Xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790m trên gen egfr ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ kháng với thuốc điều trị đích

Nội dung text: Xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790m trên gen egfr ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ kháng với thuốc điều trị đích

1. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC THỨ PHÁT T790M TRÊN GEN EGFR Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ KHÁNG VỚI THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÍCH Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Trần Quốc Đạt Trường Đại học Y Hà Nội Khoảng 50% bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có xuất hiện đột biến kháng thuốc thứ phát T790M sau khoảng 10 - 20 tháng điều trị với thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase (TKI, tyrosine kinase inhibitor) của EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Các bệnh nhân này đã được xác định trước đó là có đột biến đáp ứng với thuốc TKI (xoá đoạn exon 19 hoặc L858R) trên gen EGFR. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790M exon 20 trên gen EGFR ở 11 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ đã được xác định là có dấu hiệu kém đáp ứng với thuốc ức chế EGFR TKI. DNA đã được tách chiết từ mẫu mô sinh thiết lại để xác định đột biến T790M exon 20 tr ên gen EGFR, kỹ thuật giải trình tự gen truyền thống và kỹ thuật Scorpions ARMS (Scorpions - Amplification Refractory Muta- tion System) với độ nhạy cao khoảng 0,01% đã được áp dụng để xác định đột biến.Kết quả cho thấy đã phát hiện được 5/11 (45%) bệnh nhân có đột biến kháng thuốc T790M exon 20 trên gen EGFR, trong đó 2 trường hợp có thể xác định được đột biến bằng cả 2 kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpions ARMS và 3 trường hợp chỉ phát hiện được bằng kỹ thuật Scorpions ARMS. Đây mới chỉ là nghiên cứu bước đầu, chúng tôi cần có một nghiên cứu với cỡ mẫu nghiên cứu lớn hơn để đưa ra một kết quả toàn diện hơn. Từ khóa: Ung thư phổi không tế bào nhỏ, Kháng TKI, Đột biến T790M I. ĐẶT VẤN ĐỀ biến gen EGFR làm tăng tính nhạy cảm với Hiện nay, trên toàn thế giới và tại Việt EGFR TKI có tỷ lệ đáp ứng với thuốc EGFR Nam, ung thư phổi là loại ung thư phổ biến TKI rất cao, trên 60%, và kéo dài được thời nhất và có tỷ lệ tử vong cao nhất [1], với 80 - gian sống bệnh không tiến triển (PFS) trung 90% là thể không tế bào nhỏ, còn lại là thể tế bình trên 9 tháng [4]. Tuy nhiên, dưới áp lực bào nhỏ.Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô chọn lọc của các tế bào khối u với thuốc, sau EGFR (epidermal growth factor receptor) đã khoảng 10 - 20 tháng điều trị, bệnh tiến triển trở thành đích nhắm cho liệu pháp điều trị mới trở lại ở hầu hết các bệnh nhân có đáp ứng tốt đối với nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào ban đầu, thể hiện tình trạng “trơ” của tế bào nhỏ [2]. Ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột khối u với thuốc [5]. Y học đã ghi nhận một số biến gen EGFR đáp ứng tốt với thuốc ức chế cơ chế gây nên tình trạng kháng thuốc EGFR tyrosine kinase của EGFR (EGFR TKI), là cơ TKI; trong đó có sự xuất hiện một số đột biến sở cho liệu pháp điều trị trúng đích [3]. Nhiều mới tại chính phân tử EGFR (đột biến T790M nghiên cứu cho thấy bệnh nhân ung thư phổi tại exon 20, đột biến L747S hoặc D761Y tại không tế bào nhỏ giai đoạn muộn mang đột exon 19, đột biến T854A tại exon 21 ), sự khuếch đại gen cMET (gen mã hóa thụ thế Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường yếu tố phát triển tế bào gan), sự chuyển dạng Đại học Y Hà Nội biểu mô - trung mô hoặc sự chuyển từ dạng Email: huytihinhda@yahoo.com Ngày nhận: 10/10/2015 không tế bào nhỏ sang dạng tế bào nhỏ. Đột Ngày được chấp thuận: 26/02/2016 biến thứ phát T790M trên exon 20 gen EGFR 40 TCNCYH 99 (1) - 2016
2. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC là nguyên nhân phổ biến nhất, chiếm khoảng theo tiêu chuẩn RECIST v1.1 và được đánh 50% các trường hợp [6; 7]. Chẩn đoán phân giá tình trạng kháng thứ phát thuốc EGFR TKI tử thông qua tái sinh thiết khối u để xác định theo tiêu chuẩn của Jackman và cộng sự [9] cơ chế kháng thuốc từ đó lựa chọn hướng Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên điều trị mới cho bệnh nhân đóng vai trò quan cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội trọng. Có nhiều kỹ thuật phát hiện đột biến 2. Phương pháp kháng thuốc T790M exon 20 trên gen EGFR - Kỹ thuật tách chiết DNA: mẫu mô được và độ nhạy của mỗi kỹ thuật phụ thuộc vào lựa chọn chính xác vùng tế bào ung thư. mật độ tế bào ung thư trong mẫu mô. Hai kỹ Parafin được loại bỏ bằng xylen. DNA được thuật đang được sử dụng phổ biến là giải trình tách chiết theo qui trình phenol/chloroform tự gen và Scorpion ARMS. Kỹ thuật giải trình (protein được phân huỷ bằng Proteinase K với tự gen có giá thành cạnh tranh hơn nhưng nồng độ 1 mg/mL). Nồng độ và độ tinh sạch không phát hiện được đột biến gen nếu mẫu của DNA được xác định bằng máy Nano - mô có ít tế bào đột biến. Kỹ thuật Scorpions Drop, những mẫu DNA đạt giá trị OD 280/ ARMS có độ nhạy cao hơn có thể phát hiện OD260 ≥ 1,8 được sử dụng để phân tích. đột biến gen EGFR khi alen đột biến chiếm tỷ lệ nhỏ, nhưng giá thành rất cao [8]. Đề tài - Kỹ thuật giải trình tự gen: sau khi khuyếch đại exon 19, và exon 21 của gen được thực hiện với mục tiêu: Xác định đột biến T790M trên gen EGFR ở bệnh nhân ung EGFR bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR thư phổi không tế bào nhỏ bằng kỹ thuật giải được tinh sạch từ gel agarose, sử dụng trình tự gen và Scorpions ARMS. Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA) và sau đó được đưa vào giải II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP trình tự bằng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, 1. Đối tượng USA). Trình tự gen được đối chiếu và so sánh Mẫu mô sinh thiết lại hoặc khối tế bào của với trình tự Genebank của gen EGFR. 11 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ - Kỹ thuật Scorpions ARMS: là sự kết được thu thập tại Bệnh viện K Trung ương, hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột Bệnh viện Hữu Nghị và Bệnh viện Bạch Mai. biến (ARMS) và công nghệ Scorpions trong Các bệnh nhân này được chẩn đoán xác định phản ứng real - time PCR để phát hiện các đột ung thư phổi biểu mô tuyến giai đoạn từ IIIB - biến gen EGFR và đột biến kháng thuốc IV dựa vào đặc điểm lâm sàng và kết quả mô T790M ở exon 21. Quy trình kỹ thuật theo Kit bệnh học. Bệnh nhân đã được xét nghiệm gen của hãng QIAGEN [10]. EGFR ở mẫu mô sinh thiết lần 1 trước khi điều trị đích và đã được xác định có đột biến 3. Đạo đức trong nghiên cứu đáp ứng với với thuốc ức chế EGFRTKI (6 Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức bệnh nhân có đột biến mất đoạn điển hình nghiên cứu trong Y học. Bệnh nhân hoàn toàn LREA tại exon 19 và 5 bệnh nhân có đột biến tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh L858R tại exon 21), ngoài ra không phát hiện nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi thêm bất cứ đột biến nào khác trên gen không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên EGFR. Bệnh nhân được sử dụng thuốc ức cứu. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo chế EGFRTKI, được theo dõi đáp ứng thuốc bí mật. TCNCYH 99 (1) - 2016 41
3. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC III. KẾT QUẢ biến kháng thuốc T790M exon 20, trong đó 2 Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen và Scor- trường hợp xác định được đột biến bằng cả 2 pion ARMS để phát hiện đột biến gen EGFR kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpions ARMS cho đối tượng nghiên cứu. Kết quả cho thấy đã và 3 trường hợp chỉ phát hiện được đột biến phát hiện được 5/11 (45%) bệnh nhân có đột bằng kỹ thuật Scorpions ARMS (bảng 1). Bảng 1. Kết quả phát hiện đột biến gen EGFR trước và sau điều trị EGFR TKI Chẩn đoán Đột biến gen trước điều Đột biến gen sau điều trị EGFR TKI MS lâm sàng trị EGFR TKI Giải trình tự gen Scorpions ARMS 1 K phổi LREA LREA LREA, T790M 2 K phổi LREA LREA LREA 3 K phế quản L858R L858R L858R 4 K phổi LREA LREA LREA, T790M 5 K phổi L858R L858R, T790M L858R, T790M 6 K phế quản LREA LREA LREA 7 K phế quản L858R L858R L858R, T790M 8 K phổi L858R L858R L858R 9 K phổi LREA LREA, T790M LREA, T790M 10 K phế quản LREA LREA LREA 11 K phổi L858R L858R L858R Tại thời điểm trước điều trị EGFR TKI, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS, bệnh nhân có đột biến L858R exon 21, không có đột biến gen EGFR nào khác, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân chỉ có đột biến L858Rexon 21 làm tăng tính nhạy cảm với thuốc EGFR TKI. Tại thời điểm bệnh tiến triển, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS, ngoài đột biến L858R exon 21 đã phát hiện trước khi điều trị, xuất hiện thêm đột biến T790M exon 20, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân đã xuất hiện thêm đột biến thứ phát T790M gây kháng thuốc EGFR TKI (hình 1). 42 TCNCYH 99 (1) - 2016
4. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết quả giải trình tự gen Kết quả Scorpion ARMS Hình 1. Kết quả xác định đột biến gen EGFR của bệnh nhân MS5 trước điều trị (A) và sau khi điều trị (B) Tại thời điểm trước điều trị EGFR TKI, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn LREA exon 19, không có đột biến gen EGFR nào khác, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân chỉ có đột biến LREA exon 19 làm tăng tính nhạy cảm với thuốc EGFR TKI. Tại thời điểm bệnh tiến triển, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen thấy có tín hiệu nghi ngờ của đột biến T790M exon 20. Khi kiểm tra lại bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, ngoài đột biến LREA exon 19 đã phát hiện trước khi điều trị, xuất hiện thêm đột biến T790M exon 20, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân đã xuất hiện thêm đột biến thứ phát T790M exon 20 gây kháng thuốc EGFR TKI (hình 2). TCNCYH 99 (1) - 2016 43
5. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết quả giải trình tự gen Kết quả Scorpion ARMS Hình 2. Kết quả xác định đột biến gen EGFR của bệnh nhân MS9 trước điều trị (A) và sau khi điều trị (B) IV. BÀN LUẬN Cơ chế kháng thuốc điều trị đích đầu tiên ở tốt với thuốc điều trị đích [10; 11]. Sự biến đổi bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ cấu trúc tại vùng giữ chức năng tyrosine được chứng minh là sự xuất hiện đột biến kinase (exon 1821) của protein EGFR gây điểm T790M tại exon 20 gen EGFR. Phát hiện giảm ái lực của protein EGFR với ATP tại khe này được công bố bởi hai nhóm nghiên cứu gắn ATP. Do đó, phân tử thuốc EGFR TKI độc lập của Kobayashi và Pao năm 2005 sau không phải cạnh tranh với ATP và EGFR trở khi tiến hành phân tích những bệnh nhân nên nhạy cảm hơn với thuốc [12]. Theo thời mang đột biến LREA, L858R xuất hiện tính gian tiếp xúc liên tục với thuốc điều trị đích kháng sau khoảng thời gian ban đầu đáp ứng EGFR TKI, gen EGFR của tế bào ung thư đã 44 TCNCYH 99 (1) - 2016
6. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC xuất hiện một đột biến mới là đột biến điểm thư phổi không tế bào nhỏ sau khi sử dụng T790M ở exon 20, sự biến đổi cấu trúc protein thuốc ức chế TKI EGFR và được đánh giá EGFR tại vị trí đột biến T790M không tạo ra tình trạng kháng thứ phát thuốc EGFR TKI theo sự phong tỏa về vị trí không gian đối với thuốc tiêu chuẩn của Jackman và cộng sự [9]. TKI mà nó làm hồi sinh ái lực của EGFR với Nghiên cứu có sử dụng cả 2 kỹ thuật giải trình ATP, đối kháng lại cơ chế ức chế kinase theo tự gen và Scorpion ARMS (kỹ thuật có độ kiểu cạnh tranh ATP của TKI [13]. Theo đó, nhạy cao 0,01%) nhưng tỷ lệ phát hiện đột các TKI ức chế thuận nghịch như erlotinib biến T790M thấp hơn so với một số nghiên hoặc gefitinib có hiệu quả rất giới hạn với thể cứu trước đây có thể do cỡ mẫu hạn chế [10; đột biến T790M, trong khi các TKI không 17]. Đặc biệt, có 3 bệnh nhân không phát hiện thuận nghịch như afatinib có thể vượt qua được đột biến kháng thuốc T790M exon 20 hiện tượng này nhờ hình thành các nối cộng (hoặc có tín hiệu nghi ngờ) bằng kỹ thuật giải hóa trị với vùng gắn ATP, do đó giúp kéo dài trình tự gen mà chỉ phát hiện được bằng kỹ hiệu quả ức chế hoạt tính tyrosine kinase [14]. thuật Scorpion ARMS, điều này có thể lý giải Thử nghiệm in vitro cho thấy nồng độ Gefitinib do lượng tế bào ung thư phổi mang đột biến hoặc Erlotinib tối thiểu để ức chế protein T790M exon 20 thu thập được từ mẫu mô EGFR - T790M cao gấp 300 lần nồng độ để nghiên cứu hạn chế. Chúng tôi cần có một cần thiết để ức chế protein EGFR-LREA, nghiên cứu tiếp theo với cỡ mẫu lớn hơn để L858R [15; 16]. Hệ quả là dòng tế bào ung đưa ra một kết quả nghiên cứu toàn diện hơn. thư phổi mang đột biến T790M exon 20 (dòng V. KẾT LUẬN H1975) có khả năng chịu Gefitinib, Erlotinib tốt hơn nhiều so với dòng mang đột biến LREA Sử dụng cả 2 kỹ thuật giải trình tự gen và (dòng H3255) và L858R (dòng HCC827). Hiện Scorpions ARMS đã phát hiện được 5/11 nay có 2 cơ chế được các nhà khoa học đề (45%) bệnh nhân ung thư phổi không tế bào xuất nhằm giải thích mối liên quan giữa đột nhỏ có đột biến kháng thuốc thứ phát T790M biến T790M và tính kháng của tế bào ung thư exon 20 trên gen EGFR. phổi: i) Ở mức độ cấu trúc, sự thay đổi Lời cảm ơn Threonin thành Methionin gây biến đổi vị trí tương tác của vùng kinase, ức chế hoàn toàn Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Bệnh sự bám của Erlotinib và Gefitinib. ii) Ở góc độ viện K Trung ương, Bệnh viện Hữu Nghị và tương tác giữa các phân tử sinh học, đột biến Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh T790M khôi phục lại ái lực của vùng kinase viện Bạch Mai đã giúp đỡ trong quá trình thực với ATP trong khi giảm ái lực với Erlotinib và hiện nghiên cứu. Đề tài được thực hiện với sự Gefitinib [10, 13]. Tiến hành phân tích trên số hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp nhà nước lượng lớn bệnh nhân ung thư phổi không tế “Nghiên cứu những biến đổi trong bộ gen tế bào nhỏ, các nhà khoa học phát hiện thấy đột bào ung thư phổi và lơ-xê-mi kinh dòng hạt biến T790M chiếm 50% trường hợp kháng kháng thuốc điều trị đích” thuộc chương trình thuốc sau điều trị Gefitinib hoặc Erlotinib, các KC.04.16/11-15. dạng đột biến còn lại chiếm dưới 5% [10, 17]. TÀI LIỆU THAM KHẢO Trong nghiên cứu này, đột biến T790M đã được phát hiện ở 5/11 (45%) bệnh nhân ung 1. Jemal A, Bray F, Ward E et al (2011). TCNCYH 99 (1) - 2016 45
7. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 61 10. Kobayashi S, Boggon TJ, Dayaram T (2), 69 - 90. (2005). EGFR mutation and resistance of non 2. Chu Hồng Thắng, Lê Trần Ngoan, Lê small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Hoài Chương, Vũ Thị Nguyệt Ánh (2013). Med, 352, 786 – 792. Tình hình tử vong do ung thư tại Hà Nội và 11. Pao W., Millere VA., Politi KA. Acqui- Thái Nguyên, 2005 - 2008. Tạp chí Thông Tin red resistance of lung adenocarcinomas to Y Dược, 4, 50 - 54. gefitinib or erlotinib is associated with a se- 3. Pao W, Miller VA (2005). Epidermal cond mutation in the EGFR kinase do- growth factor receptor mutations, small- main. PLoS Med, 2, 73. molecule kinase inhibitors, and non-small-cell 12. Dienstmann R., Martinez P., Felip E. lung cancer: current knowledge and future (2011). Personalizing therapy with targeted directions. J Clin Oncol, 23(11), 2556 - 2568. agents in non-small cell lung cancer. 4. Ohashi K., Maruvka Y., Michor F. and Oncotarget, 2(3), 165 - 177. Pao W (2013). Epidermal Growth Factor Re- ceptor Tyrosine Kinase Inhibitor– Resistant 13. Yun C.H., Mengwasser K.E., Toms Disease. J Clin Oncol, 31, 1 - 12. A.V et al (2008). The T790Mmutation in 5. Nurwidya F., Takahashi F., Murakami EGFR kinase causes drug resistance by in- A., et al (2014).Acquired resistance of non- creasingthe affinity for ATP. Proceedings of small cell lung cancer to epidermal growth the National Academy of Sciences of the factor receptor tyrosine kinase inhibitors. United States of America, 105(6), 2070–2075. Respiratory Investigation, 52(2), 81 - 91. 14. Li D., Ambrogio L., Shimamura T., 6. Engelman J.A., Zejnullahu K., Mitsu- (2008). BIBW2992, anirreversible EGFR/ domi T et al (2007). MET amplification leads HER2 inhibitor highly effective in preclinical to gefitinib resistance in lung cancer by acti- lung cancer models. Oncogene, 27(34), 4702 - vating ERBB3 signaling. Science, 316, 1039 - 4711. 1043. 15. Kosaka T, Yatabe Y, Endoh H (2006). 7. Sequist L.V., Waltman B.A., Dias- Analysis of epidermal growth factor receptor Santagata D et al (2011). Genotypic and gene mutation inpatients with non-small cell histological evolution of lung cancers acquiring lung cancer and acquired resistance to gefiti- resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med, nib. Clin Cancer Res, 12, 5764 – 5769. 375, 26. 16. Avizienyte E, Ward RA, Garner AP 8. Pao W. and Ladanyi M (2007). Epider- (2008). Comparison of the EGFR resistance mal Growth Factor Receptor Mutation Testing mutation profiles generated by EGFR targeted in Lung Cancer: Searching for the Ideal tyrosine kinase inhibitors and the impact of Method.Clin Cancer Res,13, 4954 - 4955. drug combinations. Biochem J, 415,197 - 206. 9. Jackman D., Pao W., Riely G.J (2010). Clinical definition of acquired resistance to 17. Oxnard GR, Miller VA, Robson ME epidermal growth factor receptor tyrosine (2012). Screening for germline EGFR T790M kinase inhibitors in non-small-cell lung cancer. mutations through lung cancer genotyping. J J Clin Oncol, 28(2), 357 - 360. Thorac Oncol, l7, 1049 - 1052. 46 TCNCYH 99 (1) - 2016
8. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary IDENTIFICATION OF A SECONDARY EGFR T790M MUTATION BY REBIOPSY OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS WITH ACQUIRED RESISTANCE TO TYROSINE KINASE INHIBITOR Approximately 50% of non-small cell lung cancer patients with epidermal growth factor receptor (EGFR) - mutations (deletion in exon 19 or L858R) who develop acquired resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) reportedly carry a secondary EGFR T790M mutation. This phenomenon prevails after 10 - 20 months of treatment in most of patients. This study investi- gated 11 EGFR-mutant patients who had undergone rebiopsy after TKI failure. DNA was extracted from tumor tissues and examined for the presence of T790M, using a standard sequencing based method followed by Scorpions ARMS (Scorpions - Amplification Refractory Mutation System) method with an analytical sensitivity of approximately 0.01%. Analysis of 11 patients detected 5 mutants (45%), including 2 mutants can detect by both sequencing and Scor- pions ARMS method and 3 mutants only can detect by Scorpions ARMS method due to limited cancer tissues after rebiopsy. We need to study more with larger number of patients to confirm this result. Keywords: Non-small cell lung cancer, TKI acquired resistance, Secondary T790M mutation TCNCYH 99 (1) - 2016 47