Xác định đột biến điểm trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ duchenne bằng kỹ thuật giải trình tự gen

Nội dung text: Xác định đột biến điểm trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ duchenne bằng kỹ thuật giải trình tự gen

1. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN BỆNH NHÂN LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh, Đỗ Ngọc Hải Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X, có đột biến gen dystrophin. Khoảng 70 - 75% bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne do đột biến xoá đoạn hoặc lặp đoạn gen dystrophin và khoảng 20 - 25% bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne do đột biến điểm gen dystrophin. Tuy nhiên, việc phát hiện đột biến điểm còn nhiều khó khăn do cấu trúc gen dystrophin rất dài. Gần đây, ở Việt Nam, các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến xóa đoạn và lặp đoạn gen dystrophin, chưa có nghiên cứu toàn diện nào tiến hành phát hiện đột biến điểm trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne Việt Nam, vì vậy khoảng 1/3 số bệnh nhân bị bỏ sót đột biến. Nghiên cứu này được tiến hành với mục đích xác định đột biến điểm trên gen dystrophin bằng kỹ thuật giải trình tự gen cho 33 bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne đã được xác định không có đột biến xoá đoạn và lặp đoạn gen dystrophin bằng kỹ thuật MLPA. Kết quả cho thấy, 14/33 (42%) bệnh nhân được phát hiện là có đột biến điểm trên gen dystrophin, trong đó, 7 bệnh nhân có đột biến vô nghĩa (nonsense mutation); 4 bệnh nhân có đột biến thêm nucleotid (small insertion) và 3 bệnh nhân có đột biến xoá nucleotid (small deletion), các đột biến này đã gây lệch khung dịch mã gây nên bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Từ khóa: Loạn dưỡng cơ Duchenne, đột biến điểm, giải trình tự gen I. ĐẶT VẤN ĐỀ Gen dystrophin nằm ở vị trí Xp21 trên Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne nhiễm sắc thể X, mã hóa 14 - kb mRNA, bao Muscular Dystrophy – DMD) là một trong gồm 79 exon với 7 promoter khác nhau trong những bệnh lý về cơ do di truyền thường gặp đó hơn 99% chiều dài gen là intron. Gen dys- nhất, với tần suất mắc bệnh khá cao: 1/3500 trophin quy định tổng hợp protein dystrophin, trẻ trai [1]. Bệnh gây ra do đột biến gen dystro- là một protein nằm trên màng tế bào cơ, đóng phin, gen này nằm trên nhánh ngắn của nhiễm vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ trong sắc thể X [2]. Loạn dưỡng cơ Duchenne có quá trình hoạt động. Đột biến gen là nguyên biểu hiện lâm sàng nặng với triệu chứng yếu nhân gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne do cơ mang tính chất tuần tiến, trẻ bị teo cơ, mất sự mất toàn vẹn của protein dystrophin dẫn khả năng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành đến tế bào cơ bị tổn thương trong quá trình do suy tim và rối loạn hô hấp. Trong giai đoạn hoạt động [4; 5]. Có nhiều dạng đột biến trên đầu của bệnh, khi chưa có triệu chứng yếu gen dystrophin, trong đó, khoảng 70 - 75% cơ, bệnh có thể xác định dựa trên sự tăng cao bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne có đột hoạt tính enzym creatine kinase (CK) trong biến xoá đoạn hoặc lặp đoạn gen dystrophin máu [3]. và khoảng 20 - 25% bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne có đột biến điểm [6; 7]. Việc Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu phát hiện đột biến điểm còn gặp nhiều khó Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội khăn do cấu trúc gen dystrophin rất dài [8 - Email: vankhanh73md@yahoo.com Ngày nhận: 16/11/2015 11]. Tại Việt Nam đã có nhiều công trình Ngày được chấp thuận: 26/02/2016 nghiên cứu xác định đột biến gen dystrophin TCNCYH 99 (1) - 2016 1
2. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nhưng hầu hết mới chỉ dừng ở mức xác định tự để xác định đột biến điểm theo quy trình đột biến xóa đoạn, lặp đoạn gen bằng kỹ thuật sau: PCR, RT - PCR, MLPA (multiple ligase- + Khuếch đại exon tương ứng bằng kỹ dependent probe amplification) [12 - 14], kỹ thuật PCR. thuật nhằm phát hiện các dạng đột biến đột + Kiểm tra kết quả PCR bằng điện di sản biến điểm chưa được triển khai. Xác định phẩm PCR trên gen agarose 2%. chính xác đột biến gen cho bệnh nhân đóng + Phản ứng sequencing sử dụng cặp mồi vai trò quan trọng giúp phát hiện người lành xuôi hoặc mồi ngược. mang gen bệnh cho các thành viên gia đình + Tinh sạch sản phẩm của phản ứng và hướng tới liệu pháp điều trị gen. Nghiên sequencing. cứu này được tiến hành với mục tiêu “Phát hiện đột biến điểm trên gen dystrophin ở bệnh + Giải trình tự trên máy ABI sequencer nhân loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật 3100. giải trình tự gen”. + So sánh kết quả với GeneBank để phát II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP hiện đột biến điểm. 3. Đạo đức nghiên cứu 1. Đối tượng Các đối tượng tham gia hoàn toàn tự 33 bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne đã nguyện và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi được xác định không có đột biến xoá đoạn và không muốn tham gia nghiên cứu. Các thông lặp đoạn gen dystrophin bằng kỹ thuật MLPA tin liên quan đến bệnh nhân được đảm bảo được lựa chọn vào nghiên cứu. Bệnh nhân có bí mật. dấu hiệu yếu cơ, đi lại hay vấp ngã, phì đại cơ cẳng chân, dấu hiệu Gower dương tính; hoạt III. KẾT QUẢ đột enzym creatin kinase huyết thanh tăng rất Tiến hành xác định đột biến điểm bằng kỹ cao 5 - 10 lần (bình thường 200 UI/l). thuật giải trình tự gen toàn bộ 79 exon của 2. Phương pháp gen dystrophin. Kết quả đã phát hiện được 14/33 (42%) bệnh nhân có đột biến điểm trên Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số gen dystrophin. Các mẫu DNA được tách chiết từ máu Trong số 14 bệnh nhân có đột biến điểm, ngoại vi theo phương pháp đã được mô tả phát hiện được 7/14 (50%) bệnh nhân có đột trước đây [12; 13]. Nồng độ và độ tinh sạch biến vô nghĩa (nonsense mutation); 4/14 DNA được kiểm tra nhờ phương pháp quang phổ (OD 260/280). (28,5%) bệnh nhân có đột biến thêm nucleotid (small insertion) và 3/14 (21,5%) bệnh nhân Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp [10] có đột biến xoá nucleotid (small deletion) 79 exon của gen dystrophin được giải trình (bảng 1). 2 TCNCYH 99 (1) - 2016
3. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng 1. Kết quả đột biến điểm gen dystrophin của bệnh nhân DMD STT MS Thay đổi c.DNA Thay đổi Protein Exon Thể bệnh 1 MS138 c.1062G > A p.Trp345X Exon 10 DMD 2 MS129 c.1201C > T p. Gln401X Exon 11 DMD 3 MS123 c.1702C > T p.Gln568X Exon 14 DMD 4 MS144 c.2302C > T p.Arg768X Exon 19 DMD 5 MS122 c.2569C > T p.Gln856X Exon 20 DMD 6 MS196 c.2887delT p.Ser963Pfsx40 Exon 22 DMD 7 MS159 c.3580C > T p.Gln1194X Exon 26 DMD 8 MS131 c.3715InsTAAATAG p.Glu1438X Exon 27 DMD 9 MS139 c.3767InsT p.Gly1256ValfsX15 Exon 27 DMD 10 MS130 c.4212,4213 delTC p.Gln1405fsX11 Exon 30 DMD 11 MS121 c.6274 InsTA p.Tyr2092LeufsX22 Exon 43 DMD 12 MS124 c.6237,6238 delCC p.Ser2079Serfs2X Exon 43 DMD 13 MS128 c.6224InsTGTA p.Leu2075LeufsX10 Exon 43 DMD 14 MS125 c.7522G > T p.Glu2508X Exon 51 DMD *DMD: loạn dưỡng cơ Duchenne. 21,5% đột biến mất nucleotid 50% đột biến vô nghĩa 28,5% đột biến thêm nucleotid Hình 1. Tỷ lệ các dạng đột biến điểm trên gen dystrophin TCNCYH 99 (1) - 2016 3
4. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết quả phát hiện đột biến vô nghĩa của bệnh nhân MS53: Người bình thường Bệnh nhân Hình 2. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân MS53 Kết quả trên cho thấy, tại vị trí 1201 trên mRNA của gen dystrophin tương ứng với trình tự nucleotid C ở người bình thường đã được thay thế bằng nucleotid T dẫn đến sự thay đổi acid amin glutamic ở vị trí 401 thành mã kết thúc sớm (đột biến vô nghĩa). Kết quả phát hiện đột biến thêm nucleotid của bệnh nhân MS121 Hình 3. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân MS121 Kết quả trên cho thấy, tại vị trí 6274 trên mRNA của gen dystrophin tương ứng với trình tự nucleotid A ở người bình thường đã được thêm 2 nucleotid TA dẫn đến sự thay đổi acid amin Tyrosin ở vị trí 2092 thành Leucin. Sự thêm 2 nucleotid TA sẽ gây lệch khung dịch mã và tạo ra mã kết thúc sớm ở vị trí acid amin thứ 22, bắt đầu từ vị trí đột biến thêm nucleotid. V. BÀN LUẬN Giải trình tự gen là một kỹ thuật chi phí cao và thuật MLPA đã được tiến hành giải trình tự mất nhiều thời gian, vì vậy chỉ khi bệnh nhân đã toàn bộ 79 exon. Kết quả đã phát hiện được được xác định không có đột biến xóa đoạn hoặc 14/33 (42%) bệnh nhân có đột biến điểm, lặp đoạn gen mới ứng dụng kỹ thuật này để phát trong đó 7 bệnh nhân có đột biến vô nghĩa hiện đột biến [8 - 10]. Trong nghiên cứu này, 33 (nonsense mutation); 4 bệnh nhân có đột biến bệnh không phát hiện được đột biến bằng kỹ thêm nucleotid (small insertion) và 3 bệnh 4 TCNCYH 99 (1) - 2016
5. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nhân có đột biến xoá nucleotid (small bào, giúp tổng hợp nên những phân tử protein deletion). Các đột biến thêm nucleotid và đột hoàn chỉnh từ phân tử mRNA mang mã đột biến xoá nucleotid đã gây lệch khung dịch mã biến dừng [16]. Bên cạnh việc tiếp tục những (frameshift), tạo ra mã kết thúc sớm. Trong 7 thử nghiệm hoạt tính readthrough của nhóm đột biến vô nghĩa, đột biến thay thế C > T kháng sinh aminoglycoside, những năm gần chiếm nhiều nhất với 5 trường hợp, còn lại là đây các nhà khoa học cũng đang hướng sự 1 đột biến thay thế G > T và 1 đột biến thay chú ý tới thuốc ataluren (sản phẩm của công thế G > A. Trong các đột biến thêm nucleotid ty PTC Therapeutic, New York, Hoa Kỳ). Với và xoá nucleotid có các đột biến thêm 1, 2, 4 , cơ chế tác động trực tiếp vào tiểu phần 60S 7 nucleotid và 2 đột biến xoá 2 nucleotid. Đột biến vô nghĩa trong nghiên cứu này chiếm tỉ lệ của ribôxôm, ataluren cho phép ribôxôm đọc cao nhất, tiếp theo là đột biến thêm nucleotid lướt qua các mã dừng đột biến trên phân tử và đột biến xoá nucleotid. Kết quả này cũng mRNA. Những thử nghiệm trên mô hình tương đồng với nghiên cứu của Takeshima và chuột mdx cho thấy ataluren có khả năng cộng sự năm 2010 với 33/40 trường hợp đột phục hồi quá trình tổng hợp dystrophin [17]. biến vô nghĩa [10]. Các đột biến vô nghĩa, đột Hiện nay những thử nghiệm lâm sàng biến xóa hoặc thêm nucleotid đã khiến protein ataluren trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ dystrophin cắt ngắn làm mất chức năng và là Duchenne bị đột biến vô nghĩa đang được nguyên nhân gây bệnh loạn dưỡng cơ Du- tiến hành và giám sát bởi Viện Sức khỏe chenne [10]. Các đột biến tìm thấy trong Quốc gia Hoa Kỳ [18; 19]. nghiên cứu này nằm rải rác các trên các exon của gen dystrophin, kết quả này cũng tương Việc xác định chính xác đột biến gen cho đồng với các nghiên cứu trước đây, điều này bệnh nhân không những đóng vai trò quan cho thấy sự cần thiết phải giải trình tự toàn bộ trọng giúp phát hiện người lành mang gen gen dystrophin để phát hiện đột biến. 19/33 bệnh cho các thành viên gia đình bệnh nhân, bệnh nhân DMD/BMD chưa phát hiện thấy đột mà còn giúp hướng tới liệu pháp điều trị gen biến gen dystrophin, có thể do một số đột biến cho bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne nằm ở vùng intron mà nghiên cứu này chưa Việt Nam. tìm thấy. V. KẾT LUẬN Liệu pháp điều trị gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne đang được nghiên cứu trong Đã phát hiện được 14/33 (42%) bệnh nhân những năm gần đây bằng cách gây xoá đoạn loạn dưỡng cơ Duchenne có đột biến điểm exon bị đột biến hoặc exon nằm liền kề với trên gen dystrophin, trong đó đột biến vô vùng đột biến nhằm khôi phục lại khung dịch nghĩa (nonsense mutation) chiếm tỷ lệ cao mã. Nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính nhất so với đột biến thêm hoặc mất nucleotid. readthrough đang tiến hành trên những bệnh Lời cảm ơn nhân có đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) [15]. Các nhà khoa học đã chứng Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh minh nhóm kháng sinh aminoglycoside phí của đề tài cấp nhà nước KC.04.08-11/15 (gentamicin, tobramicin, amikacin, hygromicin) “Nghiên cứu xây dựng quy trình điều trị gen có thể tác động đến bộ máy dịch mã của tế cho bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”. TCNCYH 99 (1) - 2016 5
6. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TÀI LIỆU THAM KHẢO trophy cases from one Japanese referral cen- ter. J Hum Genet, 55(6), 379 - 388. 1. Martin J.J., Ceuterick C., Lübke U., 11. Gatta V., Scarciolla O., Gaspari A.R. Van B.C (1993). Duchenne muscular dystro- (2005). Identification of deletions and duplica- phy immunohistochemistry of foetal muscles. tions of the DMD gene in affected males and Acta Neurol Belg, 93(3), 130. carrier females by multiple ligation probe am- 2. Mendell R.J., Griggs C.R. (1991). Mus- plification (MLPA). Hum Genet, 117, 92 - 98. cular dystrophin.Harrison’s principles of inter- 12. Trần Vân Khánh, Matsafumi Matsuo nal medicine, 12th edition, 2112 - 2118. và cộng sự (2004). Chẩn đoán 85 bệnh nhân 3. Matsuo M (2002). Duchenne and Việt Nam mắc bệnh nhược cơ Duchenne/ Becker muscular dystrophy: from molecular Becker bằng phương pháp PCR. Tạp chí Y diagnosis to gene therapy. IUBMB Life, 53, học Việt Nam. 33 - 38. 147 - 152. 13. Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân 4. Monaco, A.P., Neve, R.L., Colletti- Khánh, Nguyễn Hoàng Việt, Nguyễn Thị Hà, Feener, C et al (1986). Isolation of candidate Tạ Thành Văn (2009). Khảo sát tần suất cDNAs for portions of the Duchenne muscular người mẹ mang gen dystrophin bị đột biến dystrophy gene. Nature, 323, 646 - 650. mất đoạn ở Việt Nam. Tạp chí Nghiên cứu Y 5. Koenig, M., Hoffman, E.P., Bertelson, học, 62(3), 105 - 112. C.J et al (1987). Complete cloning of the 14. Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA (2011). Áp dụng quy trình chẩn đoán trước and preliminary genomic organization of the sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ DMD gene in normal and affected individuals. thuật multiplex ligation-dependent probe am- Cell, 50, 509 - 517. plification. Tạp chí Nghiên cứu Y học, 72(1), 6. Prior T.W., Barrtolo C., Paerl D.K. et al 10 - 16. (1995). Spectrum of small mutation in the dys- 15. Palmer E, Wilhelm JM, Sherman F trophin coding region. Am J Hum Genet, 57, (1979). Phenotypic suppression of nonsense 22 - 24. mutants in yeast by aminoglycoside antibiot- 7. Abbs S., Bobrow M (1992). Analysis of ics. Nature, 277,148 - 150. quantitative PCR for the diagnosis of deletion 16. Keeling KM, Bedwell DM (2002). and duplication carriers in the dystrophin Clinically relevant aminoglycosides can gene.J Med Genet, 29,191 - 196. suppress disease-associated premature stop 8. Prior T.W., Barrtolo C., Paerl D.K et al mutations in the IDUA and p53 cDNAs in a (1995). Spectrum of small mutation in the dys- mammalian translation system. J Mol Med, 80, trophin coding region. Am J Hum Genet, 57, 367 - 376. 22 - 24. 17. Barton-Davis ER, Shoturma DI 9. Poh-san Lai, Van Khanh Tran (2002). (1999). Aminoglycoside antibiotics restore Comparative study on deletions of dystrophin dystrophin function to skeletal muscle of mdx gene in three Asian populations. J. Hum. mice. J Clin Invest, 104, 375 - 381. Genet. 47, 552 - 555. 18. Politano L, Nigro G, Nigro V (2003). 10. Takeshima Y, Yagi M, Yamauchi Y, et Gentamicin administration in Duchenne pa- al (2010). Mutation spectrum of the dystrophin tients with premature stop codon. Preliminary gene in 442 Duchenne/Becker muscular dys- results. Acta Myol, 22, 15 - 21. 6 TCNCYH 99 (1) - 2016
7. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 19. Barton E, Zadel M (2005). PTC124 Duchenne muscular dystrophy. Neurology, 64 nonsense mutation suppression therapy of (1), A176. Summary USE OF SEQUENCING TECHNIQUE FOR DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY GENE MUTATION ANALYSIS Duchenne muscular dystrophy (DMD) are X-linked recessive disorders, caused by mutations in the dystrophin gene. Up to 70 - 75% of all DMD cases are caused by exonic deletions or dupli- cations routinely identified in diagnostic laboratories worldwide. The 20 - 25% of remaining patients harbour other sequence alterations for which testing availability is limited owing to the expense of interrogating the large dystrophin gene. Genetic screening for DMD in Vietnam currently includes MLPA for exonic deletions and duplications. No genetic testing for small mutations in the DMD gene is offered, leaving a third of DMD families without genetic closure. The advent of potential mutation-specific therapies for DMD necessitates comprehensive testing protocols. This study aims to investigate small/point mutations in dystrophin gene using s equencing technique. 33 DMD patients who had previously been screened for deletion or duplication-negative were tested with the MLPA method. Sequencing technique was used to identify small/point mutation in dystrophin gene. The results showed that 14/33 patients carried small/point mutations in dystrophin gene, of those 7 DMD patients revealed nonsense mutation; of those 7 DMD patients, 4 have small insertions and 3 have small deletions which caused frameshift mutations. Keywords: Duchenne muscular dystrophy, point mutation, sequencing TCNCYH 99 (1) - 2016 7