Xác định đột biến tại vùng trọng điểm trên gen CYP1B1 ở bệnh nhân glocom bẩm sinh nguyên phát

Nội dung text: Xác định đột biến tại vùng trọng điểm trên gen CYP1B1 ở bệnh nhân glocom bẩm sinh nguyên phát

1. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG TRỌNG ĐIỂM TRÊN GEN CYP1B1 Ở BỆNH NHÂN GLOCOM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT Trần Thu Hà1, Trần Huy Thịnh1,Vũ Thị Bích Thủy2, Trần Vân Khánh1 1Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Mắt Trung ương Glocom bẩm sinh nguyên phát là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường gây nên do đột biến gen CYP1B1, là gen đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năng của vùng bè nhãn cầu. Bệnh nhân mang đột biến gen CYP1B1 90% sẽ biểu hiện bệnh ở cả hai mắt và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa ở trẻ nhỏ. Việc phát hiện đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glocom bẩm sinh nguyên phát là tiền đề quan trọng giúp phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ mù lòa ở trẻ. Đột biến trên gen CYP1B1 thường là đột biến điểm và gặp nhiều ở exon 2 và exon 3. Nghiên cứu được thực hiện nhằm bước đầu xác định đột biến trên exon 2 và exon 3 của gen CYP1B1 ở bệnh nhân glocom bẩm sinh nguyên phát. 12 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh glocom bẩm sinh nguyên phát được lựa chọn vào nghiên cứu. Kỹ thuật giải trình tự gen được áp dụng để xác định đột biến trên exon 2 và exon 3 của gen CYP1B1. Kết quả cho thấy đã phát hiện được 4/12 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys trên exon 2, trong đó 1 bệnh nhân có đột biến Gln86Lys đơn thuần và 3 bệnh nhân có đột biến Gln86Lys kết hợp với một số đa hình thái gen-SNP (Arg48Gly,Ala119Ser trên exon 2 và Leu432Val, Asn453Ser trên exon 3). Đột biến Gln86Lys trên exon 2 là đột biến mới chưa được công bố, trong khi đó các SNP đã được công bố. Từ khóa: bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát, gen CYP1B1, đột biến gen I. ĐẶT VẤN ĐỀ người mang đột biến gen CYP1B1 sẽ biểu Glocom bẩm sinh nguyên phát là tình trạng hiện bệnh ở cả hai mắt với các mức độ khác tăng nhãn áp do sự phát triển bất thường của nhau [4]. Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu là đột bán phần trước nhãn cầu. Bệnh thường xảy biến điểm nằm rải rác trên toàn bộ chiều dài ra ở hai mắt (65 - 80%), xuất hiện sớm ngay gen; tỉ lệ phát hiện đột biến CYP1B1 cũng từ những năm đầu sau sinh và là một trong mang tính đặc trưng cho từng chủng tộc, ở những nguyên nhân nguy hiểm gây mù lòa ở Châu Á khoảng 30% [5 - 8]. trẻ nhỏ [1; 2]. Ở Việt Nam, hàng năm có một số lượng lớn Từ những năm 1970, glocom bẩm sinh trẻ sinh ra bị bệnh glocom bẩm sinh nguyên nguyên phát đã được xác định là một thể phát nhưng bệnh thường phát hiện muộn, các bệnh glocom di truyền lặn liên kết nhiễm sắc phương pháp chỉ định không đúng, trẻ không thể thường, phổ biến ở trẻ em [3]. Năm 2012, được theo dõi hay tư vấn di truyền không hiệu một nghiên cứu đã chỉ ra rằng 90% những quả [9]. Việc phát hiện đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glocom bẩm sinh nguyên phát Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Gen - Protein, sẽ làm cơ sở cho việc triển khai chẩn đoán Trường Đại học Y Hà Nội trước sinh cũng như liệu pháp điều trị gen, Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 21/12/2016 đồng thời giúp quản lý tốt những người mang Ngày được chấp thuận: 26/2/2017 gen gây bệnh nhằm giảm tỷ lệ mù lòa ở trẻ. TCNCYH 106 (1) - 2017 79
2. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Theo tổng kết năm 2010, trong 52 nghiên 2. Phương pháp cứu trên thế giới có tới 99,8% đột biến phát Lấy mẫu bệnh phẩm: 2 ml máu tĩnh mạch hiện được ở exon 2 và exon 3 gen CYP1B1 chống đông bằng EDTA [10]. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi Tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNA tổng tiến hành giải trình tự gen CYP1B1 tại exon 2 số được tách chiết từ máu toàn phần bằng và exon 3 nhằm: bước đầu xác định đột biến phenol - chloroform - isopropanol (25:24:1). gen CYP1B1 tại exon 2 và exon 3 gen CYP1B1 trên bệnh nhân glocom bẩm sinh Kỹ thuật PCR: PCR được sử dụng để nguyên phát. khuếch đại exon 2 và exon 3 của gen CYP1B1 với 3 cặp mồi được thiết kế [12]. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20μl) 1. Đối tượng gồm: 1X đệm PCR; 2,5mM dNTP, 0,2μM mồi xuôi và ngược, 0,5U Taq polymerase, 20 - Tiêu chuẩn lựa chọn: 12 bệnh nhân được 50ng DNA. chẩn đoán mắc bệnh glocom bẩm sinh o nguyên phát tại Bệnh viện Mắt Trung ương khi Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94 C/5 o o bệnh nhân dưới 1 tuổi. phút, 35 chu kỳ [94 C/40 giây, 54 C/30 giây, 72oC/45 giây], 72oC/7 phút. Bảo quản mẫu ở Bệnh nhân chẩn đoán xác định bệnh 15oC. glocom bẩm sinh nguyên phát khi có từ 4 triệu chứng trở lên [11]: Kỹ thuật giải trình tự gen - Nhãn áp cao ≥ 25 mmHg (Nhãn áp kế Các sản phẩm PCR sẽ được tiến hành giải Maclakov) hoặc ≥ 22 mmHg (Nhãn áp kế trình tự trực tiếp trên máy ABI 3100 Genetic Icare). Analyzer. Kết quả được thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI PRISM TM 3100 – Avant - Chói, chảy nước mắt, sợ ánh sáng. Data Collection, DNA Sequencing Analysis 5.2 - Đường kính giác mạc to bất thường ≥ và BLAST NCBI. Trình tự được so sánh trên 12 mm. ngân hàng gen: DNA (NG- 008806) và mRNA - Giác mạc phù, mờ đục (NM- 000053). - Tiền phòng sâu, góc tiền phòng có tổ 3. Đạo đức nghiên cứu chức bất thường. Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ quy định của - Tổn hại lõm teo gai thị trong bệnh đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học. Bệnh glocom. nhân và gia đình bệnh nhân hoàn toàn tự Tiêu chuẩn loại trừ: Glocom bẩm sinh thứ nguyện tham gia vào nghiên cứu và có quyền phát, tổn thương của giác mạc, hội chứng rút lui khỏi nghiên cứu bất kỳ thời điểm nào. tách lớp bán phần trước (Axenfeld, Reiger, Bệnh nhân và gia đình được thông báo về kết Peters); Tổn thương của mống mắt: tật không quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác sỹ tư mống mắt, tồn lưu màng Wachendorf; Dị vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị thường thể thủy tinh: hội chứng Lowe, Marfan, phù hợp. Các thông tin cá nhân được đảm Machesani. bảo bí mật. 80 TCNCYH 106 (1) - 2017
3. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC III. KẾT QUẢ không có ý nghĩa thống kê. Tuổi trung bình phát hiện bệnh là 9,6 ± 2,1 tháng tuổi. 100% 1. Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân nghiên bệnh nhân nghiên cứu đều đảm bảo tiêu cứu chuẩn chẩn đoán bệnh glocom bẩm sinh Nghiên cứu tiến hành trên 12 bệnh nhân nguyên phát điển hình, trong đó 4 bệnh trong đó 7 bệnh nhân nam (58,3%) và 5 nhân phát hiện đột biến có các đặc điểm bệnh nhân nữ (41,7%). Sự khác biệt về giới lâm sàng sau: Bảng 1. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân Mã số bệnh nhân Triệu chứng G01.00 G02.00 G03.00 G04.00 Nhãn áp cao + + + + Chói, chảy nước mắt, sợ ánh sáng + + + + Đường kính giác mạc to + + + + Giác mạc phù, mờ đục + + + + Bất thường tiền phòng - - - - Tổn hại lõm teo gai thị trong bệnh glocom - + + + 2. Kết quả xác định khuếch đại exon 2 và exon 3 của gen CYP1B1 Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon 2 và exon 3 gen CYP1B1 để khuyếch đại DNAsau tách chiết từ mẫu máu của bệnh nhân. Hình 1 là hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon 2 của gen CYP1B1. 1 2 3 4 5 6 MK 800bp Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 2, gen CYP1B1 (+) mẫu đối chứng; (1 - 6) mẫu bệnh nhân; (MK) Marker. Kết quả hình 1 cho thấy, sản phẩm PCR thu được chỉ có 1 băng đặc hiệu, rõ nét, kích thước 800 bp, không có sản phẩm phụ. Sản phẩm PCR đảm bảo cho phản ứng giải trình tự tiếp theo để phát hiện đột biến điểm. 3. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 Sản phẩm PCR được giải trình tự gen để phát hiện đột biến. Kết quả cho thấy đã phát hiện được 4/12 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys trên exon 2, trong đó 1 bệnh nhân có đột TCNCYH 106 (1) - 2017 81
4. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC biến Gln86Lys đơn thuần và 3 bệnh nhân có đột biến Gln86Lys kết hợp với một số đa hình thái gen - SNP (Arg48Gly, Ala119Ser trên exon 2 và Leu432Val, Asn453Ser trên exon 3). Bảng 2. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 STT Mã số Exon Đột biến Thể đột biến Chú thích Tài liệu công bố 1 G01.00 2 Gln86Lys Dị hợp New Gln86Lys Dị hợp New 2 G02.00 2 Arg48Gly, Dị hợp SNP Ivaylo Stoilov, (1998) Ala119Ser Dị hợp SNP Ivaylo Stoilov, (1998) 2 Gln86Lys Dị hợp New 3 G03.00 3 Leu432Val Dị hợp SNP Ivaylo Stoilov, (1998) 2 Gln86Lys Dị hợp New 4 G04.00 3 Asn453Ser Dị hợp SNP Ivaylo Stoilov, (1998) New: Đột biến mới; SNP: Single Nucleotide Polymorphism (đa hình đơn nucleotid). Kết quả bảng 1 cho thấy cả 4 bệnh nhân đều có đột biến mới Gln86Lys trên exon 2 kết hợp với một số SNP trên exon 2 hoặc exon 3 đã được công bố. Người bình thường Bệnh nhân mã số G02.00 Hình 2. Hình ảnh giải trình tự gen CYP1B1 của bệnh nhân mã số G02.00 82 TCNCYH 106 (1) - 2017
5. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết quả trên cho thấy, bệnh nhân mã số G02.00 có một đột biến mới phát hiện dạng dị hợp tử Gln86Lys trên exon 2 kết hợp với 2 SNP được công bố trước đây là Arg48Gly và Ala119Ser trên exon 2. IV. BÀN LUẬN Bệnh glocom bẩm sinh nguyên phát là liệu đây là đột biến mới phát hiện hay là đa bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể hình thái gen, nghiên cứu đã tiến hành phân thường, phổ biến ở trẻ em. Khoảng 90% trẻ tích trên 50 mẫu DNA của người bình thường, mang đột biến gen CYP1B1 sẽ biểu hiện bệnh kết quả không phát hiện được người nào có ở cả hai mắt với các mức độ khác nhau dẫn đột biến Gln86Lys trên exon 2. Bên cạnh đó, đến mù lòa nếu không được chẩn đoán và nghiên cứu cũng tìm được 4 dạng đa hình thái điều trị kịp thời. Ở Việt Nam, hàng năm một số đã được bố năm 1998 là Arg48Gly và lượng lớn trẻ sinh ra bị bệnh và thường đến viện Ala119Ser trên exon 2 và Leu432Val, ở giai đoạn muộn với nhiều tổn thương phức tạp Asn453Ser trên exon 3. Những đột biến này và biến chứng nặng nề. Tuy nhiên, hầu hết các đều nằm trong vùng chức năng của protein nghiên cứu mới chỉ đề cập về tỉ lệ mắc bệnh, CYP1B1 [12]. biểu hiện lâm sàng, kết quả điều trị và các Trong số 4 bệnh nhân mang đột biến mới,1 biến chứng của bệnh. Việc phát hiện đột biến bệnh nhân mang đột biến Gln86Lys đơn thuần gen CYP1B1 trên bệnh nhân glocom bẩm sinh và 3 bệnh nhân phối hợp với các dạng đa nguyên phát sẽ làm cơ sở cho việc triển khai hình thái. Tất cả các đột biến này đều ở dạng chẩn đoán trước sinh cũng như liệu pháp điều dị hợp tử, điều này có thể giải thích bệnh nhân trị gen, đồng thời giúp quản lý tốt những mang đột biến dù là dạng dị hợp nhưng ở các người mang gen gây bệnh nhằm giảm tỷ lệ vùng chức năng tổng hợp gen và phối hợp mù lòa ở trẻ. Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu là nhiều đột biến dị hợp có thể tạo ra hiệu ứng đột biến điểm nằm rải rác trên toàn bộ chiều cộng hưởng gây bệnh glocom bẩm sinh dài gen; tỉ lệ phát hiện ở Châu Á khoảng 30%. nguyên phát. Do chưa phân tích hết toàn bộ Theo tổng kết năm 2010, trong 52 nghiên cứu chiều dài gen nên 8/12 bệnh nhân chưa phát được báo cáo đã phát hiện 542 bệnh nhân hiện được đột biến. mang 147 loại đột biến khác nhau trên gen Về tần suất mắc các dạng đột biến khác CYP1B1. Trong số 1007 đột biến phát hiện nhau giữa các quốc gia và chủng tộc trên thế được có 2 đột biến ở vùng không mã hóa giới, các tác giả cũng đưa ra kết luận, đột biến thuộc exon 1; 489 đột biến phát hiện được ở thay thế acid amin (missense) là loại đột biến exon 2 và 516 đột biến phát hiện được ở exon hay gặp nhất. Theo các nghiên cứu tại Úc, tỷ 3 [10]. Vì vậy, nghiên cứu này bước đầu tiến lệ này là khoảng 72,7% tổng số đột biến phát hành giải trình tự ở exon 2 và exon 3, là vùng hiện được. Một nghiên cứu khác ở Hoa Kỳ lại có đột biến thường gặp trên gen CYP1B1. chỉ ra đột biến thay thế acid amin chỉ gặp ở Nghiên cứu đã phát hiện được 4/12 bệnh 33,3% các trường hợp. Theo những nghiên nhân có đột biến Gln86Lys trên exon 2, đây là cứu ở Châu Á, tỷ lệ đột biến loại này cao hơn, đột biến mới chưa được công bố. Để xác định dao động khoảng từ 60% đến 97% trong tổng TCNCYH 106 (1) - 2017 83
6. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC số đột biến gen CYP1B1 cụ thể ở Nhật là 3. Robert N. Weiss, Shaffer., Daniel I. 66,8%; Indonesia là 62,5%; Ả rập là 96,5% và (1970). Congenital and pediatric glaucomas, Iran là 90%. Ngoài ra một số các dạng đột Mosby, St. Louis, 37. biến khác cũng được tìm thấy nhưng tỷ lệ rất 4. A. O. Khan, M. A. Aldahmesh, J. Y. thấp như đột biến xóa đoạn, lặp đoạn, đột Mohamed (2012). CYP1B1 analysis of biến vô nghĩa hay thêm nucleotide [10]. Trong unilateral primary newborn glaucoma in Saudi nghiên cứu này, các đột biến tìm được đều ở children. J AAPOS, 16(6), 571 - 572. dạng thay thế nucleotide dẫn đến sự biến đổi 5. Mei Yang, Xiangming Guo, Xing Liu acid amin. Tuy nhiên, đây mới chỉ là nghiên (2009). Investigation of CYP1B1 mutations in Chinese patients with primary congenital cứu bước đầu, cần có nghiên cứu tiếp theo để glaucoma, Mol Vis, , 432 - 437. đưa ra số liệu cụ thể hơn về vấn đề này. 15 6. Ji Hyun Lee., Chang-Seok Ki., Hee- V. KẾT LUẬN Jung Kim (2011). Analysis of copy number variation using whole genome exon - focused Nghiên cứu đã phát hiện được 4/12 bệnh array CGH in Korean patients with primary nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys trên exon congenital glaucoma. Mol Vis, 17, 3583 - 2, trong đó 1 bệnh nhân có đột biến Gln86Lys 3590. đơn thuần và 3 bệnh nhân có đột biến 7. Mukesh Tanwar, Tanuj Dada, Gln86Lys kết hợp với một số đa hình thái gen Ramanjit Sihota (2009).Mutation spectrum of - SNP (Arg48Gly, Ala119Ser trên exon 2 và CYP1B1 in North Indian congenital glaucoma Leu432Val, Asn453Ser trên exon 3). patients. Mol Vis, 15, 1200 – 1209. Đột biến Gln86Lys trên exon 2 là đột biến 8. Fuse N., Miyazawa A., Takahashi K. mới chưa được công bố. (2010). Mutation spectrum of the CYP1B1 gene for congenital glaucoma in the Japanese Lời cảm ơn population. Jpn J Ophthalmol, 54(1), 1 - 6. 9. Nguyễn Như Quang (1982). Đặc điểm Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ lâm sàng bệnh glôcôm bẩm sinh và phẫu kinh phí của đề tài cấp Sở Khoa học và Công thuật cắt bè củng mạc. Nhãn khoa, 1, 65 - 70. nghệ Hà Nội “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen 10. Ni Li, Yong Zhou, Liang Du (2011). CYP1B1 trong bệnh glocom bẩm sinh nguyên Overview of Cytochrome P450 1B1 gene phát tại Hà Nội” và sự giúp đỡ của các cán bộ mutations in patients with primary congenital Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường glaucoma. Experimental Eye Research, 93, Đại học Y Hà Nội. 572 - 579. 11. T. S. Dietlein, P. C. Jacobi., G. K. TÀI LIỆU THAM KHẢO Krieglstein (1999). Prognosis of primary ab 1. Shields M. B (1982). Primary congenital externo surgery for primary congenital glaucoma, Third edition, Williams and Wilkins, glaucoma. Br J Ophthalmol, 83(3), 317 - 322. USA, 220 - 233. 12. Stoilov I., Akarsu A. N., Alozie I. 2. Thylefors B., Negrel A. D (1994). The (1998). Sequence analysis and homology global impact of glaucoma. Bull WHO, 72, 323 modeling suggest that primary congenital - 326. glaucoma on 2p21 results from mutations 84 TCNCYH 106 (1) - 2017
7. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC disrupting either the hinge region or the conserved core structures of cytochrome P4501B1, Am. J. Hum. Genet, 62, 573 - 584. Summary MUTATION ANALYSIS IN HOTSPOTS REGION OF CYP1B1 GENE IN PATIENTS WITH PRIMARY CONGENITAL GLAUCOMA Primary congenital glaucoma is an autosomal recessive inherited disease caused by muta- tions in the CYP1B1 gene which plays an important role in the modulation of development and functions of the trabecular meshwork. About 90% of patients with CYP1B1 gene mutation will express the disease in both eyes and cause childhood blindness. The mutation detection, carrier detection, and prenatal diagnosis are effective solutions for prevention and reduction of childhood blindness. Point mutation is the most common in the CYP1B1 gene and usually located in exon 2 and exon 3. The purpose of this study was to identify the mutation in exon 2 and exon 3 of CYP1B1 gene features of primary congenital glaucoma. 12 patients with confirmed primary con- genital glaucoma were selected for this study. Direct sequencing was applied to identify mutation in exon 2 and exon 3 of CYP1B1 gene. The results showed that 4/12 patients carrying novel het- erozygous Gln86Lys mutation in exon 2, in which 1 patient carrying single Gln86Lys mutation and 3 patients carrying Gln86Lys mutation combined with others SNPs in exon 2 (Arg48Gly, Ala119Ser) or exon 3 (Leu432Val, Asn453Ser) of CYP1B1 gene. Gln86Lys in exon 2 was a novel mutation, whereas SNPs had been reported in other studies. Keywords: primary congenital glaucoma, CYP1B1 gene, mutation TCNCYH 106 (1) - 2017 85