẩm và mỹ phẩm. Hàm lượng lycopen nguyên liệu chứa lycopen. Trong bài báo được biết cao nhất trong màng gấc và cà này, chúng tôi trình bày một phương pháp chua. Hiện nay, ở Việt Nam có những khu phân tích lycopen đơn giản đã được thẩm vực trồng gấc với quy mô lớn để xuất khẩu định và kết quả định lượng lycopen trong và phục vụ cho việc sản xuất trong nước một số dược liệu bằng HPLC. các sản phẩm chứa lycopen và carotenoid khác. Vì vậy, việc xây dựng một phương * Học viện Quân y ** Bộ Y tế Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Thịnh thinhnv@hotmail.com 7
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Qua khảo sát chúng tôi xác định được NGHIÊN CỨU quy trình xử lý mẫu để định lượng lycopen 1. Nguyên liệu và thiết bị. trong màng gấc như sau: cân chính xác 1 g bột màng gấc khô (đã xác định hàm Èm), * Nguyên liệu: thêm 50 ml chloroform, chiết siêu âm trong Màng gấc mua từ Công ty Cổ phần Nông o 2 giờ, lọc lấy dịch chloroform. Tiến hành nghiệp Đông Phương, bảo quản ở -20 C trước quá trình chiết như vậy thêm một lần nữa. khi sử dụng. Cà chua mua tại khu vực Sơn Gộp dịch chiết chloroform. Lọc qua màng Tây, Thành phố Hà Nội. Chuẩn lycopen mua lọc kích thước 0,45 µm, thu được dung dịch từ hãng Sigma-Aldrich. Các hóa chất dung thử để định lượng lycopen trong màng gấc. môi tinh khiết khác đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC. Mẫu thử cà chua được chuẩn bị như * Thiết bị: sau: xay 1 kg cà chua tươi với cồn tuyệt đối (1:4, m/m) được thêm 0,1% BHA. Lọc lấy Hệ thống HPLC Alliance Water 2695D: phần bã cà chua qua phễu lọc, sau đó làm 4 kênh dung môi, autosampler, buồng gia khô phần bã cà chua dưới áp suất giảm. nhiệt cột, Detector PDA, Cột Phenomenex Lấy 10 g cà chua khô chiết siêu âm với 50 ml Develosil C30, 5 µm, 10 mm x 250 mm. chloroform trong 2 giờ. Lọc lấy dịch chiết và 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. lặp lại quá trình chiết như vậy thêm một lần Xây dựng quy trình phân tích lycopen trong nữa. Gộp dịch chiết, lọc qua màng lọc kích một số dược liệu như màng gấc và cà chua thước 0,45 µm và đem phân tích sắc ký. sấy khô. 2. Chọn điều kiện sắc ký và thẩm định Tiến hành thẩm định phương pháp trên phƣơng pháp. các mẫu dược liệu về độ đặc hiệu, tính thích hợp của hệ thống, khoảng tuyến tính, độ Trên cơ sở tham khảo các tài liệu, chọn lặp lại, độ đúng. những điều kiện sắc ký tương đối phù hợp như sau: Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng lycopen có trong hai Cột sắc ký Phenomenex Develosil C30, dược liệu trên. 5 µm, 10 mm x 250 mm. Detector PDA, λ = 470 nm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ Pha động: methyl-tert butyl ether (MtBE): BÀN LUẬN ethyl acetate:methanol (45:45:10, v/v/v). 1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. * Dung dịch chuẩn: Thể tích tiêm: 10 µl. Hòa tan hoàn toàn 1,0 mg lycopen chuẩn Tiến hành thẩm định phương pháp định vào 5 ml chloroform trong bình định mức lượng lycopen với những nội dung sau: 10 ml. Thêm chloroform vừa đủ đến vạch, khoảng tuyến tính, xác định giới hạn định lắc đều. Tiến hành pha loãng bằng chloroform lượng dưới (LLOQ), độ lặp lại và độ đúng. để thu được những nồng độ khác nhau. Lắc * Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đều và lọc qua màng lọc 0,45 µm, được dung đường chuẩn: dịch chuẩn để phân tích sắc ký. Pha dung dịch lycopen chuẩn có nồng * Chuẩn bị mẫu thử từ dược liệu: độ trong khoảng 1 - 100 mg/ml. Tiến hành sắc ký như điều kiện đã chọn. 8
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Bảng 1: Khảo sát độ lặp lại khi định lượng * Định tính lycopen trong màng gấc và lycopen trong màng gấc khô. kiểm tra sự phù hợp: NỒNG ĐỘ ĐỘ HẤP THỤ ĐỘ ĐÚNG Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn (nồng (àg/ml) (mAU.s) (%) độ 10 µg/ml) và các dung dịch thử theo điều kiện sắc ký đã chọn. 100 15359795 104,5 Kết quả cho thấy các dung dịch thử đều 50 7448965 101,6 cho píc có thời gian lưu ứng với lycopen 20 2880797 98,8 (ở khoảng 21 phút) và tách riêng khỏi các píc khác nhau trong sắc ký đồ. 10 1409123 97,7 5 697482 98,6 2 255347 96,4 1 122029 102,3 Kết quả khảo sát cho thấy diện tích píc (S) và nồng độ (C) tương quan chặt chẽ với hệ số tương quan R là 0,9998. Phương trình đường chuẩn được xây dựng là: S = 147187, 6C - 28502. Hình 2: Sắc ký đồ dung dịch lycopen chuẩn * Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ): 10 µg/ml. Giới hạn định lượng dưới của phương pháp phân tích là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu có thể được định lượng với độ đúng và độ chính xác theo yêu cầu. Đáp ứng chất phân tích tại nồng độ giới hạn định lượng dưới phải không nhỏ hơn 5 lần đáp ứng tại cùng thời gian lưu ở mẫu trắng. Xác định LLOQ trong phương pháp định lượng là 0,1 µg/ml. Hình 3: Sắc ký đồ dịch chiết màng gấc. Hình 1: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn tương ứng với LLOQ. Hình 4: Sắc ký đồ dịch chiết cà chua sấy khô. 9
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 0.035 471.4 Độ đúng của phương pháp được xác định 503.0 0.030 bằng cách thêm chuẩn vào mẫu thử sao cho nồng độ của lycopen vẫn nằm trong 0.025 444.8 khoảng tuyến tính đã khảo sát. Sau đó, xử 0.020 lý các mẫu thử theo quy trình đã xây dựng. AU Tiến hành sắc ký và tính toán kết quả. 0.015 Bảng 3: Kiểm tra độ đúng phương pháp 0.010 định lượng lycopen trong màng gấc. 0.005 359.8 KHỐI LƯỢNG LƯỢNG TỶ LỆ MẪU 0.000 DƯỢC LIỆU (g) CHUẨN THÊM TÌM LẠI (%) 340.00 360.00 380.00 400.00 420.00 440.00 460.00 480.00 500.00 520.00 540.00 (mg) nm 1 0,1984 0,2 93,23 Hình 5: Phổ hấp thụ của lycopen xác định 2 0,2092 0,2 96,48 bằng detector PDA 3 0,2075 0,2 96,71 * Độ lặp lại: 4 0,2112 0,2 94,02 Xác định độ lặp lại trên 6 mẫu thử chuẩn 5 0,2018 0,2 93,98 bị theo quy trình xử lý mẫu. Tiến hành sắc 6 0,2105 0,2 93,67 ký theo điều kiện đã chọn, sau đó tính hàm Trung bình 94,68 lượng lycopen có trong dược liệu. Bảng 2: Khảo sát độ lặp lại khi định lượng Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng tương đối tốt trong khoảng khảo sát với khả lycopen trong màng gấc khô. năng tìm lại trung bình đạt được là 94,68% LƯỢNG HÀM KHỐI LƯỢNG (93,23 - 96,71%). MẪU LYCOPENE L Ư Ợ NG MÀNG GẤC (g) TÌM THẤY (mg) (%) 3. Định lƣợng lycopen trong màng gấc và cà chua sấy khô. 1 1,0022 2,71 0,270 Bảng 4: Kết quả định lượng lycopen trong 2 0,9982 2,73 0,273 cà chua sấy khô. 3 0,9989 2,77 0,277 LƯỢNG HÀM KHỐI LƯỢNG LYCOPENE L Ư ỢNG 4 0,9946 2,68 0,269 MẪU DƯỢC LIỆU TÌM THẤY (mg) (%) 5 1,0061 2,73 0,271 1 10,0122 7,61 0,076 6 1,0007 2,66 0,266 2 10,1021 7,17 0,071 Hàm lượng trung bình (%) 0,271 3 10,0823 7,26 0,072 RSD (%) 1,4 4 10,0642 7,04 0,070 Kết quả thử độ lặp lại của phương pháp 5 10,0072 6,90 0,069 cho thấy trong các điều kiện sắc ký đã 6 10,0724 7,76 0,077 chọn, độ lệch chuẩn tương đối thu được là Hàm lượng trung bình (%) 0,072 1,4%. Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu RSD (%) 4,5 về độ lặp lại của quy trình phân tích mẫu. Chuẩn bị 6 dung dịch thử cho mỗi mẫu * Độ đúng: thử theo quy trình xử lý mẫu. Tiến hành sắc 10
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 ký như điều kiện đã chọn và ghi kết quả TÀI LIỆU THAM KHẢO diện tích píc tương ứng với mỗi mẫu thử. 1. Betty K. Ishida et al. A simple, rapid Tính kết quả và suy ra nồng độ của lycopen method for HPLC analysis of lycopene isomers. trong mẫu thử đem ra định lượng. Phytochemical Analysis. 2001, pp.194-198. Kết quả định lượng cho thấy lycopen có 2. Betty K. Ishida et al. Fatty acid and carotenoid trong màng gấc khô với hàm lượng khoảng composition of Gac (Momordica cochinchinensis 0,271%, còn trong cà chua sấy khô, hàm Spreng) fruit. Journal of Agricultural and Food lượng này 0,072%. Chemistry. 2004, pp.274-279. 3. Hiromitsu AOKI et al. Carotenoid pigments KẾT LUẬN in GAC fruit (Momordica cochinchinensis SPRENG). Bioscience, Biotechnology, and Phương pháp HPLC xây dựng được có Biochemistry. 2002, pp.2479-2482. thể áp dụng để định lượng lycopen trong một 4. Le Thuy Vuong et al. Momordica cochinchinensis số dược liệu với cách xử lý mẫu thích hợp. Spreng (Gac) fruit carotenoids reevaluated. Ứng dụng phương pháp đã xác định được Journal of Food Composition and Analysis. hàm lượng lycopen trong màng gấc khô và 2006, pp.664-668. cà chua sấy khô đã khảo sát tương ứng là 6. Lan Cao-Hoang et al. Stability of carotenoid 0,271% và 0,072%. extracts of Gac (Momordica cochinchinensis) towards cooxidation - Protective effect of lycopene on β-carotene. Food Research International. 2011, pp.2252-2257. Ngày nhận bài: 3/4/2013 Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/5/2013 Ngày bài báo được đăng: 23/5/2013 11
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 12