Ứng dụng pcr - rflp xác định genotype của virut sởi phân lập được ở một số tỉnh miền bắc Việt Nam (2006 - 2013)

Nội dung text: Ứng dụng pcr - rflp xác định genotype của virut sởi phân lập được ở một số tỉnh miền bắc Việt Nam (2006 - 2013)

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ỨNG DỤNG PCR-RFLP XÁC ĐỊNH GENOTYPE CỦA VIRUT SỞI PHÂN LẬP ĐƢỢC Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM (2006 - 2013) Nguyễn Thái Sơn*; Nguyễn Thị Hồng Ngọc** Nguyễn Thị Kim Loan*; Diêm Đăng Thanh*** TÓM TẮT Trong những năm gần đây, mặc dù vắxin sởi đã được đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng, bệnh sởi vẫn bùng phát và diễn biến phức tạp ở một số địa phương. Ngoài lý do tiêm chủng không đầy đủ thì có hay không những thay đổi trong genotype các chủng virut sởi mới lưu hành ở Việt Nam?. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu: xác định genotype virut sởi hiện đang lưu hành ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam bằng phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự gen. Kết quả cho thấy 46 chủng virut sởi hoang dại khi phân tích genotype bằng RFLP và giải trình tự gen đều thuộc genotype H1 và có một số thay đổi ở một vài vị trí nucleotid so với chủng đối chứng H1 (Genbank: JF824649). * Từ khóa: Virut sởi; Genotype; PCR- RFLP; Giải trình tự gen. APPLICATION OF PCR-RFLP IN IDENTIFYING GENOTYPE OF MEASLES VIRUS IN NORTHERN OF VIETNAM SUMMARY In recent years, there has been routine measles vaccination for children, but measles still breaks out and develops complicatedly in some regions. Apart from reasons of not being fully immunized, we need to answer the question whether or not the changes in the new genotype of measles virus strains circulating in Vietnam. This study aims at identifying circulating meales genotype in some Northern provinces of Vietnam by using PCR-RFLP and sequencing method. The results showed that all of 46 strains of wild-type measles virus isolated belong to genotype H1 and also have some nucleotides changing to compare with H1 control (Genbank: JF824649). * Key words: Measles virus; Genotype; PCR-RFLP; Sequencing. ĐẶT VẤN ĐỀ (WHO), tình trạng tử vong do bệnh sởi đã Sởi là một bệnh nhiễm trùng đường hô giảm 78% và vắcxin đã cứu sống 4,3 triệu hấp do virut sởi gây ra, thường gặp ở trẻ em. người trong thập kỷ qua. Tuy nhiên, số liệu Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới công bố của WHO cho thấy trung bình * Bệnh viện Quân y 103 ** Trường Cao đẳng Y tế Hà Nội *** Bệnh viện Quân y 110 Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thái Sơn (ntson65@yahoo.com) Ngày nhận bài: 09/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/09/2014 Ngày bài báo được đăng: 25/09/2014 42
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 330 người chết mỗi ngày, 14 trẻ chết mỗi này với mục tiêu: Xác định genotype virut sởi giờ vì căn bệnh này hiện vẫn là quá lớn hiện đang lưu hành ở một số tỉnh miền Bắc đối với một bệnh hoàn toàn có thể phòng Việt Nam bằng phương pháp PCR-RFLP. ngừa được [8]. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP Tại Việt Nam, trong những năm gần NGHIÊN CỨU đây dịch bệnh lại bùng phát với diễn biến 1. Đối tƣợng nghiên cứu. phức tạp hơn, bệnh gặp cả ở người lớn (18 - 40 tuổi), tản phát và khó khống chế, - Các chủng virut sởi được phân lập từ riêng từ cuối năm 2013 đến hết quý I - 2014 ba loại vắcxin sống giảm độc lực gồm: đã ghi nhận trên 5.000 trường hợp nghi 6675/Rouvax Aventis Pasteur (Pháp); AIK-C bệnh sởi [1]. Trước tình hình đó, ngoài Vero và MMR (Mỹ) thuộc genotype nhánh A. việc tiêm phòng vắcxin, vấn đề đặt ra là Các chủng này dùng như chủng chuẩn trong phải nhanh chóng xác định được chính xác nghiên cứu genotype virut sởi. Ngoài ra, các genotype của chủng virut sởi đang lưu nghiên cứu này còn dùng chủng virut sởi hành tại nhiều vùng lãnh thổ của quốc gia, H1 là MVi/Hanam.VNM/6.09/9 (Genbank: nhằm phục vụ cho công tác giám sát dịch JF824649) làm chủng đối chứng để so sánh tễ học. Đây cũng là chiến lược chung của và phân tích với chủng phân lập (hoang WHO trong mục tiêu thanh toán bệnh sởi dại) trong nghiên cứu. trên toàn cầu dựa vào việc hoàn thiện - 46 chủng virut sởi thu được từ một số bản đồ phân bố genotype của virut sởi vụ dịch sởi từ 2006 - 2013 tại một số tỉnh hiện đang lưu hành ở vùng địa lý dân cư miền Bắc Việt Nam đang lưu giữ tại Khoa trên tất cả các châu lục [9]. Virut, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Để xác định genotype của virut sởi, hiện sử dụng để nghiên cứu genotype. nay có nhiều phương pháp như: phương 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. pháp giải trình tự gen (sequencing), phương Phát hiện genotype virut sởi trên các pháp realtime-PCR. phương pháp PCR- chủng thu thập bằng kỹ thuật PCR-RFLP RFLP [6, 9]. Mỗi phương pháp đều có và giải trình tự gen. Các chủng virut sau những ưu nhược điểm riêng. Trong đó, khi tách chiết ARN được khuếch đại đoạn phương pháp PCR-RFLP sử dụng enzyme gen N đặc hiệu tạo sản phẩm ADN có kích giới hạn cắt trình tự đã biết của sản phẩm thước 660 bp bằng phản ứng RT-PCR, PCR nhân đoạn gen của virut sởi, qua đó sau đó tiến hành chạy nested PCR và giải xác định kiểu gen của virut sởi thông qua trình tự gen [4, 5]. phân tích tính đa hình các đoạn giới hạn. Sản phẩm nested PCR kích thước 492 Đây là một phương pháp đơn giản, dễ bp được cắt bằng 3 loại enzyme giới hạn thực hiện, không đòi hỏi những trang thiết MboI, HaeIII, ScrFI, kiểm tra kết quả trên bị đắt tiền, do đó đáp ứng được yêu cầu về gel agarose 3% cùng với thang ADN chuẩn, mặt giá thành và cũng rút ngắn thời gian, so sánh giữa các chủng nghiên cứu với phù hợp với nghiên cứu dịch tễ. Chính vì chủng đối chứng, rút ra kết luận về genotype. những lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài 43
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 Các trình tự cặp mồi đặc hiệu cho virut Tiến hành giải trình tự sản phẩm RT- sởi được dùng trong nghiên cứu gồm [4]: PCR kích thước 660 bp của chủng virut - Cặp mồi cho phản ứng RT-PCR: sởi trên máy giải trình tự ABI avant 3100, MN5: 5’ - GCC ATG GGA GTA GGA GTG xử lý kết quả bằng phần mềm BioEdit GAA C - 3’ và MN6: 5’ - CTG GCG GCT và MEGA 4.0 [4, 5], so sánh với trình GTG TGG ACC TG - 3’. tự chủng chuẩn trên Genbank để kiểm - Cặp mồi cho phản ứng nested PCR: chứng kết quả PCR-RFLP, lập cây phát Nf1: 5’- GAT GGT AAG GAG GTC AGC sinh chủng loại và tìm hiểu tỷ lệ sai khác TGG - 3’ và Nr7: 5’ - TCG GCC TCT CGC so với chủng đối chứng H1 (Genbank: ACC TA - 3’. JF824649). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả PCR nhân đoạn gen đặc hiệu N của virut sởi. Bảng 1: Kết quả khuếch đại các đoạn gen đặc hiệu của virut sởi. RT-PCR Nested PCR Chñng nghiªn cøu n Số (+) (660bp) Số (-) Số (+) (492bp) Số (-) Chủng vắcxin 3 3 0 3 0 Chủng đối chứng 1 1 0 1 0 Hà Nội 14 14 0 14 0 Điện Biên 1 1 0 1 0 Lào Cai 4 4 0 4 0 Lai Châu 5 5 0 5 0 Thái Nguyên 2 2 0 2 0 Bắc Giang 4 4 0 4 0 Hải Dương 3 3 0 3 0 Thái Bình 1 1 0 1 0 Hòa Bình 1 1 0 1 0 Ninh Bình 4 4 0 4 0 Thanh Hóa 3 3 0 3 0 Nghệ An 4 4 0 4 0 Tổng 50 50 0 50 0 Trong 46 chủng virut hoang dại thu thập trong giai đoạn 2006 - 2013, 3 chủng sởi vắcxin và 1 chủng sởi đối chứng H1_ Genbank khi nhân gen bằng RT-PCR và nested PCR đều có kết quả dương tính và cho các band ADN đặc với kích thước tương ứng 660 bp và 492 bp. 44
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 2. Kết quả xác định genotype virut sởi bằng kỹ thuật RFLP. * Kết quả cắt bằng enzyme giới hạn đối với chủng chuẩn và chủng đối chứng trong nghiên cứu: ScrFI Trình tự chủng chuẩn 240 A_Edmonston-wt/54 231 21 H1_Hunan.CHN/93/7 151 135 80 53 52 21 Trình tự thực nghiệm 146 H1_Genbank: JF824649 115 77 53 52 23 21 5 Hình 1: Kết quả RFLP các chủng virut sởi cắt với ScrFI. (M: Marker ɸX174 - HaeIII; 1: Chủng vắcxin MMR; 2: H1_Genbank:JF824649; 3: Chủng vắcxin 6675/Rouvax; 4: Chủng sởi VN). - Kết quả phân tích các chủng vắcxin bằng enzyme ScrFI cho band ADN có kích thước khoảng 240, 231 và 21 bp, kết quả này phù hợp tính toán lý thuyết. - Kết quả phân tích chủng H1_Genbank: JF824649 bằng enzyme ScrFI cho các band ADN với kích thước khoảng 146, 115, 77, 53, 52 bp phù hợp với tính toán lý thuyết. HaeIII Trình tự chủng chuẩn 264 A_Edmonston-wt/54 228 H1_Hunan.CHN/93/7 228 203 61 Trình tự thực nghiệm 242 H1_Genbank: JF824649 223 26 Hình 2: Kết quả RFLP các chủng virut sởi cắt với HaeIII (M: Marker pBR_MspI; 1: Chủng vắcxin AIK; 2: Chủng vắcxin MMR; 3: Chủng vắcxin 6675/Rouvax; 4-17: Chủng sởi VN; 18: Chủng H1_Genbank: JF824649). 45
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 - Khi phân tích các chủng vắcxin bằng enzyme HaeIII có vạch ADN với kích thước khoảng 264 và 228 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết. - Phân tích chủng đối chứng H1_Genbank: JF824649 bằng enzyme HaeIII cũng cho các vạch ADN với kích thước khoảng 242 và 223 bp phù hợp với tính toán lý thuyết. * Kết quả xác định genotype của 46 chủng virut phân lập được: Hình 3: Kết quả RFLP chủng virut sởi cắt với enzyme MboI và HaeIII. (M: Marker ɸX174 - HaeIII; 1, 4-7: Chủng virut sởi VN; 2, 9: Chủng virut H1; 3: Chủng vắcxin cắt với MboI; 8, 11-14: Chủng virut sởi VN; 10: Chủng vắcxin cắt với HaeIII). Các đoạn ADN của chủng virut sởi hoang dại phân lập tại một số địa phương ở miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2006 - 2013 khi phân tích với enzyme MboI có kích thước khoảng 242, 155, 55 bp, phân tích với HaeIII cũng cho 02 vạch ADN có kích thước khoảng 242 và 223 bp, tương tự với chủng đối chứng H1_Genbank: JF824649. Hình 4: Kết quả RFLP chủng virut sởi cắt với enzyme ScrFI. (M: Marker ɸX174 - HaeIII; 1, 4 - 7: Chủng virut sởi VN; 2: Chủng H1_Genbank: JF824649; 3: Chủng vắcxin cắt với ScrFI). Khi phân tích các chủng virut sởi hoang dại với enzyme ScrFI đều cho band ADN có kích thước khoảng 146, 115, 77, 53, 52 bp, tương tự như khi phân tích chủng đối chứng H1_Genbank: JF824649. 46
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 Bảng 2: Kết quả xác định genotype các chủng virut sởi bằng phương pháp PCR-RFLP. ®Þa ph•¬ng n Genotýp H1 Genotýp kh¸c Hà Nội 14 14 0 Điện Biên 1 1 0 Lào Cai 4 4 0 Lai Châu 5 5 0 Thái Nguyên 2 2 0 Bắc Giang 4 4 0 Hải Dương 3 3 0 Thái Bình 1 1 0 Hòa Bình 1 1 0 Ninh Bình 4 4 0 Thanh Hóa 3 3 0 Nghệ An 4 4 0 Tổng 46 46 0 46 chủng virut sởi hoang dại phân lập tại Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc genotype H1. 3. Kết quả xác định genotýp virut sởi bằng phân tích trình tự. Để khẳng định kết quả của PCR-RFLP, chúng tôi tiến hành đồng thời với giải trình tự chủng virut sởi. Hình 5: Kết quả giải trình tự một số chủng virut sởi trong nghiên cứu. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc hiệu các chủng virut sởi hoang dại trong nghiên cứu cho thấy trình tự nucleotid giữa các chủng có độ tương đồng cao, nhưng có một số thay đổi ở một vài vị trí nucleotid so với chủng đối chứng H1 (Genbank: JF824649). 47
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 Trình tự các chủng virut sởi trong nghiên BÀN LUẬN cứu được xử lý và phân tích bằng phần Trong nghiên cứu này chúng tôi xác định mềm BioEdit và MEGA 4.0 cho kết quả cây genotype một số chủng virut sởi bằng kỹ phát sinh chủng loại như sau: thuật PCR-RFLP dựa trên nghiên cứu của Lê Thị Kim Tuyến và CS [2]. Sự đa hình các đoạn giới hạn khi phân tích đoạn cuối gen N của virut sởi bằng enzyme MboI, ScrFI và HaeIII cho phép nhận định các chủng virut hoang dại từ năm 2006 - 2013 trong nghiên cứu đều thuộc genotype H1. Kết quả này tương tự nghiên cứu của Nguyễn Hạnh Phúc [3] khi phân tích 10 chủng virut sởi thu thập trong năm 2006 - 2008 tại một số tỉnh miền Bắc đều thuộc genotype H1, trong khi các nghiên cứu trước năm 2005 cho thấy có cả genotype H1 và H2 [7]. Kết quả giải trình tự kiểm chứng đoạn gen N đặc hiệu của virut sởi cũng cho thấy toàn bộ chủng nghiên cứu được phân tích bằng PCR-RFLP đều thuộc genotype H1. Như vậy, genotype H1 đã thay thế genotype H2 trong những năm gần đây. Ngoài ra, khi phân tích chủng đối chứng H1_JF824649 và chủng hoang dại với enzyme MboI và HaeIII cho một số vạch ADN có kích thước khác biệt so với chủng chuẩn. Như vậy, có vài thay đổi về vị trí Hình 6: Cây phát sinh chủng loại một số nhận biết các enzyme này trên trình tự gen chủng virut sởi miền Bắc Việt Nam. giữa các chủng ở Việt Nam so với chủng chuẩn. Sự thay đổi này có thể là một trong Cây phát sinh chủng loại trên cho thấy những nguyên nhân dẫn đến tình trạng các chủng virut sởi phân lập tại một số tỉnh nặng và diễn biến bất thường của dịch sởi khu vực miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn trong thời gian gần đây. Điều này cần tiếp 2006 - 2013 đều thuộc genotype H1. tục nghiên cứu ở quy mô toàn quốc về kiểu Như vậy, kết quả xác định genotype bằng gen các chủng virut sởi lưu hành, đồng thời giải trình tự phù hợp với kết quả phân tích đánh giá đáp ứng miễn dịch giữa chủng lưu genotype bằng PCR-RFLP. hành và chủng vắcxin nhằm góp phần kiểm soát bệnh sởi ở Việt Nam tốt hơn trong tương lai. 48
8. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 Kết quả thu nhận từ thực nghiệm của đề sởi lưu hành trong các vụ dịch sởi năm 2006 - tài phù hợp với đánh giá chung về những 2008 ở miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Y học Dự ưu điểm của kỹ thuật RFLP. Kỹ thuật này có phòng. 2009, số 5 (104), tr.50-56 thể phát hiện một số thay đổi trong trình tự 4. Julia R. Kessler, Jacques R. Kremer, nucleotid liên quan đến vị trí nhận biết của Sergey V. Shulga, Nina T. Tikhonova, Sabine enzyme giới hạn, không đòi hỏi nhiều trang Santibanez, Annette Mankertz, Galina V. Semeiko, Elena O. Samoilovich, Jean-Jacques Muyembe thiết bị đắt tiền, quy trình thực hiện đơn giản, Tamfum, Elisabeth Pukuta, and Claude P. Muller. có khả năng tiến hành phân tích đồng thời Revealing new measles virus transmission routes với số lượng mẫu lớn, thời gian cho kết quả by use of sequence analysis of phosphoprotein nhanh, phù hợp với yêu cầu của dịch tễ học and hemagglutinin genes. Journal of Clinical phân tử trong việc sàng lọc và xác định Microbiology. 2011, Feb, Vol 49, No 2, pp.677-683. nhanh chóng căn nguyên gây dịch cũng 5. Jacques R. Kremer, Giang H. Nguyen, như genotype của vi sinh vật gây bệnh. Sergey V. Shulga, Phuc H. Nguyen et al. KẾT LUẬN Genotyping of recent measles virus strains from Russia and Vietnam by nucleotide - specific - Các chủng virut sởi phân lập được tại multiplex PCR. Journal of Medical Virology. một số tỉnh miền Bắc Việt Nam trong giai 2007, 79, pp.987-994. đoạn 2006 - 2013 thuộc genotype H1. 6. William J. Bellini and Paul A. Rota. - PCR-RFLP có giá trị trong xác định Genetic diversity of wild-type measles viruses: genotype virut sởi. Implications for global measles elimination programs. Emerging Infectious Diseases. 1998, TÀI LIỆU THAM KHẢO Vol 4, No 1, pp.29-35. 1. Bộ Y tế. Công điện khẩn số 1696/CĐ-BYT 7. Stephanie L. Liffick, Nguyen Thi Thuong, ngày 5/4/2014 về tăng cường phòng chống bệnh Wenbo Xu, Yeqiang Li, Huynh Phoung Lien, sởi và kế hoạch tiêm vắcxin phòng bệnh sởi của William J. Bellini, Paul A. Rota. Genetic Cục Y tế Dự phòng. 2014. characterization of contemporary wild-type 2. Lê Thị Kim Tuyến và CS. Nghiên cứu đặc measles viruses from Vietnam and the People’s điểm di truyền một số chủng sởi đang lưu hành Republic of China: Identification of two genotypes ở Việt Nam bằng phương pháp RFLP (đa dạng within clade H. Virus Research. 2001, 77, pp.81-87. độ dài đoạn cắt giới hạn). Đề tài cấp bộ năm. Bộ 8. WHO (Fact sheet N°286). Measles, Y tế, nghiệm thu 2005. 2005. who.int/mediacentre/factsheets/fs286/en/ 3. Nguyễn Hạnh Phúc, Nguyễn Hiền Thanh, Updated February 2014. Nguyễn Thị Thu Thủy và CS. Genotype H1 virut 9. WHO. Measles and rubella Laboratory Network. Genava Switzerland. 2013, June. 49