Xác định đột biến gen kras trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại bệnh viện Bạch Mai bằng kỹ thuật stripassay

Nội dung text: Xác định đột biến gen kras trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại bệnh viện Bạch Mai bằng kỹ thuật stripassay

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 XÁC ĐỊNH ĐỘT BI ẾN GEN KRAS TRÊN B ỆNH NHÂN UNG TH Ư ĐẠI TR ỰC TRÀNG T ẠI B ỆNH VI ỆN B ẠCH MAI BẰNG K Ỹ THU ẬT STRIPASSAY Mai Tr ọng Khoa*; Ph ạm C ẩm Ph ươ ng*; Nguy ễn Ti ến Lung* TÓM T ẮT Mục tiêu: xác định tình tr ạng đột bi ến gen KRAS trên b ệnh nhân (BN) ung th ư đại tr ực tràng (UT ĐTT) t ại Trung tâm Y h ọc H ạt nhân và Ung b ướu, B ệnh vi ện B ạch Mai. Ph ươ ng pháp: 92 mẫu b ệnh ph ẩm (m ẫu mô sau ph ẫu thu ật ho ặc sinh thi ết), ch ẩn đoán xác định b ằng gi ải ph ẫu bệnh là UT ĐTT được xác định đột bi ến gen KRAS bằng kít KRAS 12/13/61 StripAssay® (ViennaLab). Kết qu ả: tỷ lệ đột bi ến gen KRAS là 37,0% (34/92 b ệnh ph ẩm), t ập trung ch ủ yếu ở codon 12 (chi ếm 65,7% t ổng s ố đột bi ến). Kết lu ận: kết qu ả phân tích đột bi ến gen KRAS trên BN UT ĐTT tại B ệnh vi ện B ạch Mai t ươ ng t ự nhi ều nghiên c ứu khác t ại Vi ệt Nam và trên th ế gi ới. * T ừ khóa: Ung th ư đại tr ực tràng; Đột bi ến gen KRAS; KRAS 12/13/61 StripAssay®. The Results of KRAS Mutation Testing in Colorectal Cancer at Bachmai Hospital Summary Objectives: To determine the KRAS mutation status in colorectal cancer at Nuclear Medicine and Oncology Center, Bachmai Hospital Hospital. Methods: 92 formalin-fixed, paraffin- embedded specimens (needle biopsy and surgical specimens) of colorectal cancer patients were tested for KRAS mutations using KRAS 12/13/61 StripAssay® (ViennaLab). Results: 34 of 92 specimens had KRAS mutations (37.0%), mutations in codon 12 were most common (65.7%). Conclusion: The results of KRAS mutations determination in colorectal cancer in Bachmai Hospital were similar to other studies in Vietnam and over the world. * Key words: Colorectal cancer; KRAS mutation; KRAS 12/13/61 StripAssay®. ĐẶT V ẤN ĐỀ yếu t ố tăng tr ưởng bi ểu bì (epidermal Ung th ư đại tr ực tràng là m ột trong growth factor receptor - EGFR). Các nghiên nh ững lo ại ung th ư có t ỷ lệ mắc và t ử cứu đã ch ứng minh kháng th ể đơ n dòng vong cao nh ất. T ại Vi ệt Nam, t ỷ lệ mắc kháng EGFR (cetuximab, panitumumab ) chu ẩn theo tu ổi là 10,1/100.000 dân, có hi ệu qu ả hơn ở BN UT ĐTT không có đứng th ứ sáu trong các b ệnh ung th ư đột bi ến KRAS so v ới BN mang đột bi ến (theo GLOBOCAN 2012). Các ph ươ ng KRAS . Vì v ậy, xét nghi ệm đột bi ến gen pháp điều tr ị UT ĐTT bao g ồm ph ẫu thu ật, KRAS có vai trò quan tr ọng trong ch ỉ định xạ tr ị, hóa tr ị và điều tr ị đích, trong đó có kháng th ể đơ n dòng nh ư cetuximab, các kháng th ể đơ n dòng kháng th ụ th ể panitumumab cho BN UT ĐTT [1, 3]. * B ệnh vi ện B ạch Mai Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Ph ạm C ẩm Ph ươ ng (camphuongmd@yahoo.com) Ngày nh ận bài: 04/07/2016; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 08/09/2016 Ngày bài báo được đă ng: 19/09/2016 80
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Hi ện nay có nhi ều ph ươ ng pháp phát bi ến gen KRAS tại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu, hi ện đột bi ến gen KRAS được s ử dụng Trung tâm Y h ọc H ạt nhân và Ung b ướu, nh ư gi ải trình t ự gen, real-time PCR, PCR Bệnh vi ện B ạch Mai. đặc hi ệu alen . Các ph ươ ng pháp này 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. khác nhau v ề độ nh ạy, độ đặc hi ệu, s ố Nghiên c ứu mô t ả ti ến c ứu lượng đột bi ến có th ể phát hi ện [3]. T ừ - Thu th ập thông tin v ề đặc điểm lâm tháng 11 - 2014, Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu, sàng, c ận lâm sàng, giai đoạn b ệnh c ủa Trung tâm Y h ọc H ạt nhân và Ung b ướu, BN theo m ột m ẫu thu th ập thông tin th ống Bệnh vi ện B ạch Mai đã áp d ụng xét nh ất. nghi ệm đột bi ến gen KRAS bằng k ỹ thu ật PCR đặc hi ệu alen k ết h ợp lai đầu dò - Quy trình xét nghi ệm: g ồm 4 giai đ ạ phân t ử theo kít KRAS 12/13/61 o n chính StripAssay® (ViennaLab, Áo). B ộ kít này + Tách ADN t ừ mô c ố định formalin - có kh ả năng phát hi ện h ơn 98% các lo ại vùi paraffin. đột bi ến c ủa gen KRAS, bao g ồm 13 đột + Khu ếch đại đoạn gen quan tâm b ằng bi ến ph ổ bi ến trên các codon 12, 13 và 61 ph ản ứng PCR. với độ nh ạy cao (có kh ả năng xét nghi ệm + Lai s ản ph ẩm khu ếch đại v ới đầu dò chính xác khi t ỷ lệ tế bào đột bi ến trong đặc hi ệu phân b ố trên Teststrip. mẫu xét nghi ệm d ưới 1%) [3]. Nghiên cứu + Phân tích k ết qu ả. này th ực hi ện nh ằm: Đánh giá t ỷ lệ đột * X ử lý s ố li ệu: sử dụng ph ần m ềm bi ến gen KRAS trên BN UT ĐTT t ại B ệnh SPSS 16.0. vi ện B ạch Mai, giúp bác s ỹ lâm sàng có th ể đư a ra phác đồ điều tr ị phù h ợp v ới KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU từng tr ường h ợp c ụ th ể. * T ỷ l ệ phát hi ện độ t bi ến gen KRAS: 34/92 BN (37,0%) UT ĐTT phát hi ện có ĐỐI T ƯỢNG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP đột bi ến gen KRAS , không phát hi ện đột NGHIÊN C ỨU bi ến 58 BN (63%). Đặc bi ệt, 1 BN mang 1. Đối t ượng nghiên c ứu. 2 đột bi ến gen KRAS (codon 12 và 92 BN UT ĐTT được ch ẩn đoán và codon 13). điều tr ị tại B ệnh vi ện B ạch Mai t ừ tháng * V ị trí độ t bi ến gen KRAS: 11 - 2014 đến 5 - 2016. Các m ẫu b ệnh Trong t ổng s ố các đột bi ến được phát ph ẩm (m ẫu mô sau ph ẫu thu ật ho ặc sinh hi ện ở 34 BN, đột bi ến trên codon 12 thi ết) được ch ẩn đoán xác định b ằng gi ải chi ếm ưu th ế với 23 BN (65,7%); codon ph ẫu b ệnh t ại Trung tâm Gi ải ph ẫu b ệnh 13: 10 BN (28,6%), ch ỉ có 2 BN (5,7%) và T ế bào h ọc, sau đó xét nghi ệm đột mang đột bi ến trên codon 61. 81
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Hình 1: Phân tích k ết qu ả trên Teststrip. Trên m ỗi Teststrip có s ẵn v ạch control cho ph ản ứng lai, PCR negative control (v ạch 14 - 15) và PCR positive control (v ạch 16) làm đối ch ứng. Các v ạch 1 - 13 t ươ ng ứng v ới 13 đột bi ến phát hi ện được ở codon 12, 13 và 61. (A) Mẫu không phát hi ện đột bi ến. (B) Mẫu mang đột bi ến 12Val (p.G12V, c.35G>T). (C) Mẫu mang đồng th ời 2 đột bi ến: 12Asp (p.G12D, c.35G>A) và 13Asp (p.G13D, c.38G>A). (D) Mẫu mang đột bi ến 61Arg (p.Q61R, c.182A>G). Bảng 1: Tươ ng quan gi ữa t ỷ l ệ độ t bi ến gen KRAS và độ tu ổi. Tu ổi Số lượng m ẫu Số mẫu đột bi ến Tỷ lệ > 50 74 30 40,5% ≤ 50 18 4 22,2% Chung các nhóm 92 34 37,0% Tỷ lệ đột bi ến ở nhóm tu ổi 50 (40,5%), tuy nhiên khác bi ệt này không có ý ngh ĩa th ống kê (p > 0,05). Bảng 2: Tươ ng quan gi ữa t ỷ l ệ độ t bi ến gen KRAS và gi ới tính. Gi ới tính Số lượng m ẫu Số mẫu đột bi ến Tỷ lệ Nam 53 18 34,0% Nữ 39 16 41,0% Chung c ả 2 gi ới 92 34 37,0% Tỷ lệ nữ đột bi ến nhi ều h ơn nam (41,0% so v ới 34,0%), tuy nhiên s ự khác bi ệt này không có ý ngh ĩa th ống kê (p > 0,05). 82
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Bảng 3: Tươ ng quan gi ữa t ỷ l ệ độ t bi ến gen KRAS và v ị trí u. Vị trí Số lượng m ẫu Số mẫu đột bi ến Tỷ lệ Đại tràng 60 23 38,3% Tr ực tràng 32 11 34,4% Chung các nhóm 93 34 37,0% Không có s ự khác bi ệt v ề tỷ lệ đột bi ến gen KRAS ở đại tràng, tr ực tràng và t ỷ lệ đột bi ến chung, 23/60 (38,3%) m ẫu b ệnh ph ẩm đại tràng và 11/32 (34,4%) m ẫu b ệnh ph ẩm tr ực tràng mang đột bi ến gen KRAS (s ự khác bi ệt này không có ý ngh ĩa th ống kê với p > 0,05). Bảng 4: Tươ ng quan giữa t ỷ l ệ độ t bi ến gen KRAS và lo ại b ệnh ph ẩm. Lo ại b ệnh ph ẩm Số lượng m ẫu Số mẫu đột bi ến Tỷ lệ Ph ẫu thu ật 76 29 38,2% Sinh thi ết 16 5 31,3% Chung các nhóm 92 34 37,0% Tỷ lệ phát hi ện đột bi ến KRAS trên b ệnh ph ẩm ph ẫu thu ật (38,2%) cao h ơn so v ới trên b ệnh ph ẩm sinh thi ết (31,3%), tuy nhiên s ự khác bi ệt này không có ý ngh ĩa th ống kê (p > 0,05). BÀN LU ẬN không ph ụ thu ộc tín hi ệu t ừ EGFR, do đó các thu ốc kháng EGFR n ếu được dùng Ở tế bào UT ĐTT, các con đường tín sẽ không có hi ệu qu ả [3]. hi ệu ph ụ thu ộc EGFR th ường được kích ho ạt. Theo con đường này, y ếu t ố tăng Nghiên c ứu trên 92 BN UT ĐTT, chúng tr ưởng bi ểu mô liên k ết v ới EGFR, t ừ đó tôi th ấy t ỷ lệ đột bi ến gen KRAS là 37,0%, ho ạt hóa protein RAS và truy ền tín hi ệu tươ ng t ự với các nghiên c ứu trên th ế gi ới qua nh ững con đường khác nhau: qua và t ại Vi ệt Nam. Theo công b ố năm 2011 RAF, MAPK để ki ểm soát t ăng sinh và của Ciardiello và CS, t ần s ố đột bi ến bi ệt hóa; qua PI3K, AKT, mTOR giúp t ế KRAS ở châu Á, châu Âu, châu M ỹ Latinh bào duy trì kh ả năng s ống sót, không đi tươ ng ứng là 24%, 36% và 40% [6]. Các vào ch ết theo ch ươ ng trình Vì v ậy, m ột nghiên c ứu khác th ống kê t ỷ lệ này nhìn trong nh ững h ướng điều tr ị UT ĐTT hi ệu chung kho ảng 30 - 45% (trong đó c ơ s ở qu ả là ng ăn ch ặn s ự kết h ợp gi ữa y ếu t ố dữ li ệu COSMIC ghi nh ận t ỷ lệ 37%) [1, 2, tăng tr ưởng và th ụ th ể của nó, đó chính là 3, 6]. cơ ch ế ho ạt động c ủa các kháng th ể đơ n Tỷ lệ các lo ại đột bi ến c ũng có s ự dòng nh ư cetuximab, panitumumab . chênh l ệch khá l ớn. Theo k ết qu ả xét Tuy nhiên, n ếu gen KRAS bị đột bi ến, nghi ệm t ại Bệnh vi ện B ạch Mai, đột bi ến protein KRAS có kh ả năng t ự ho ạt hóa, tại codon 12 chi ếm ưu th ế (65,7%), ti ếp kích thích con đường tín hi ệu n ội bào mà theo là t ại codon 13 (28,6%), đột bi ến t ại 83
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 codon 61 khá hi ếm g ặp (ch ỉ 2/92 m ẫu). Về kỹ thu ật phát hi ện, chúng tôi s ử Kết qu ả này có s ự khác bi ệt v ới nghiên dụng kít KRAS 12/13/61 StripAssay® cứu c ủa B ệnh vi ện K, khi đột bi ến t ại (ViennaLab) để phân tích đột bi ến gen codon 13 chi ếm ưu th ế (66,7%), nh ưng KRAS . Đây là kít được thi ết k ế theo tươ ng t ự với h ầu h ết các nghiên c ứu nguyên t ắc PCR đặc hi ệu alen k ết h ợp lai khác trên th ế gi ới (t ỷ lệ đột bi ến t ại codon đầu dò phân t ử: giai đoạn PCR s ử dụng 12 kho ảng 65 - 80%, T ổ ch ức Nghiên c ứu mồi đặc hi ệu (có g ắn biotin) giúp khu ếch Hệ gen Ung th ư M ỹ công b ố tỷ lệ này là đại chính xác v ới các trình t ự gen quan 67,9%) [2, 3, 8]. tâm. Ở giai đoạn lai, nh ững đoạn ADN Th ực t ế hi ện nay có h ơn 5.000 đột được khu ếch đại k ết h ợp chính xác v ới bi ến điểm trên gen KRAS đã được báo đầu dò t ươ ng ứng trên Teststrip, phân t ử cáo, trong đó x ảy ra nh ất là thay th ế biotin trên nh ững đoạn này được ho ạt nucleotid codon 12 và 13 ở exon 2, các hoá b ởi streptavidin thành d ạng phát dạng này chi ếm > 95% t ổng s ố đột bi ến màu. Nh ờ đó, d ễ dàng phát hi ện k ết qu ả và có liên quan đến đáp ứng v ới thu ốc ức bằng cách so màu trên Teststrip, đối ch ế EGFR [3]. Các nghiên c ứu g ần đây chi ếu v ới thang chu ẩn b ằng m ắt th ường đã ch ứng minh vai trò c ủa xét nghi ệm ho ặc ph ần m ềm StripAssay® Evaluator. KRAS trên lâm sàng: nh ững BN có kh ối u Bộ kít có kh ả năng phát hi ện 13 đột bi ến mang đột bi ến gen KRAS có kh ả năng chi ếm t ỷ lệ cao nh ất (phát hi ện > 98% đáp ứng v ới thu ốc kháng EGFR (nh ư tổng t ỷ lệ các lo ại đột bi ến), có kh ả năng cetuximab, panitumumab) kém h ơn BN phát hi ện khi s ố lượng t ế bào mang đột không mang đột bi ến KRAS [2, 3]. Ngoài bi ến < 1%, đồng th ời đã được c ấp ch ứng ra, m ột s ố nghiên c ứu cho th ấy đột bi ến ch ỉ tiêu chu ẩn xét nghi ệm châu Âu áp tại codon 61 (exon 3) và 146 (exon 4) dụng cho ch ẩn đoán b ệnh (European mặc dù chi ếm t ỷ lệ nh ỏ nh ưng c ũng làm Conformity - In Vitro Diagnostics, CE-IVD). tế bào không đáp ứng v ới thu ốc ức ch ế Hi ện nay, có nhi ều ph ươ ng pháp khác EGFR [5]. Vì v ậy, xét nghi ệm đột bi ến gen nhau để xét nghi ệm đột bi ến gen KRAS KRAS th ực s ự cần thi ết để bác s ỹ lâm nh ư gi ải trình t ự gen (gi ải trình t ự Sanger sàng quy ết định l ựa chọn thu ốc cho BN. ho ặc pyrosequencing), real time PCR Về mối t ươ ng quan gi ữa t ỷ lệ đột bi ến (tiêu bi ểu là kít Therascreen - Qiagen), lai gen KRAS và các ch ỉ số sinh h ọc, nhi ều đầu dò (tiêu bi ểu là kít StripAssay - báo cáo đã ch ỉ ra m ối liên h ệ nh ất định ViennaLab) Phươ ng pháp s ử dụng kít gi ữa t ỷ lệ đột bi ến v ới tu ổi (th ường g ặp ở StripAssay tại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu, B ệnh tu ổi trên 50) và gi ới tính ( ở nữ cao h ơn vi ện B ạch Mai có m ột s ố ưu điểm h ơn nam) [8]. Trong nghiên c ứu này, t ỷ lệ đột các ph ươ ng pháp khác: độ đặc hi ệu và bi ến gen KRAS ở BN > 50 tu ổi cao h ơn độ nh ạy cao, th ời gian th ực hi ện xét gần 2 l ần so v ới độ tu ổi < 50, g ặp nhi ều ở nghi ệm ng ắn, không đòi h ỏi các thi ết b ị nữ, t ỷ lệ này không khác bi ệt theo v ị trí u, chuyên d ụng nh ư h ệ th ống gi ải trình t ự không có ý ngh ĩa th ống kê. So v ới các hay real time PCR, đã được c ấp ch ứng báo cáo khác t ại Vi ệt Nam, k ết qu ả này ch ỉ CE-IVD [5, 8]. Hi ện nay, chúng tôi đã khá t ươ ng đồng [7]. chuy ển sang s ử dụng kít KRAS XL 84
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 StripAssay® được c ải ti ến t ừ kít KRAS 4. Sarasqueta AF, Moerland E et al. 12/13/61 StripAssay®, trong đó s ố lượng SNaPshot and StripAssay as valuable đột bi ến được phát hi ện cao h ơn (29 đột alternatives to direct sequencing for KRAS bi ến trên các codon 12, 13, 59, 60, 61, mutation detection in colon cancer routine diagnostics. The Journal of Molecular Diagnostics. 117 và 146 c ủa gen KRAS) để nâng cao 2011, 13 (2), pp.199-205. hơn ch ất l ượng xét nghi ệm. 5. Loupakis F, Ruzzo A et al. KRAS codon KẾT LU ẬN 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon Kết qu ả phân tích đột bi ến gen KRAS 12 and 13 wild-type metastatic colorectal trên 61 BN UT ĐTT t ại B ệnh vi ện B ạch cancer. British Journal of Cancer. 2009, 101, Mai theo kít KRAS 12/13/61 StripAssay® pp.715-721. cho th ấy t ỷ lệ đột bi ến gen KRAS là 6. Parsons BL, Myers MB. Personalized 37,0%, trong đó đột bi ến ở codon 12 cancer treatment and the myth of KRAS wild- chi ếm t ỷ lệ cao nh ất (65,7% t ổng s ố đột type colon tumors. Discovery Medicine. 2013, bi ến), đột bi ến ở codon 61 t ươ ng đối ít 15 (83), pp.259-267. gặp (5,7%). K ết qu ả này b ổ sung thêm d ữ 7. Ciardiello F, Tejpar S, Normanno N, li ệu v ề phân tích tr ạng thái đột bi ến gen Mercadante D, Teague T, Wohlschlegel B, van Cutsem E. Uptake of KRAS mutation KRAS trên BN UT ĐTT t ại Vi ệt Nam. testing in patients with metastatic colorectal cancer in Europe, Latin America and Asia. TÀI LI ỆU THAM KH ẢO Targeted Oncology. 2011, 6, pp.133-145. 1. Nguy ễn Ki ến D ụ, Tr ần Vân Khánh và 8. Rosty C, Young JP et al. Colorectal CS. Phát hi ện độ t bi ến gen KRAS và b ước carcinomas with KRAS mutation are associated đầu đánh giá hi ệu qu ả điều tr ị đích ở BN with distinctive morphological and molecular UT ĐTT. T ạp chí Y h ọc Vi ệt Nam. 2013, 405 features. Modern Pathology. 2013, 26 (6), (2), tr.37-41. pp.825-834. 2. Vươ ng Di ệu Linh, Nguy ễn Ng ọc Quang, 9. Jancik S, Drabek J et al. A comparison Nguy ễn Phi Hùng. Phân tích đột bi ến gen K- of direct sequencing, pyrosequencing, high ras trên BN UT ĐTT bằng k ỹ thu ật gi ải trình t ự resolution melting analysis, TheraScreen DxS, tự độ ng. T ạp chí Ung th ư h ọc. 2014, 4, tr.138-143. and the K-ras StripAssay for detecting KRAS 3. Tan C and Du X. KRAS mutation testing mutations in non small cell lung carcinomas. in metastatic colorectal cancer. World Journal Journal of Experimental & Clinical Cancer of Gastroenterology. 2012, 18 (37), pp.5171-5180. Research. 2012, 31, pp.79-91. 85