Xác định hàm lượng ginsenoside rb1, re, rg1 trong sâm ngọc linh tự nhiên và sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Xác định hàm lượng ginsenoside rb1, re, rg1 trong sâm ngọc linh tự nhiên và sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 TRONG SÂM NGỌC LINH TỰ NHIÊN VÀ SINH KHỐI TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO Trần Quang Trung*; Phan Thị Thu Hằng*; Nguyễn Văn Bạch* TÓM TẮT Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) để định lượng 3 ginsenoside (Rb1, Re và Rg1) trong sâm Ngọc Linh và trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh, kết quả cho thấy: + Hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh lần lượt là: 1,0916%, 0,1226% và 1,4215%. + Hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh lần lượt là: 0,3281%, 0,0817% và 0,3646%. Như vậy, tổng hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh gấp 3,4 lần tổng hàm lượng của 3 ginsenoside này trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh. * Từ khoá: Sâm Ngọc Linh; Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao. DETERMINATION OF GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 IN NATURAL NGOCLINH GINSENG AND ITS PLANT CELL BY HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY SUMMARY Applying the method to quantifying ginsenoside Rb1, Re, Rg1 in natural Ngọclinh ginseng and its plant cell, the result showed that: - The quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 of natural Ngọclinh ginseng was 1.0916% 0.1226% and 1.4215%, respectively. - The quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 of Ngọclinh ginseng’s plant cell was 0.3281%, 0.0817% and 0.3646%, respectively. The data indicated that total quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 in 100 grams of natural Ngọclinh ginseng was 3.4 times as much as its total quantity in 100 grams of Ngọclinh ginseng’s plant cell. * Key words: Ngoclinh ginseng, High performance thin layer chromatography. * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Trần Quang Trung (tranquangtrunghvqy@yahoo.com) Ngày nhận bài: 26/12/2012; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 19/11/2013 25
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 ĐẶT VẤN ĐỀ VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Sâm Ngọc Linh là dược liệu quý sinh 1. Vật liệu nghiên cứu trưởng ở núi Ngọc Linh thuộc 2 tỉnh * Nguyên liệu, dung môi, hoá chất: Quảng Nam và Kon Tum [2]. Ngoài ra, từ sâm Ngọc Linh tự nhiên, Học viện - Thân rễ (củ) sâm Ngọc Linh tự nhiên Quân y đã nghiên cứu, sản xuất thành trên 10 năm tuổi (đã được Viện Dược công sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh. liệu - Bộ Y tế thẩm định). Ginsenoside Rb1, Re, Rg1 là 3 hoạt chất - Sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh chính thuộc nhóm dammaran có trong (do Trung tâm Nghiên cứu Y học quân sự, sâm Ngọc Linh tự nhiên và trong sinh Học viện Quân y cung cấp). khối tế bào sâm Ngọc Linh. Để tiêu - Chất chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1 chuẩn hoá chất lượng của nguyên liệu và loại SH (Hãng Chromadex, Mỹ). các thành phẩm từ sâm Ngọc Linh tự - Các dung môi, hoá chất: đạt tiêu nhiên và sinh khối tế bào sâm Ngọc chuẩn PA. Linh, việc xác định hàm lượng 3 hoạt * Dụng cụ và trang thiết bị: chất trên là việc làm rất cần thiết. - Hệ thống HPTLC của Hãng DESAGA. Hiện nay, một số dược điển đã ứng - Bản mỏng HPTLC 10 x 10 cm; 20 x dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để 10 cm; 20 x 20 cm. định lượng các chất trong phân tích định - Micropipet 2 l; pipet tự động 1 - lượng [3]. Tuy nhiên ở Việt Nam, chưa 10 l, 1 - 20 l, 100 l, 200 l, 500 l. có đề tài nào áp dụng phương pháp - Cột chiết pha rắn C18. HPTLC để xác định hàm lượng của - Máy lắc siêu âm Soniclean của ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Australia. Ngọc Linh tự nhiên và sinh khối tế bào sâm Ngọc linh. Vì vậy, chúng tôi tiến - Máy ly tâm. hành nghiên cứu xác định hàm lượng - Cân phân tích Mettler có độ chính ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm xác 0,1 mg. Ngọc Linh tự nhiên và trong sinh khối tế - Dụng cụ chiết Soxhlet. bào sâm Ngọc Linh bằng phương pháp - Các loại dụng cụ thuỷ tinh có độ HPTLC. chính xác thích hợp. 26
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. methanol 30% với tốc độ 20 - 25 giọt/phút. * Xây dựng đường chuẩn các gensenosid Bỏ các dịch rửa. Rửa giải bằng 40 ml Rb1, Re, Rg1: methanol. Lấy dịch rửa giải cô tới khô trên cách thuỷ. Hoà tan cắn trong 10 ml Từ các chất chuẩn, pha dãy dung dịch ethanol đem đi chấm sắc ký. Rb1, Re, Rg1 có nồng độ khoảng 50, 150, 250, 350 và 450 mcg/ml. Tiến hành HPTLC * Phương pháp xử lý mẫu: theo điều kiện của Trần Quang Trung và - Mẫu thử: CS đã xây dựng [4]. + Thân rễ (củ) sâm Ngọc Linh tự nhiên * Chiết xuất saponin toàn phần trong rửa sạch, thái lát mỏng hoặc sinh khối mẫu thử: tế bào sâm Ngọc Linh, sấy khô ở 600C Cân chính xác 1 gam bột sâm Ngọc trong 20 giờ. Nghiền thành bột. Linh (hoặc sinh khối tế bào sâm Ngọc + Cân chính xác 1 gam bột, chiết theo Linh) cho vào bình nón dung tích 100 quy trình thu được dịch ethanol chấm ml, gắn được với bộ phận hồi lưu. Thêm sắc ký. chính xác 50 ml methanol. Cân khối - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: lượng của bình nón đã chứa mẫu (bao + Chuẩn hỗn hợp 1: pha dung dịch gồm cả nắp) được khối lượng m . Đun 1 có ginsenoside Rb nồng độ 51,1875 hồi lưu cách thủy trong 1 giờ (tính từ lúc 1 mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ sôi). Để nguội bình nón và cân lại khối 20,0625 mcg/ml; ginsenoside Rg nồng lượng bình nón (gồm cả nắp) được khối 1 độ 51,475 mcg/ml. lượng m2. Nếu m2 < m1, thêm methanol vào bình nón sau khi đun hồi lưu cho + Chuẩn hỗn hợp 2: pha dung dịch có ginsenoside Rb1 nồng độ 150,9375 mcg/ml; đến khi đạt đến khối lượng m1 ban đầu. Ly tâm với tốc độ 2.500 vòng/phút trong ginsenoside Re nồng độ 40,125 mcg/ml; 10 phút. ginsenoside Rg1 nồng độ 200,575 mcg/ml. Hút chính xác 25 ml dịch trong sau + Chuẩn hỗn hợp 3: pha dung dịch khi ly tâm. Cô khô trên cách thủy. Hoà ginsenoside Rb1 nồng độ 250,6875 tan cắn trong 5 ml nước cất. Sau đó, ứng mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ dụng phương pháp chiết pha rắn để xử 60,1875 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng lý mẫu [1]. Cụ thể: cho dịch qua cột độ 351,45 mcg/ml. chiết pha rắn (C18, 360 mg) đã được hoạt + Chuẩn hỗn hợp 4: pha dung dịch hoá lần lượt bằng 5 ml methanol, 5 ml ginsenoside Rb1 nồng độ 350,4375 mcg/ml; methanol 50%, 5 ml H2O cất. Rửa cột đã ginsenoside Re nồng độ 80,25 mcg/ml; chứa mẫu lần lượt với 20 ml nước, 10 ml ginsenoside Rg1 nồng độ 500,55 mcg/ml. 27
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 + Chuẩn hỗn hợp 5: pha dung dịch - Bản mỏng HPTLC 20 x 10 cm hoạt 0 ginsenoside Rb1 nồng độ 450,1875 hóa ở 100 C trong 30 phút. mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ - Thuốc thử hiện màu: dung dịch H2SO4 100,3125 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng 10% trong ethanol. độ 651,425 mcg/ml. Tiến hành định lượng bằng cách dựa * Định lượng các mẫu thử sâm Ngọc vào đường chuẩn. Diện tích pic mẫu thử Linh tự nhiên và các mẫu thử sinh khối và mẫu chuẩn thực hiện trong cùng một tế bào sâm Ngọc Linh: điều kiện sắc ký. Từ đó, tính hàm lượng - Dung dịch thử: dịch chiết saponin toàn (%) ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong mẫu phần các mẫu thử sâm Ngọc Linh tự nhiên sâm Ngọc linh tự nhiên và mẫu sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh theo công thức sau: và sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh. Dung dịch chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong ethanol. Trong đó: Chấm lần lượt 20 l mỗi dung dịch thử Ct: nồng độ (mcg/ml) của ginsenoside và dung dịch chuẩn hỗn hợp lên bản mỏng Rb1 (hoặc Re, Rg1) tương ứng với diện HPTLC và tiến hành sắc ký với các điều tích pic thu được từ phổ đồ thông qua kiện sau: đường chuẩn. - Máy HPTLC (Hãng DESAGA). m: khối lượng (g) của sâm Ngọc Linh tự - Pha động: chloroform/AcOEt/MeOH/ nhiên hoặc sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh. H2O (15/40/22/10). k: hệ số pha loãng dung dịch thử. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của Rb1, Re, Rg1. Nồng độ (mcg/ml) Hình 1: Đường chuẩn ginsenoside Rb1 28
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Nồng độ (mcg/ml) Hình 2: Đường chuẩn ginsenoside Re. Nồng độ (mcg/ml) Hình 3: Đường chuẩn ginsenoside Rg1. Trong khoảng nồng độ khảo sát 2. Kết quả xác định Rb1, Re, Rg1 (50 - 450 mcg/ml) có sự tương quan trong mẫu thử sâm Ngọc Linh tự nhiên và mẫu thử sinh khối tế bào sâm Ngọc tuyến tính giữa nồng độ nồng độ các Linh bằng phƣơng pháp HPTLC. ginsenoside Rb , Re, Rg với diện tích 1 1 * Tạo mẫu thử: pic và r 1. Các đường chuẩn này có - Mẫu thử 1: cân chính xác 1 gam bột thể sử dụng để định lượng 3 ginsenoside sâm Ngọc Linh tự nhiên, chiết xuất theo Rb1, Re, Rg1 trong mẫu sâm Ngọc Linh quy trình trên, thu được dịch ethanol tự nhiên và sinh khối tế bào sâm saponin toàn phần sâm Ngọc Linh tự Ngọc Linh. nhiên chấm sắc ký. 29
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 - Mẫu thử 2: cân chính xác 1 gam bột Bảng 2: Hàm lượng các ginsenoside sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh, chiết trong mẫu sinh khối tế bào sâm Ngọc xuất theo quy trình trên, thu được dịch Linh. ethanol saponin toàn phần sinh khối tế CÁC HÀM LƯỢNG STT bào sâm Ngọc Linh chấm sắc ký. GINSENOSIDE (%) * Tiến hành định lượng: 1 Ginsenoside Rb1 0,3281 ± 0,0197 - Chuẩn bị bản mỏng HPTLC có kích 2 Ginsenoside Rg 0,3646 ± 0,0243 thước 10 x 10 cm. 1 3 Ginsenoside Re 0,0817 ± 0,0073 - Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 1000C trong 30 phút. Tổng 0,7744 ± 0,062 - Chấm mẫu thử và dung dịch chuẩn Tổng hàm lượng 3 ginsenoside Rb1, hỗn hợp ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với Re, Rg1 trong 100 g sâm Ngọc Linh là thể tích 20 l lên bản mỏng đã sấy. 2,6357%. Trong khi đó, hàm lượng của - Triển khai sắc ký với hệ dung môi: 3 ginsenoside trên trong sinh khối tế bào chloroform/AcOEt/MeOH/H2O (15/40/22/10). sâm Ngoc Linh là 0,7744%. Như vậy, - Sấy khô bản mỏng đã triển khai hàm lượng 3 ginsenoside của sâm Ngọc xong trên thiết bị sấy chuyên dụng. Linh tự nhiên gấp 3,4 lần so với sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh. - Phun thuốc thử hiện màu là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol. KẾT LUẬN - Ghi phổ trên máy HPTLC. Tính diện Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi rút tích pic. Từ diện tích pic thu được và ra một số kết luận sau: phương trình hồi quy tuyến tính, tính - Hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1, hàm lượng các ginsenoside Rb1, Re và Rg1. Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh tự nhiên Bảng 1: Hàm lượng các ginsenoside lần lượt là: 1,0916%, 0,1226% và 1,4215%. trong mẫu sâm Ngọc Linh tự nhiên (n = 5). - Hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg trong sinh khối tế bào sâm Ngọc CÁC HÀM LƯỢNG 1 STT GINSENOSIDE (%) Linh lần lượt là: 0,3281, 0,0817% và 0,3646%. 1 Ginsenoside Rb1 1,0916 ± 0,069 - Tổng hàm lượng của 3 ginsenoside 2 Ginsenoside Rg1 1,4215 ± 0,075 Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh tự 3 Ginsenoside Re 0,1226 ± 0,007 nhiên gấp 3,4 lần tổng hàm lượng của 3 ginsenoside này trong sinh khối tế bào Tổng 2,6357 ± 0,2975 sâm Ngọc Linh. 30
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 TÀI LIỆU THAM KHẢO 3. Trần Quang Trung, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Văn Bạch. Nghiên cứu định lượng 1. Trần Tử An (Bộ môn Hoá phân tích và ginsenoside Rb , Re, Rg bằng phương độc chất, Trường đại học Dược Hà Nội). 1 1 pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao. Tạp chí Phương pháp chiết ứng dụng trong kiểm Y - Dược học Quân sự. 2013, tập 38, số 1, nghiệm thuốc và độc chất. 2002, tr.33-39 và tr.13-18. tr.76-83. 2. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, 4. Pharmacopoeia of the Peoples’s Nguyễn Thị Thu Hương. Sâm Việt Nam và Republic of China. English Edition, Vol. I. một số cây thuốc họ Nhân sâm. Nhà xuất bản Chemical Industry Press, 2005, pp.205-207, Khoa học và Kỹ thuật. 2007, tr.69-267. pp.223-225. Appendix VI, A, pp.38-40. 31
8. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 32