Ứng dụng phức hợp hạt nano-kháng thể đơn dòng phát hiện vi khuẩn listeria monocytogenes

Nội dung text: Ứng dụng phức hợp hạt nano-kháng thể đơn dòng phát hiện vi khuẩn listeria monocytogenes

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 ỨNG DỤNG PHỨC HỢP HẠT NANO-KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES Lê Thị Hiên*; Vũ Xuân Nghĩa** Phạm Đức Minh**; Nguyễn Năng Định* TÓM TẮT Phức hợp của chấm lượng tử CdSe/ZnS với kháng thể đơn dòng (KTĐD) được tạo ra để ứng dụng phát hiện vi khuẩn (VK) L. monocytogenes, sau khi các tế bào này được ly giải bằng phương pháp hóa học trên màng nitrocellulose. Bên cạnh đó, sản phẩm thương mại phức hợp hạt nano vàng với kháng thể đơn dòng được sử dụng để so sánh khả năng phát hiện L. monno. Kết quả cho thấy, phức hợp KTĐD-chấn lượng tử được tạo ra có kích thước tương ứng 10 nm có khả năng phát hiện L. mono ở nồng độ VK ly giải trên màng cellulose từ 105 - 106 cfu/ml. * Từ khóa: L. monocytogenes; Kháng thể đơn dòng; Phức hợp hạt nano. Application of monoclonal antibody-conjugated nanoparticles for detection of bacteria Listeria monocytogenes summary The monoclonal antibody-conjugated CdSe/ZnS quantum dots were synthesized for detection of L. monocytogenes after the cell lysis on nitrocellulose membrane. In addition, a commercial product - monoclonal antibody-conjugated gold nanoparticles - was used for comparison of these two materials. The study broadened the applications of nanomaterials in bioimaging and pathogene detection. * Key words: L. monocytogenes; Monoclonal antibody; Nanoparticles. ĐẶT VẤN ĐỀ khuẩn từ thực phẩm. Khác với các loài gây ngộ độc thực phẩm khác, L. monocytogenes Ngộ độc thực phẩm đã và đang là vấn có thể phát triển ngay cả ở 4ºC (khi thực đề được cộng đồng trên toàn thế giới quan phẩm được giữ trong tủ lạnh). Do đó, tâm. Nguyên nhân chính gây ra các ca ngộ L.monocytogenes có thể gây ra ngộ độc độc thực phẩm là do VK như Salmonella, cho con người từ những thực phẩm đông Escherichia coli, L. monocytogenes... Trong lạnh. Mặc dù hiện diện với số lượng nhỏ đó, số ca tử vong do VK, L. monocytogenes trong thực phẩm, nhưng khi đi vào cơ thể, gây ra đứng thứ hai (chỉ sau VK Salmonella) chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ trong tổng số các ca tử vong do nhiễm hội gây bệnh. * Đại học Công nghệ - Đại học Quốc gia Hà Nội ** Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Nguyễn TháI Sơn PGS. TS. Nguyễn Lĩnh Toàn 25
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Hiện nay đã có nhiều phương pháp phát dòng với hạt nano vàng (biodesign) hoặc hiện VK L. monocytogenes như: nuôi cấy phức hợp kháng thể đơn dòng với các chấm [1], PCR [2], Western blot [3], ELISA [4], lượng tử (tự gắn). Đây là một phương pháp ELFA [5]. Nuôi cấy là phương pháp truyền sử dụng vật liệu mới để phát hiện vi khuẩn. thống, mất khá nhiều thời gian và cần có môi trường tăng sinh và phân lập chọn lọc ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP cho từng loại VK, nên không phù hợp với NGHIÊN CỨU nhu cầu phát hiện nhanh VK trong các mẫu 1. Vi khuẩn. thực phẩm hoặc chẩn đoán nhanh nguyên Vi khuẩn Listeria monocytogenes ATCC nhân gây ngộ độc thực phẩm cho người 35152, chủng chuẩn quốc tế, được tăng bệnh để có phương pháp điều trị kịp thời. sinh và bảo quản theo tiêu chuẩn quốc gia Các phương pháp chẩn đoán phân tử dựa tại Bộ môn Vi sinh Y học, Học viện Quân y. trên kỹ thuật miễn dịch và kỹ thuật PCR cho VK E. coli BL21 (Viện Công nghệ Sinh học, kết quả nhanh hơn và nhạy hơn. Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Gần đây, công nghệ nano phát triển rất 2. Vật liêu. nhanh tạo ra những vật liệu nano tiên tiến Kháng thể đơn dòng C86030M kháng L. (vật liệu có kích thước nanomet) mang lại mono (Biodesign), kháng thể đơn dòng nhiều ứng dụng to lớn trong lĩnh vực dược C86920M kháng L. mono gắn hạt nano phẩm và y sinh. Trong các loại vật liệu nano, vàng (Biodesign), albumin huyết thanh bò hạt nano vàng và chấm lượng tử (quantum (BSA) (Biobasic). Chấm lượng tử CdSe/ZnS dots) là hai loại vật liệu nano được nghiên (Viện Khoa học Vật liêu - Viện Khoa học cứu và ứng dụng rộng rãi nhất. Hạt nano và Công nghệ Việt Nam cung cấp). Màng vàng gắn với các phân tử sinh học là một nitrocellulose (0,45 micromet, Whatman). sản phẩm với rất nhiều ứng dụng trong lĩnh Đệm Blotting 10x (250 mM, 1,92 M Glycine). vực y sinh học, trong chẩn đoán và điều trị Đệm Blotting 1x (pha loãng đệm Blotting tế bào ung thư, đặc biệt trong công nghệ 10x với methanol và nước theo tỷ lệ thể tích chế tạo kit chẩn đoán nhanh các loại bệnh 1:2:7). Đệm TBS 1x (Tris HCl 50 mM; NaCl truyền nhiễm [6]. Chấm lượng tử với khả 100 mM; pH 7,5). Đệm TTBS 1x (0,05% năng phát huỳnh quang và độ bền màu với Tween 20 trong đệm TBS 1x). Đệm PBS 1x ánh sáng đã vượt qua các chất màu hữu cơ (100 mM NaH2PO4, 100mM Na2HPO4, 150 và trở thành một trong số những vật liệu mM NaCl pH 7,5). sáng giá của công nghệ nano. Chấm lượng 3. Phƣơng pháp nghiên cứu. tử được sử dụng trong đánh dấu tế bào và phần tử sinh học, dẫn truyền và phân phối * Tạo phức hợp kháng thể đơn dòng với thuốc, trong các công cụ chẩn đoán mới [7]. chấm lượng tử: Trong công trình nghiên cứu này, VK L. Gắn chấm lượng tử có nhóm chức amino monocytogenes sau khi được ly giải bằng với kháng thể đơn dòng kháng L. mono bằng phương pháp hóa học trên màng nitrocellulose, chất nối bis (3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester) đã phát hiện bằng phức hợp kháng thể đơn (BS3) (Sigma). Ủ chấm lượng tử 10 mg/ml 27
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 trong đệm PBS 1x với chất nối BS3 trên Vi khuÈn máy lắc trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 5.000 vòng/phút trong 5 phút, Mµng NC thu tủa, bỏ dịch tan có chứa chất BS3 dư. Thêm 20 µl PBS 1x vào tủa lắc cho tủa Hãa chÊt GiÊy thÊm phân tán đều trong đệm. Thêm 2 µl kháng thể (2,8 mg/ml), trộn nhẹ, để một giờ ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 5.000 vòng/phút §Üa trong 5 phút. Thu dịch nổi để phân tích lượng kháng thể dư bằng phương pháp Hình 1: Hình minh họa phương pháp ly giải điện di trên gel polyacrylamide (gel tách tế bào trên màng nitrocellulose. 12%, gel cô 5%). Thu tủa (phức hợp hạt nano-kháng thể), phân tán lại trong PBS 1x * Phát hiện VK sau ly giải trên màng và ủ với 3 µg BSA trong 30 phút ở nhiệt độ nitrocellulose bằng phức hợp kháng thể đơn phòng. Ly tâm thu tủa phân tán lại trong 20 dòng với hạt nano vàng hoặc với chấm µl PBS và giữ ở 4ºC để sử dụng. lượng tử: * Ly giải VK trên màng nitrocellulose: Nhỏ 1 - 2 µl dung dịch phức hợp hạt nano vàng-kháng thể đơn dòng hoặc phức Chuẩn bị dung dịch sử dụng để ly giải tế hợp chấm lượng tử-kháng thể đơn dòng lên bào và rót sẵn vào 5 đĩa Petri khác nhau. vị trí có tế bào VK L. monocytogenes đã ly - Đĩa 1: dung dịch SDS 10%; đĩa 2: dung giải trên màng nitrocellulose. Ủ 30 giây ở dịch biến tính (0,5M NaOH; 1,5M NaCl); đĩa nhiệt độ phòng. Rửa màng bằng TTBS 5 phút. 3: dung dịch trung hòa (1,5M NaCl; 0,5M Quan sát và chụp ảnh. Tris HCl pH 7,5); đĩa 4: dung dịch trung hòa Đối với phức hợp chấm lượng tử kháng (như đĩa 3); đĩa 5: dung dịch đệm SSC thể, ánh sáng huỳnh quang đỏ của mẫu (0,15 M NaCl, citrate natri 15 mM pH 7,0). được quan sát dưới đèn tử ngoại (UV - Thấm dung dịch bằng giấy thấm và để transluminator 2.000) với bước sóng kích sẵn trên các đĩa. thích 300 nm. - Ngâm màng nitrocellulose bằng đệm blotting 1x ba lần, mỗi lần 5 phút. Nhỏ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1 - 5 µl tế bào L. monocytogenes lên màng nitrocellulose. Đặt màng lên giấy đã thấm 1. Tạo phức hợp kháng thể đơn dòng ướt các dung dịch trong đĩa Petri theo thứ với chấm lƣợng tử. tự và thời gian. Đĩa 1: 10 phút; đĩa 2: 5 phút; Theo phân tích hình ảnh bằng kính hiển đĩa 3: 5 phút; đĩa 4: 5 phút; đĩa 5: 15 phút. vi điện tử quét phân giải cao (FESEM) ban Ly giải xong, để bề mặt màng khô, ngâm đầu, các chấm lượng tử cụm lại thành hạt màng bằng sữa tách béo 5% trong TTBS 1x có kích thước khá lớn khoảng 300 nm. Sau trên máy lắc trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. khi gắn kháng thể, chấm lượng tử tách Rửa màng bằng TTBS 1x ba lần, mỗi lần thành các hạt có kích thước nhỏ hơn rất 5 phút và TBS 1x ba lần, mỗi lần 5 phút. nhiều, chỉ khoảng 10 nm (hình 2). 28
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 A. 3 vạch với khối lượng phân tử 30 kDa, 50 kDa và 160 kDa, tương ứng với chuỗi nhẹ, chuỗi nặng của kháng thể và kháng thể hoàn chỉnh). 2: Thang protein. 3: Dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên chấm lượng tử. Kết quả cho thấy, trong dịch nổi không còn kháng thể nữa (đường số 3), chứng tỏ kháng thể đã gắn kết hết với chấm lượng tử và tủa xuống sau ly tâm. B. 2. Phát hiện VK sau ly giải trên màng nitrocellulose bằng phức hợp hạt nano vàng-kháng thể đơn dòng hoặc phức hợp chấm lƣợng tử-kháng thể đơn dòng. Các tế bào VK L. monocytogenes được ly giải bởi hóa chất thấm qua giấy thấm và màng nitrocellulose. Sau ly giải, các protein của VK bám vào màng nitrocellulose. Phức hợp hạt nano-kháng thể được sử dụng Hình 2: Ảnh hiển vi điện tử quét phân giải phát hiện các kháng nguyên VK trên màng cao (FESEM) của chấm lượng tử trước (A) nitrocellulose. Sử dụng đối chứng âm là và sau khi gắn kháng thể (B). dịch ly giải của VK E. coli (hình 4). Để đánh giá khả năng gắn kết của kháng A. thể với chấm lượng tử, sau phản ứng, ly tâm thu dịch nổi, phân tích bằng phương pháp điện E. coli L.monocytogennes di biến tính trên gel polyacrylamide (hình 3). (kDa) 1 2 3 160 97 106 106 (cfu/ml) 66 B. 43 E. coli L.monocytogennes 50 30 6 5 6 10 10 10 (cfu/ml) Hình 4: Phát hiện VK L. monocytogenes Hình 3: Hình30 ảnh gel điện di dịch nổi của sau khi ly giải trên màng nitrocellulose dùng phức hợp chấm lượng tử-kháng thể (A) phản ứng gắn kháng thể lên chấm lượng tử. 1: Kháng thể đơn dòng C86030M (kháng hoặc phức hợp hạt vàng-kháng thể (B). Đối thể khi chưa phản ứng với chấm lượng tử. chứng âm là dịch ly giải của VK E.coli. 29
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Sau khi nhỏ phức hợp chấm lượng tử- Trong nghiên cứu này, phức hợp hạt nano- kháng thể đơn dòng kháng L. monocytogenes kháng thể cho phản ứng miễn dịch với dịch lên vị trí tế bào L. monocytogenes đã bị ly ly giải tế bào (kháng nguyên chưa được phân giải và rửa bằng TTBS, quan sát dưới đèn tách) và phát hiện được L. monocytogenes tử ngoại thấy các chấm phát huỳnh quang ở nồng độ gần tương đương. Điều này cho đỏ. Trong khi đó, tại vị trí dịch ly giải VK phép dự đoán, nếu sử dụng kháng nguyên E. coli, không thấy các chấm phát sáng tinh sạch, tín hiệu màu cho bởi hạt nano (hình 4 A). Kết quả này chứng tỏ, chấm vàng và chấm lượng tử có thể sẽ tốt hơn lượng tử đã gắn được với kháng thể đơn nhiều. dòng kháng L. monocytogenes và phức hợp Như vậy, phương pháp ly giải tế bào tạo thành có thể sử dụng để phát hiện đặc trên màng bằng hóa chất khá đơn giản, hiệu VK L. monocytogenes. Nồng độ VK đưa không cần công đoạn phá tế bào bằng siêu 6 lên màng là 10 cfu/ml. âm và tinh sạch kháng nguyên protein Tương tự phần trên, phức hợp hạt vàng- màng tế bào. Nghiên cứu góp phần mở kháng thể đơn dòng kháng L. monocytogenes rộng ứng dụng các vật liệu nano trong lĩnh (biodesign) nhỏ lên màng nitrocellulose v ự c đánh dấu sinh học và phát hiện các tác và rửa bằng TTBS. Tại vị trí ly giải VK nhân gây bệnh. Trong tương lai, phức hợp L. monocytogenes thấy xuất hiện vệt tròn hạt nano-kháng thể, tương tự như chất màu màu hồng (màu của phức hợp hạt nano huỳnh quang hữu cơ sử dụng trong EFLA vàng-kháng thể), còn tại vị trí ly giải VK đ ể làm tăng độ nhạy, có thể ứng dụng trong E. coli, không thấy màu (hình 4.B). Màu hồng phương pháp chẩn đoán phân tử miễn dịch 6 được nhìn thấy rõ ở nồng độ 10 cfu/ml và để thay thế các chất màu hữu cơ. 5 mờ hơn khi ở nồng độ 10 cfu/ml. Như vậy, phức hợp chấm lượng tử- KẾT LUẬN kháng thể (tự gắn) và sản phẩm thương Vi khuẩn L. monocytogenes sau khi mại hạt nano vàng-kháng thể có thể phát được ly giải bằng phương pháp hóa học hiện được VK L. monocytogenes ở nồng độ trên màng nitrocellulose được phát hiện 5 - 6 10 10 cfu/ml chỉ vài phút sau khi nhỏ bằng phức hợp kháng thể đơn dòng với hạt phức hợp hạt nano-kháng thể đơn dòng nano vàng hoặc phức hợp kháng thể đơn kháng L. monocytogenes. dòng với các chấm lượng tử. Các phương pháp Western blot (phát hiện L. monocytogenes ở nồng độ 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO cfu/ml [3]) và phương pháp ELFA (khoảng 4 5 1. Phạm Đức Minh, Vũ Xuân Nghĩa, Lê Thị phát hiện 10 - 10 cfu/ml [5]) đều sử dụng Hiên, Nguyễn Năng Định. Nghiên cứu ứng dụng phản ứng miễn dịch của kháng thể với kháng thể đơn dòng phát hiện VK Listeria kháng nguyên protein màng được phân monocytogenes. Tạp chí Y học Việt Nam. 2012, tách (Western blot) và tinh sạch (ELFA). tháng 8, số 1, tr.22-24. 30
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 2. Erdogan H.M, Cripps P.J, Morgan K.L. 5. Sewell A.M, Warburton D.W, Boville A, Optimization of a culture technique for the Daley E.F, Mullen K. The development of an isolation of Listeria monocytogenes from faecal efficient and rapid enzyme linked fluorescent samples. J Vet Med Infect Dis Vet Public Health. assay method for the detection of Listeria spp. from foods. Int J Food Microbiol. 2003, 81, 2002, 49 (10), pp.502-506. pp.123-129. 3. Levin R.E. Application of the polymerase 6. Cai W. Chen X. Nanoplatforms for targeted chain reaction for detection of Listeria monocytogenes molecular imaging in living subjects. Small. in foods: a review of methodology. Food Biotechnol. 2007, 3. pp.1840-1854. 2003, 17, pp.99-116. 7. Zrazhevskiy P, Sena M, Gao X. Designing 4. Karamonova L, Blazkova M, Fukal L, multifunctional quantum dots for bioimaging, detection and drug delivery. Chem Soc Rev. Rauch P, Greifov M, Horakova K, Tomaska M, 2010, 39. pp.4326-4354. Roubal P, Brett G. M, Wyatt G. M. Development of an ELISA specific for Listeria monocytogenes using a polyclonal antibody raised against a cell extract containing Internalin B. Food and Agricultural mmunology. 2003, 15, pp.167-182. Ngµy nhËn bµi: 18/10/2012 Ngµy giao ph¶n biÖn: 5/1/2013 Ngµy giao b¶n th¶o in: 6/2/2013 31
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 32