Ứng dụng realtime - Pcr để xác định nhanh các đa hình gen cyp2c19 và itgb3 trong chẩn đoán tính kháng thuốc clopidogrel và aspirin ở bệnh nhân đặt stent động mạch vành

Nội dung text: Ứng dụng realtime - Pcr để xác định nhanh các đa hình gen cyp2c19 và itgb3 trong chẩn đoán tính kháng thuốc clopidogrel và aspirin ở bệnh nhân đặt stent động mạch vành

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 ỨNG DỤNG REALTIME - PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH NHANH CÁC ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ ITGB3 TRONG CHẨN ĐOÁN TÍNH KHÁNG THUỐC CLOPIDOGREL VÀ ASPIRIN BỆNH NHÂN ĐẶT STENT ĐỘNG MẠCH VÀNH Nguyễn Thị Minh Ngọc*; Nguyễn Thị Trang* Lương Thị Lan Anh*; Nguyễn Thị Mai Ngọc**; Triệu Tiến Sang*** TÓM TẮT Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các đa hình CYP2C19*2, CYP2C19*3 gen CYP2C19 và PlA1/PlA2(Leu33Pro) gen ITGB3 có liên quan đến đề kháng clopidogrel và aspirin. Tách ADN được từ 40 bệnh nhân (BN), sử dụng kỹ thuật realtime - PCR để xác định đa hình gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và PlA1/PlA2 (Leu33Pro). Khi phân tích đa hình gen CYP2C19 (CYP2C19*2 và CYP2C19*3) phát hiện 21 người (52,5%) có mang đột biến gen, trong đó 14 người (35%) mang gen dị hợp tử và 4 người (10%) mang đồng hợp tử đột biến CYP2C19*2 và 3 người mang gen dị hợp CYP2C19*3. Với đa hình PlA1/PlA2 gen ITGB3, phát hiện 4 người mang gen dị hợp tử (10%). Như vậy, tỷ lệ phát hiện đa hình gen trên khá cao ở nhóm BN điều trị kép clopidogrel và aspirin. * Từ khóa: Bệnh mạch vành; CYP2C19; Kháng clopidogrel; ITGB3; Kháng aspirin. Realtime-PCR Application for Determine Polymorphism of CYP2C19 and ITGB3 Gene in Clinical Diagnostic Clopidogrel and Aspirin Resistance in Patients Placed Coronary Stent Summary Numerous studies have shown that the polymorphisms of CYP2C19*2, CYP2C19*3 gene CYP2C19 and PlA1/PlA2 (Leu33Pro) of the ITGB3 gene are associated with clopidogrel and aspirin resistance. DNA was extracted from 40 patients. Using realtime-PCR technique to identify polymorphisms CYP2C19*2, CYP2C19*3 gene CYP2C19 and PlA1/PlA2 (Leu33Pro) gene ITGB3. Results: In 40 samples, carriers of at least one CYP2C19 loss-of-function approximately 52.5% of the study population. CYP2C19*2: 10% homozygous genotype, 35% heterozygous genotype and 55% wild type. CYP2C19*3: 7.5% heterozygous genotype and 92.5% wild type. Carriers of the Leu33Pro polymorphism of ITGB3 gene approximately 10% of the study population. Conclusions: Initial description of polymorphisms of CYP2C19*2, CYP2C19*3 gene CYP2C19 and PlA1/PlA2 (Leu33Pro) gene ITGB3 have been found to be high rate in group patient used clopidogrel and aspirin dual therapy. * Keywords: Coronary artery disease; CYP2C19; Clopidogrel resistance; ITGB3; Aspirin resistance. * Trường Đại học Y Hà Nội * Viện Tim mạch Quốc gia *** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Trang (trangtrang1182@yahoo.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 06/09/2017 311
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 ĐẶT VẤN ĐỀ năng chống kết tập tiểu cầu của aspirin Bệnh mạch vành là nguyên nhân gây khi sử dụng thuốc trong chấn thương vi tử vong hàng đầu tại các nước phát triển. mạch [6 . Như vậy, trước một BN mạch Tại các nước đang phát triển, trong đó có vành đã đặt stent, để xác định phác đồ Việt Nam, bệnh mạch vành đang có xu điều trị chống kết tập tiểu cầu hiệu quả hướng gia tăng nhanh trong những năm nhất, cần xác định các đa hình gen liên gần đây. Đặt stent động mạch vành qua quan đến chuyển hóa 2 thuốc clopidogrel da là phương pháp điều trị hiệu quả cho và aspirin. BN mạch vành cần can thiệp. Khuyến cáo Phương pháp realtime - PCR là mới nhất phương pháp xác định đa hình chính xác của Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ và với ưu điểm kỹ thuật tương đối đơn giản, Hiệp hội Tim mạch châu Âu nhấn mạnh thời gian nhanh chóng, mở ra nhiều triển tầm quan trọng của duy trì thuốc kháng vọng cho việc ứng dụng kỹ thuật này như tiểu cầu kép sau đặt stent động mạch một xét nghiệm thường quy trước khi chỉ định điều trị clopidogrel và aspirin cho BN vành. Cụ thể, BN được can thiệp mạch mạch vành đã đặt stent. Vì vậy, chúng tôi vành (nong bóng động mạch vành hoặc tiến hành nghiên cứu này nhằm: Xác định đặt stent) cần dùng phối hợp aspirin với các đa hình gen CYP2C19*2, một thuốc kháng tiểu cầu thuộc nhóm ức CYP2C19*3 (G681A và G636A) và chế P2Y12 như clopidogrel để giảm nguy Leu33Pro (T1565) gen ITGB3 bằng kỹ cơ nhồi máu cơ tim hoặc tử vong. Tuy thuật realtime - PCR ở BN mạch vành đã nhiên, đáp ứng thuốc ở mỗi BN khác đặt stent. nhau. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra đề kháng clopidogrel và aspirin bị ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP ảnh hưởng nhiều bởi yếu tố di truyền, cụ NGHIÊN CỨU thể là liên quan đến kiểu gen của enzym 1. Đối tƣợng nghiên cứu. chuyển hóa thuốc như CYP2C19 và 40 BN mạch vành (được chẩn đoán ITGB3. mắc hội chứng vành cấp: nhồi máu cơ CYP2C19*2 (CYP2C19 G681A, rs tim, đau thắt ngực không ổn định), được 4244285) và CYP2C19*3 (CYP2C19 đặt stent động mạch vành qua da và có G636A, rs 4986893) là hai alen quy định chỉ định điều trị clopidogrel và aspirin. enzym CYP2C19 giảm khả năng chuyển hóa clopidogrel đã được nhiều nghiên 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. cứu chứng minh có liên quan đến gia Tách chiết AND từ máu ngoại vi tăng các biến cố tim mạch [2, 3, 4 . PlA1 (chống đông EDTA) bằng kít tách ADN và PlA2 (Leu33Pro, rs5918) là 2 đa hình Express của (Hãng Lytech, Nga). Sử gen ITGB3 có liên quan đến đáp ứng với dụng kỹ thuật realtime - PCR để xác định aspirin [5 . Undass và CS (2001) chỉ ra đa hình gen CYP2C19(CYP2C19*2 và mối liên quan giữa đa hình PlA2 với tăng CYP2C19*3) và PlA1/PlA2 (Leu33Pro) cường chức năng thrombin và giảm chức gen ITGB3 với trình tự mồi: 312
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Bảng 1: Đa h nh Tr nh tự mồi CYP2C19*2 FP 5’ - CCCACTATCATTGATTATTTCTCG - 3’ (G681A) ASP 5’- CCCACTATCATTGATTATTTCTCA - 3’ RP 5’ - ACGCAAGCAGTCACATAACTA - 3’ CYP2C19*3 FP 5’ - GGATTGTAAGCACCCCCAGG - 3’ (G636A) ASP 5 - GGATTGTAAGCACCCCCAGA - 3’ RP 5’ - TCACCCCATGGCTGTCTAGG - 3’ Leu33Pro FP 5’ - GCTCCAATGTACGGGGTAAAC - 3’ (T1565C) ASP 5’ - GCTCCAATGTACGGGGTAAAT - 3’ RP 5’ - GGGGACTGACTTGAGTGACCT - 3’ (FP: forward primer; ASP: allele specific xác định đa hình gen. Như vậy, kỹ thuật primer; RP: reverse primer) này có khả năng ứng dụng cao trong thực Thực hiện kỹ thuật realtime - PCR trên hành lâm sàng để xác định nhanh và máy CFX96 (BioRad, Mỹ) với chu trình chính xác kiểu gen của BN trước khi đưa luân nhiệt: 93oC - 1 phút, 35 chu kỳ (93oC ra phác đồ, liều điều trị clopidogrel và - 10s, 64oC - 10s, 72oC - 20s), 72oC - 5 aspirin. phút. * Đạo đức nghiên cứu: Sử dụng bộ kít ADN-express để tách Số liệu và thông tin nghiên cứu hoàn chiết ADN và kỹ thuật realtime - PCR toàn chính xác, trung thực và khách quan nhân gen và phân tích đột biến là phương đã được cơ sở nghiên cứu xác nhận và pháp tiết kiệm thời gian: trung bình 45 chấp thuận. Thông tin về BN được giữ bí phút cho tách chiết ADN và 90 phút cho mật và chỉ phục vụ công tác nghiên cứu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung về mẫu nghiên cứu. Bảng 2: Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu. Đặc điểm T lệ (n = 40) Tuổi (trung bình ± độ lệch) 62,6 ± 9,5 Giới: nam 34 ( 85%) nữ 6 (15%) Tăng huyết áp 29 (72,5%) Đái tháo đường 9 (22,5%) Rối loạn lipid máu 13 (32,5%) Số lần đặt stent ≥ 2 lần 7 (17,5%) 313
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 40 BN tham gia nghiên cứu, độ tuổi từ 39 - 79,nam giới chiếm đa số (85%). BN có yếu tố nguy cơ cao bệnh tim mạch chiếm tỷ lệ tương đối lớn, đặc biệt là tăng huyết áp và rối loạn lipid máu. 2. Tỷ lệ phát hiện đa hình gen CYP2C19 và ITGB3 bằng kỹ thuật realtime - PCR. Bảng 3:Tỷ lệ phát hiện đa hình gen CYP2C19 và ITGB3 ở nhómnghiên cứu. Chỉ số Gen CYP2C19 Gen ITGB3 Gi i Đa hình gen *2, *3 Đa hình gen Leu33Pro Nam 16 (47,1%) 3 (8,8%) Nữ 4 (66,7%) 1 (16,7%) Chung 21 (52,5%) 4 (10%) Tỷ lệ các đa hình gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 ở nhóm nghiên cứu tương đối lớn: 52,5% BN mang ít nhất 1 alen CYP2C19 làm giảm chức năng chuyển hóa clopidogrel. Bên cạnh đó, 10% BN có đa hình gen ITGB3 liên quan đến đề kháng aspirin. 3. T lệ các đa h nh gen CYP2C19 và ITGB3 ở nhóm nghiên cứu. Bảng 4: Kết quả xác định kiểu gen CYP2C19 và ITGB3 ở nhóm nghiên cứu. Tần số kiểu gen Gen Bình thường Dị hợp tử Đồng hợp tử đa hình (%) (%) (%) CYP2C19*2 n = 22 n =14 n = 4 (G681A) (55%) (35%) (10%) CYP2C19*3 n = 37 n = 3 n = 0 (G636A) (92,5%) (7,5%) (0%) PlA1/PlA2 n = 36 n = 4 n = 0 (T1565C) (90%) (10%) (0%) 45% BN mang alen CYP2C19*2, chủ yếu kiểu gen dị hợp tử (35%), kiểu gen đồng hợp tử 10%. 7,5% BN mang alen CYP2C19*3, đều có kiểu gen dị hợp tử. 10% BN mang alen PlA2 - đều có kiểu gen dị hợp tử. BÀN LUẬN chứng vành cấp và các thủ thuật can Bệnh mạch vành ngày càng gia tăng thiệp mạch vành qua da. Hiện nay, và chiếm tỷ lệ lớn trong các bệnh tim phương pháp điều trị phối hợp aspirin và mạch nói riêng và mô hình bệnh tật nói clopidogrel được xem như liệu pháp chung. Liệu pháp chống kết tập tiểu cầu kháng tiểu cầu chuẩn cho những bệnh lý đóng vai trò thiết yếu trong điều trị hội này. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra đề kháng với aspirin và clopidogrel làm 314
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 giảm hiệu quả điều trị. Theo nghiên cứu này đều có kiểu gen dị hợp tửPlA1/PlA2. của Boris T và CS (2009), tỷ lệ không đáp Không có BN mang kiểu gen đồng hợp tử ứng với aspirin dao động từ 5 - 60%, với PlA2/PlA2. Nghiên cứu của Sperr W.R và clopidogrel 6 - 25% và cả hai thuốc là CS (1998) trên người châu Âu thấy 20 - 10,4% [7 . Ở Việt Nam, Đỗ Quang Huân 30% nhóm nghiên cứu mang kiểu gen (2013) khảo sát 174 BN mạch vành thấy PlA1/PlA2 và 1 - 3% mang kiểu gen tỷ lệ không đáp ứng với aspirin 21,3%, PlA2/PlA2 [10 . Nghiên cứu này chỉ ra với clopidogrel 26,4% [1 . Như vậy, kiểu gen PlA1/PlA2 và PlA2/PlA2 làm nghiên cứu về các yếu tố liên quan đến tăng phản ứng hoạt hóa thrombin hơn so đề kháng clopidogrel và aspirin, đặc biệt với kiểu gen đồng hợp tử PlA1/PlA1. Do yếu tố di truyền rất cần thiết trong việc đó làm giảm tác dụng chống kết tập tiểu phòng và điều trị bệnh mạch vành. cầu của aspirin, hay nói cách khác, người Trong nghiên cứu của chúng tôi, 52,5% có mang alen PlA2 sẽ tăng khả năng BN có mang ít nhất 1 alen CYP2C19 làm kháng thuốc aspirin hơn. Nghiên cứu của giảm khả năng chuyển hóa clopidogrel Jussi M và CS (2000) ở người Phần Lan (CYP2C19*2 hoặc CYP2C19*3). Kết quả thấy trong nhóm nghiên cứu có 73,1% này tương tự với nghiên cứu của Liu Mao mang kiểu gen PlA1/PlA1, 24,2% PlA1/PlA2 và CS (2013): khoảng 55% người châu Á và 2,7% PlA2/PlA2 [11 . Nghiên cứu cũng mang ít nhất 1 alen làm giảm hoạt tính chỉ ra mối liên quan chặt chẽ giữa alen của enzym CYP2C19 [8 . Trong đó, chủ PlA2 và gia tăng các biến cố tim mạch yếu là BN có kiểu gen dị hợp CYP2C19*2 như huyết khối động mạch hoặc đột quỵ. (14 BN - 35%) và 3 BN mang kiểu gen dị Với kết quả nghiên cứu trên của chúng hợp CYP2C19*3 (7,5%). Như vậy, kiểu tôi, bước đầu thấy tỷ lệ mang đa hình gen gen chuyển hóa ở mức trung bình CYP2C19 làm giảm khả năng chuyển hóa (intermediate metabolizers) clopidogrel clopidogrel và đa hình gen ITGB3 làm chiếm tỷ lệ tương đối lớn. Kiểu gen giảm đáp ứng với aspirin ở nhóm BN chuyển hóa kém (poor metabolizers) - mạch vành ở Việt Nam tương đối lớn, đồng hợp CYP2C19*2 và đồng hợp người thầy thuốc cần quan tâm trước khi CY2C19*3 có 4 BN(10%). Theo khuyến điều trị phác đồ chống kết tập tiểu cầu kép. cáo của Hội Dược lý Lâm sàng và Điều trị Hoa Kỳ (ASCPT) (2013) về sử dụng KẾT LUẬN thuốc chống ngưng tập tiểu cầu dựa trên Tỷ lệ BN mang đa hình gen kiểu gen CYP2C19 [9 , BN có kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 trong nghiên CYP2C19 chuyển hóa trung gian hoặc cứu 52,5%, tỷ lệ BN mang đa hình chuyển hóa kém cần xem xét tăng liều Leu33Pro gen ITGB3 10%. Như vậy, số clopidogrel hoặc điều trị thay thế prasugrel, BN có khả năng đáp ứng với clopidogrel ticagrelor và aspirin kém tương đối lớn, cần xác Ngoài ra, nghiên cứu của chúng tôi định kiểu gen để cân nhắc liều lượng còn ghi nhận 4 BN (10%) mang đa hình thuốc, hoặc thay thế thuốc cho phù hợp Leu33Pro gen ITGB3, tất cả những BN 315
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 trong phác đồ điều trị của từng BN sau young patients treated with clopidogrel after đặt stent ĐMV. myocardial infarction: a cohort study. Lancet. 2009, 373 (9660), pp.309-17. Kỹ thuật realtime - PCR là phương pháp xác định đa hình gen nhanh chóng, 5. Newman P.J, Derbes R.S, Aster R.H. The human platelet alloantigens, Pl(A1) chính xác và chi phí phù hợp với điều and Pl(A2), are associated with a kiện Việt Nam, có khả năng ứng dụng tốt leucine(33)/proline(33) amino acid trong lâm sàng. polymorphism in membrane glycoprotein IIIa, Qua kết quả nghiên cứu bước đầu về and are distinguishable by ADN typing. J. ứng dụng kỹ thuật realtime - PCR, nhận Clin. Invest. 1989, 83, pp.1778-1781. thấy cần đưa xét nghiệm này trở thành 6. Undas A, Brummel K, Musial J et al. Pl(A2) thường quy để xác định kiểu gen liên polymorphism of beta-3 integrins is associated quan đến chuyển hóa thuốc clopidogrel with enhanced thrombin generation and và aspirin trước khi điều trị cho các BN impaired antithrombotic action of aspirin at the mạch vành. site of microvascular injury. Circulation. 2001, 104, pp.2666-2672. L I CẢM ƠN 7. Boris T.I, Mareike Sausemuth H.I, Nghiên cứu được thực hiện tại trường Evangelos G et al.Dual antiplatelet drug Đại học Y Hà Nội, trong thời gian từ tháng resistance is a risk factor for cardiovascular 6 - 2016 đến 2 - 2017, với sự hỗ trợ của events after percutaneous coronary intervention. các đồng nghiệp tại Bộ môn Y sinh học - Clinical Chemistry. 2009, 55, pp.1171-1176. Di truyền. 8. Liu Mao et al.Cytochrome CYP2C19 polymorphism and risk of adverse clinical TÀI LIỆU THAM KHẢO events in clopidogrel-treated patients: A meta- 1. Đỗ Quang Huân, Hồ Tấn Thịnh Tỷ lệ analysis based on 23035 subjects. Archives of không đáp ứng với điều trị thuốc chống kết Cardiovascular Disease.2013, 106, pp.517-527. tập tiểu cầu trên BN được can thiệp động 9. Scott S.A, Sangkuhl K, Stein C.M et al. mạch vành qua da. Tạp chí Y học Thực hành Clinical pharmacogeneticsimplementation (878). 2013, số 8, tr.9-13. consortium guidelines for CYP2C19 genotype 2. Brant J.T, Close S.L, Iturria S.J et al. and clopidogrel therapy: 2013 update. Clin Common polymorphysm of CYP2C19 and Pharmacol Ther. 2013, 94 (3), pp.317-23. CYP2C9 affect the phamacokinetic and 10. Sperr W.R, Huber K, Roden M et al. pharmacodynamic respone to clopidogrel but Inherited platelet glycoprotein polymorphisms not prasugrel. J Thromb Heamost. 2007, 5, and a risk for coronary heart disease in young pp.2429-2436. central Europeans. Thromb Res. 1998, 90, 3. Mega J.L, Close S.L, Wiviott S.D et al. pp.117-123. Cytochrome p-450 polymorphisms and response 11. Jussi Mikkelsson, Markus Perola et al. to clopidogrel. N Engl J Med. 2009, 360 (4), Glycoprotein IIIa PlA1/A2 polymorphism and pp.354-62. sudden cardiac death. Journal of 4. Collet J.P, Hulot J.S, Pena A et AmericanCollege of Cardiology. 2000, 36 (4), al.Cytochrome P450 2C19 polymorphism in pp.1317-23. 316