Ứng dụng pcr - ssp xác định tần suất bắt gặp các allen locus hla lớp I và lớp II ở quần thể người kinh Việt Nam

Nội dung text: Ứng dụng pcr - ssp xác định tần suất bắt gặp các allen locus hla lớp I và lớp II ở quần thể người kinh Việt Nam

1. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 ỨNG DỤNG PCR-SSP XÁC ĐỊNH TẦN SUẤT BẮT GẶP CÁC ALLEN LOCUS HLA LỚP I VÀ LỚP II Ở QUẦN THỂ NGƢỜI KINH VIỆT NAM Lê Xuân Hải* và CS TÓM TẮT Nghiên cứu người cho và người nhận (đều là người Kinh) làm xét nghiệm tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương từ tháng 1 - 2010 đến 11 - 2010. Định nhóm HLA-A, -B, -DRB1 từ 761 người và HLA-C, -DQB1 từ 185 người bằng kỹ thuật PCR-SSP (Polymerase Chain Reaction - Sequence-specific Primer), đánh giá tần suất bắt gặp allen tại các locus. Kết quả: các allen có tần suất gặp cao nhất là A*02(22.60), A*11(31.41), A*24(18.33), A*33(12.42), B*15(23.52), B*46(11.50), CW*01(18.65), CW*03(24.32), CW*07(18.92, CW*08(16.49), DRB1*09(11.17), DRB1*12(30.09), DRB1*15(10.97), DQB1*02(16.76), DQB1*03(45.95), DQB1*05(19.46), DQB1*06 (15.14). Dữ liệu phân tích HLA của chúng tôi cho thấy có sự tương đồng về các locus HLA và tần suất bắt gặp allen HLA với vùng Nam Trung Hoa và các nước lân cận trong vùng Đông Nam Á. Việc xác định tần suất phân bổ HLA của người Việt Nam giúp chúng ta có những thông tin định hướng để tiên lượng khả năng tìm kiếm người cho phù hợp HLA. * Từ khóa: HLA; Tần suất; PCR-SSP; Ng•êi ViÖt Nam. Applying PCR-SSP in identification of frequent alleles locus HLA typing I and II in Vietnamese summary HLA-A, -B, -DRB1 from 761 Kinh Vietnamese and HLA-C, -DQB1 from 185 Kinh Vietnamese were typed by PCR-SSP method and the frequency of loci were estimated. Result: The most frequent alleles were A*02(22.60), A*11(31.41), A*24(18.33), A*33(12.42), B*15(23.52), B*46(11.50), CW*01(18.65), CW*03(24.32), CW*07(18.92, CW*08(16.49), DRB1*09(11.17), DRB1*12(30.09), DRB1*15(10.97), DQB1*02(16.76), DQB1*03(45.95), DQB1*05(19.46), DQB1*06 (15.14), respectively. Our HLA typing data showed similarity between neighbor and related countries in Southeat Asia. Identifying HLA alleles helps to find suitable donors for patients in need of hematopoietic stem cell and organ transplantation. * Key words: HLA; Frequency; PCR-SSP, Vietnamese. ĐẶT VẤN ĐỀ nguyên bạch cầu người, hay còn gọi là các phức hợp kháng nguyên hòa hợp tổ chức Trong bộ gen người, gen kháng nguyên chính - Major Histocombility Complex, MHC) HLA (Human Leukocyte Antigen - Kháng là những locus gen có tính đa hình cao nhất. * Viện Huyết học - Truyền máu TW Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Hoàng Văn Lương PGS. TS. Trần Văn Khoa 1
2. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Các kháng nguyên này có trên bề mặt tế khoảng 100 người. Trong nghiên cứu này, bào lympho T và đóng vai trò rất quan trọng chúng tôi đưa ra những dữ liệu phân tích trong điều hòa hoạt động của hệ thống HLA bằng kỹ thuật sinh học phân tử ở mức miễn dịch. Nghiên cứu phân tử HLA liên độ phân giải 2 chữ số cho các allen HLA quan đến nhiều lĩnh vực như vai trò bảo vệ lớp I và HLA lớp II, xác định tần suất bắt cơ thể thông qua cơ chế nhận diện kháng gặp các allen HLA lớp I và lớp II ở cộng nguyên “của cơ thể” và kháng nguyên đồng người Kinh Việt Nam. “không thuộc cơ thể”, khả năng đậu ghép và thành công của ca ghép. Các phân tử ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP HLA là rào cản chính trong ghép. Trong NGHIÊN CỨU ghép tế bào gốc tạo máu, vai trò của HLA 1. Đối tƣợng nghiên cứu. ảnh hưởng rõ rệt trực tiếp đến kết quả cuộc ghép cả về thời gian sống của bệnh nhân 761 người Kinh đến làm xét nghiệm HLA (BN) và bệnh ghép chống chủ. Định nhóm tại Khoa Miễn dịch - Di truyền & Sinh học HLA là một công cụ quan trọng để xác định phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung tần suất bắt gặp allen. Tần suất bắt gặp ương từ 1 - 2010 đến 11 - 2012, trong đó, allen HLA khác nhau giữa các nhóm chủng 185 người làm HLA ghép tủy (ABCDRDQ) tộc, do vậy, 1 BN sẽ dễ dàng tìm được và 576 người làm HLA ghép thận (ABDR). người cho phù hợp HLA trong cùng nhóm 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. chủng tộc của mình [1]. Nghiên cứu của Jhonson và CS cho thấy 25% BN có cơ hội * Lấy mẫu: lấy máu ngoại vi (8 ml) từ tĩnh tìm được người cho phù hợp hoàn toàn mạch người cho hoặc BN đến làm xét nghiệm HLA hoặc người cho có 1 HLA không phù tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương. hợp từ những thành viên trong gia đình, * Định nhóm HLA: tách ADN cho định 65% BN có thể tìm được người cho không týp HLA từ máu ngoại vi bằng kít chuẩn cùng huyết thống phù hợp hoàn toàn HLA Qiagen Mini-Blood collection kit (Qiagen thông qua các chương trình tế bào gốc Inc., Valencia, CA, Mü) hoặc kít EZ High quốc gia và quốc tế [4]. Tuy nhiên, có DNA Extraction Kit (Texas BioGen Inc, khoảng 10% BN không tìm được người cho Texas, Mỹ). HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ được phù hợp HLA do những khác biệt về phân xác định tới 2 chữ số bằng phương pháp bố nửa nhánh HLA (HLA haplotype) và PCR-SSP (Polymerase Chain Reaction - phân bố allen HLA theo chủng tộc, những Sequence-specific Primer). Kít Morgan BN này không thể ghép được. Hiện nay, HLA ABDR, C và DQ SSP Typing (Texas nhiều trung tâm ghép đã ứng dụng phương BioGen Inc, Texas, Mỹ), Micro SSP Generic pháp định nhóm HLA bằng kỹ thuật ADN HLA Class I & II DNA ABDR, C và DQ cho phép phân tích HLA ở mức độ allen. Typing Tray (OneLambda Inc, CA, Mỹ) Với phương pháp này cho phép lựa chọn được dùng để nhân bản các đoạn gen của người cho phù hợp HLA ở mức allen và locus HLA-A, -B, -C, DRB1 và -DQB1 theo làm giảm nguy cơ GVHD và nguy cơ thải hướng dẫn của nhà sản xuất. Phân tách ghép, làm tăng thời gian sống cho BN. sản phẩm PCR bằng điện di trên gel Cho đến nay đã có một vài nghiên cứu agarose 2%. Tất cả các bản gel được đọc, công bố tần suất bắt gặp allen HLA ở nhóm ghi lại kết quả và kiểu hình xuất hiện băng người Kinh ở Bắc và Nam Việt Nam, nhưng dương tính phân tích bằng phần mềm đi số liệu thu thập còn nhỏ, mới hạn chế trong chuyên biệt cho từng loại kít. 2
3. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thu thập kết quả phân tích HLA lớp I và II của 761 người Kinh (Việt Nam). Với HLA-A, -B và -DRB1, phân tích được 761 người, với tổng số 761 x 2 = allen mỗi loại. Với HLA-C và HLA-DQB1, phân tích được 185 người, với tổng số 185 x 2 = 370 allen mỗi loại. Tần suất bắt gặp các allen lớp I (locus HLA-A, HLA-B và HLA-C) được trình bày trong bảng 1. Tổng số phát hiện 18 loại allen HLA-A, 28 loại allen HLA-B và 12 loại allen HLA-C trong quần thể người Kinh (Việt Nam). Với locus A, phát hiện được 18 loại allen HLA-A. Trong đó, A*11 và A*02 (31,41% và 22,6%) là những allen hay gặp nhất, sau đó là A*24 (18,33%) và A*33 (12,42%). Các allen ít gặp (tần suất < 5%) là A*29(4,6%), A*26 (2,56%), A*03 (1,38%), A*31 (0,85%), A*30 (0,79%), A*68 (0,79%), A*66 (0,53%), A*74 (0,39%), A*32 (0,26%), A*34 (0,26%) và A*69 (0,2%). Cũng bắt gặp một số allen rất hiếm trong quần thể người Kinh là A*23 và A*36 (0,07%). Đã có một số nghiên cứu về tần suất allen HLA ở quần thể người Kinh (Việt Nam). Với HLA-A, nghiên cứu của Phan Nguyễn Thanh Vân (n = 45) cho thấy allen A hay gặp nhất, lần lượt là A*11 (27,78%), A*24 (20%), A*02 (17,78%) và A*33 (8,89%) [7]; nghiên cứu của Nguyễn Trường Sơn (n = 86) cho thấy thứ tự các allen HLA-A hay gặp nhất, lần lượt là A*11 (31,39%), A*24 (21,51%), A*02 (18,02%) [6]. Nghiên cứu của chúng tôi (n = 761) thấy trong locus HLA-A, A*11, A*02, A*24 và A*33 là những allen hay gặp nhất. Như vậy, có sự tương đồng về kết quả giữa các nhóm nghiên cứu khác nhau. Bảng 1: Tần suất bắt gặp các allen HLA lớp I ở người Kinh (Việt Nam). TẦN SUẤT TẦN SUẤT TẦN SUẤT n ALLEN n ALLEN n (%) (%) (%) A*01 38 2,50 B*07 107 7,03 CW*01 69 18,65 A*02 344 22,60 B*08 6 0,39 CW*02 1 0,27 A*03 21 1,38 B*13 81 5,32 CW*03 90 24,32 A*11 478 31,41 B*14 3 0,20 CW*04 35 9,46 A*23 1 0,07 B*15 358 23,52 CW*05 2 0,54 A*24 279 18,33 B*18 22 1,45 CW*06 8 2,16 A*26 39 2,56 B*27 39 2,56 CW*07 70 18,92 A*29 70 4,60 B*28 1 0,07 CW*08 61 16,49 A*30 12 0,79 B*35 70 4,60 CW*10 1 0,27 A*31 13 0,85 B*37 8 0,53 CW*12 12 3,24 A*32 4 0,26 B*38 97 6,37 CW*14 4 1,08 A*33 189 12,42 B*39 37 2,43 CW*15 17 4,59 3
4. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) A*34 4 0,26 B*40 106 6,96 A*36 1 0,07 B*41 3 0,20 A*66 8 0,53 B*44 63 4,14 A*68 12 0,79 B*46 175 11,50 A*69 3 0,20 B*47 1 0,07 A*74 6 0,39 B*48 18 1,18 B*50 1 0,07 B*51 60 3,94 B*52 12 0,79 B*53 3 0,20 B*54 45 2,96 B*55 33 2,17 B*56 27 1,77 B*57 33 2,17 B*58 111 7,29 B*73 2 0,13 18 allen 1.522 100% 28 allen 1.522 100% 12 allen 370 100% Với locus B, phát hiện được 28 loại gặp nhất là B*28 (0,07%), B*47 (0,07%), allen HLA-B. Trong đó, B*15 và B*46 B*50 (0,07%), B*73(0.,3%), B*53(0,2%), (23,52% và 11,5%) là những allen hay gặp B*41 (0,2%), B*14 (0,2%). nhất, tần suất bắt gặp lớn hơn nhiều so với Với locus HLA-C, phát hiện được 12 loại các allen có tần suất bắt gặp nhiều tiếp allen ở người Kinh (Việt Nam). Trong đó, theo là B*58, B*07, B*40 và B*38 (7,29%, 4 loại allen hay gặp nhất lần lượt là 7,03%, 6,96%, và 6,37%). Các allen B*28, Cw*03(24.32%), Cw*07(18.92%), Cw*01(18.65%), B*47, B*50 cũng rất hiếm gặp trong quần Cw*08(16.49%). Có 2 allen rất hiếm, chỉ thể người Kinh (Việt Nam) với tần suất bắt phát hiện được 1 trong tổng số 370 allen, gặp là 0,7% (1 trong 1.522). Kết quả của chiếm 0,27% là Cw*02 và Cw*10. Trong chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của nghiên cứu của Bạch Khánh Hòa (n = 170), Bạch Khánh Hòa (hay gặp nhất là B*15, allen hay gặp nhất là Cw*01 và Cw*07. B*46) [2], nhưng khác với nghiên cứu của Tần suất bắt gặp các allen lớp II (locus Nguyễn Trường Sơn (hay gặp nhất là HLA-DRB1 và HLA-DQB1) được trình bày B*15, sau đó là B*07) [6]. Các allen B hiếm trong bảng 2. Tổng số đã phát hiện 13 loại 4
5. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 allen HLA-DRB1 và 6 loại allen HLA-DQB1 trong quần thể người Kinh (Việt Nam). Bảng 2: Tần suất bắt gặp các allen HLA lớp II ở người Kinh Việt Nam. n (%) n (%) DRB1*01 7 0,46 DQB1*02 62 16,76 DRB1*03 102 6,70 DQB1*03 170 45,95 DRB1*04 114 7,49 DQB1*04 9 2,43 DRB1*07 96 6,31 DQB1*05 72 19,46 DRB1*08 87 5,72 DQB1*06 56 15,14 DRB1*09 170 11,17 DQB1*08 1 0,27 DRB1*10 76 4,99 DRB1*11 45 2,96 DRB1*12 458 30,09 DRB1*13 88 5,78 DRB1*14 81 5,32 DRB1*15 167 10,97 DRB1*16 31 2,04 13 allen 1522 100% 6 allen 370 100% Với kiểu hình HLA-DRB1, chúng tôi xác DQB1*07, hai kiểu hình DQB1*04 và định được 13 kiểu hình allen khác nhau. DQB1*08 cũng rất hiếm gặp trong quần thể Các kiểu hình allen HLA-DRB1 hay gặp nhất người Kinh miền Bắc Việt Nam (tần suất là DRB1*12 (30,09%), DRB1*09 (11,17%) bắt gặp tương ứng là 2,43% và 0,27%). và DRB1*15 (10,97%). Các allen DRB1*01, A*11, A*24, A*33, A*02, B*15, B*46 đều DRB1*16 và DRB1*11 là những allen HLA- là những allen hay gặp ở quần thể người DRB1 bắt gặp với tỷ lệ thấp nhất. Kết quả châu Á, đặc biệt là ở miền Nam Trung Hoa, này khá phù hợp với nghiên cứu của Phan Hồng Kông, Đài Loan [3] và Thái Lan [5]. Nguyễn Thanh Vân và Nguyễn Trường Sơn. Như vậy, có thể nói phân bổ HLA ở người Với kiểu hình HLA-DQB1, chúng tôi xác Kinh (Việt Nam) có nhiều nét tương đồng định được 6 kiểu hình allen khác nhau là với các nước láng giềng. Việc xác định DQB1*02, DQB1*03, DQB1*04, DQB1*05, nhóm HLA giúp tìm ra người cho phù hợp DQB1*06 và DQB1*08. Tần suất bắt gặp cho BN cần ghép tế bào gốc tạo máu. Việc cao nhất là DQB1*03 (45,95%) sau đó là kết nối và trao đổi thông tin với chương DQB1*05 (19,46%), DQB1*02 (16,76%) và trình đăng ký và quản lý quốc tế sẽ rất có DQB1*06 (15,14%). Kết quả này phù hợp giá trị trong việc tìm kiếm nguồn tế bào gốc với nghiên cứu của Nguyễn Trường Sơn. tạo máu phù hợp. Nghiên cứu về tần suất Chúng tôi cũng thấy trong 185 người được cho thấy phân bố allen HLA có thể khác khảo sát, không có ai mang kiểu hình allen nhau giữa các chủng tộc và quần thể dân 5
6. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 tộc khác nhau. Đây là một vấn đề cần lưu TÀI LIỆU THAM KHẢO ý khi làm chương trình đăng ký tế bào 1. Nguyễn Trường Sơn, Trần Văn Bảo, gốc tạo máu từ những người không cùng Phạm Thị Hồng Ngọc, Huỳnh Thị Thanh Hà và huyết thống. CS. Áp dụng phương pháp PCR-SSO để xác định kháng nguyên bạch cầu ở người (HLA) tại KẾT LUẬN Bệnh viện Chợ Rẫy. Y học Việt Nam. 2012, (396), tr. 354-358. Qua phân tích HLA-A, -B, -DRB1 từ 761 2. Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn trường hợp người Kinh (Việt Nam) bằng B ỉnh . Kỹ thuật xác định HLA bằng phương pháp kỹ thuật PCR-SSP, chúng tôi thu được kết PCR-SSP tại Bệnh viện Huyết học -Truyền máu. quả sau: Y học Việt Nam. 2008, (344), tr.815-820. Đã xác định được 18 họ allen HLA-A, 28 3. Ghashghaie A, Alimoghaddam K, Ostadali họ allen HLA-B, 12 họ allen HLA-C, 13 họ MR, et al. Allele frequencies of HLA class-I loci in the normal Iranian population. IJHOSCR. allen HLA-DRB1 và 06 họ allen HLA-DQB1. 2009, Vol 3, No 2. Trong đó, các allen HLA hay gặp ở quần thể người Kinh (Việt Nam) là: 4. Hoa BK. HLA-A, -B, -C, -DRB1 and -DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population in - HLA-A: có A*11, A*02, A*24, A*33. Viet Nam. 2008. - B*15, B*46, B*58, B*07. 5. Hu SP, Luan JA, Li B, Chen JX, Cai KL, Huang LQ, Xu XY. Genetic link between - Cw*03, Cw*07, Cw*01. Chaoshan and other other Chinese Han - DRB1*12, DRB1*09, DRB1*15. populations: Evidence from HLA-A and HLA-B allele frequency distribution. Am J Phys - DQB1*03, DQB1*05. Anthropol. 2007, 132 (1), pp.140-150. Xác định được sự tồn tại một số allen rất 6. Jhonson HA, Hurley CK, et al. Human hiếm gặp ở người Kinh (Việt Nam) là: leukocyte antigen: The major histocompatibility - HLA-A: A*30, A*31, A*32, A*34, A*66, complex of man. In JB Henry editor. Clinical A*68, A*69 và A*74. Diagnosis and Management by Laboratory Methods. New York: Saunders. 2001, pp.927-948. - HLA-B: B*14, B*28, B*41, B*47, B*50, 7. Kupatawintu P, Pheancharoen S, B*53, và B*73. Srisuddee A, Tanaka H, Tadokoro K, Nathalang - HLA-C: Cw*02, Cw*10. O. HLA-A, -B, -DR haplotype frequencies in the Thai stem cell donor registry. Tissue Antigen. - HLA-DRB1. 2010, Jun, 75 (6), pp.730-736. - HLA-DQB1: DQB1*04, DQB1*08. Có sự tương đồng về phân bổ HLA của người Kinh (Việt Nam) với các nước xung Ngày nhận bài: 1/11/2012 quanh. Ngày giao phản biện: 30/11/2012 Ngày giao bản thảo in: 28/12/2012 6
7. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 7