Ứng dụng kỹ thuật realtime pcr để phát hiện đột biến - 455g/a trên gen fibrinogen beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim trẻ tuổi

Nội dung text: Ứng dụng kỹ thuật realtime pcr để phát hiện đột biến - 455g/a trên gen fibrinogen beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim trẻ tuổi

1. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN - 455G/A TRÊN GEN FIBRINOGEN BETA Ở BỆNH NHÂN NHỒI MÁU CƠ TIM TRẺ TUỔI Lương Thị Lan Anh, Trương Thị Thanh Hương Trường Đại học Y Hà Nội Ngày nay, các trường hợp nhồi máu cơ tim trẻ tuổi có tính gia đình, không rõ các nguy cơ môi trường gây bệnh, có thể liên quan đến đột biến gen, trong đó hay gặp đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta (FGB) quy định tổng hợp chuỗi fibrinogen. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR, có so sánh với giải trình tự gen để phát hiện đột biến -455G/A ở 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp < 60 tuổi được chẩn đoán xác định nhồi máu cơ tim cấp tại Viện Tim mạch Việt Nam. Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen Beta là 25%. Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57% và 16,67%, các kết quả phù hợp với giải trình tự gen. Nghiên cứu đã ứng dụng thành công kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến - 455G/A trên gen Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp trẻ tuổi. Từ khoá: Nhồi máu cơ tim cấp, gen FGB, đột biến - 455G/A I. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo các nghiên cứu, đa phần người cao tuổi mắc phải căn bệnh này, tuy nhiên nhiều Nhồi máu cơ tim được xếp thứ nhất trong trường hợp nhồi máu cơ tim xuất hiện ở số 7 nhóm bệnh gây tử vong hàng đầu trên người < 60 tuổi và thậm chí ở lứa tuổi trẻ hơn, thế giới. Ước tính ở Hoa Kỳ có khoảng 1 triệu < 30 tuổi, một số dẫn đến tử vong. Các nghiên bệnh nhân nhập viện mỗi năm vì nhồi máu cơ cứu gần đây trên thế giới đề cập đến mối liên tim cấp và khoảng 200.000 đến 300.000 bệnh quan giữa nhồi máu cơ tim với biến đổi vật nhân tử vong hàng năm vì nhồi máu cơ tim chất di truyền ở cấp phân tử. Các nghiên cứu cấp [1]. Tại Việt Nam, nhồi máu cơ tim cấp cho rằng các trường hợp nhồi máu cơ tim trẻ đang có xu hướng gia tăng trong những năm tuổi hoặc có tính gia đình, không rõ các nguy gần đây, tỷ lệ tử vong vẫn còn cao và đang là cơ môi trường gây bệnh, có thể liên quan đến vấn đề thời sự rất được quan tâm. Năm 2003, đột biến gen, trong đó hay gặp đột biến theo thống kê của Viện Tim mạch Quốc gia - 455G/A của gen Fibrinogen Beta quy định Việt Nam, tỷ lệ bệnh nhân vào viện vì nhồi tổng hợp chuỗi fibrinogen β [4 - 7]. Fibrinogen máu cơ tim cấp là 4,2%, đến năm 2007 con số là 1 protein được cấu tạo bởi 3 chuỗi polypep- này là 9,1%. Ở Bệnh viện Chợ Rẫy, năm 2010 tide (chuỗi α, β và γ), tham gia quá trình đông có tới 7.421 trường hợp nhập viện vì đau thắt máu và đóng một vai trò quan trọng trong quá ngực, 1.538 ca phải nhập viện và điều trị vì trình hình thành huyết khối. Đột biến -455G/A hội chứng vành cấp, 267 trường hợp tử vong trên gen có thể gây tác động mạnh nhất lên [2; 3]. tốc độ tổng hợp của toàn phân tử fibrinogen, từ đó làm tăng nguy cơ nhồi máu cơ tim [8]. Địa chỉ liên hệ: Lương Thị Lan Anh, Bộ môn Y sinh học Di Để phát hiện đột biến điểm -455G/A trên truyền, Trường Đại học Y Hà Nội gen Fibrinogen Beta, phương pháp sinh học Email: lanhluong@gmail.com Ngày nhận: 16/12/2016 phân tử thường được nghĩ tới đầu tiên là giải Ngày được chấp thuận: 26/2/2017 trình tự gen, nhưng không phải cơ sở nghiên TCNCYH 106 (1) - 2017 17
2. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC cứu và ứng dụng nào cũng có thể làm được được chẩn đoán xác định nhồi máu cơ tim cấp bởi yêu cầu phải có hệ thống giải trình tự gen tại Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai. và chi phí tiêu hao cho giải trình tự gen khá - Thời gian: từ tháng 1/2013 đến tháng tốn kém. Realtime PCR là kỹ thuật khuếch đại 1/2016. gen, có nhiều ưu điểm so với PCR truyền - Địa điểm: Bộ môn Y sinh học - Di truyền, thống, được ứng dụng ngày càng rộng rãi Đại học Y Hà Nội. trong di truyền học, công nghệ sinh học cũng 2. Phương pháp: nghiên cứu mô tả. như nhiều lĩnh vực khác. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay, chúng tôi chưa thấy tác giả nào Quy trình nghiên cứu nghiên cứu và ứng dụng kĩ thuật này trong - Lấy 2ml máu tĩnh mạch ngoại vi và chiết việc phát hiện đột biến -455G/A nhằm góp tách DNA tổng số. DNA được kiểm tra độ tinh phần tầm soát sớm bệnh nhồi máu cơ tim. sạch và hàm lượng bằng máy đo quang phổ Nghiên cứu được thực hiện nhằm: xác định Nano - Drop 2000. đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta - Thực hiện kỹ thuật Realtime PCR phát bằng kỹ thuật Realtime PCR. hiện đột biến -455G/A. Gen Fibrinogen Beta II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP được thiết kế nhân lên bằng kỹ thuật PCR trên vùng promoter tại vị trí nucleotide xác định 1. Đối tượng theo ngân hàng trình tự gen Quốc tế - 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp < 60 tuổi (GenBank, M 64983.1). Bảng 1. Primer - Probe phát hiện gen FGB Mồi – Đoạn dò Trình tự 5’ - 3’ Sản phẩm (bp) F -AATAACTTCCCATCATTTTGTCCAATTC Mồi (FGBf3m- FGBr4m) 730 R -AGTCGTTGACACCTTGGGACTTAACTTG FGB1m (phát hiện gen không đột biến) Đoạn dò FGB2m (phát hiện gen đột biến) * FGBr4m: Mồi ngược (Fibrinogen Beta reverse); FGBf3m: mồi xuôi (Fibrinogen Beta forward). - Phản ứng Realtime PCR được tiến hành + Chứng âm (nước cất) với phản ứng có 6 phản ứng: probe đột biến. + Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe - Thể tích PCR: 50µl. không đột biến. - Khuếch đại đoạn gen Fibrinogen Beta + Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe (PCR) bằng hệ thống luân nhiệt của máy đột biến. Realtime PCR (Bio-Rad CFX96). + Chứng đột biến. - Chu trình luân nhiệt: + Chứng không đột biến. + Chứng âm (nước cất) với phản ứng có + Làm nóng hỗn hợp ở 40°C trong 10 phút, probe không đột biến. 95°C trong 5 phút. 18 TCNCYH 106 (1) - 2017
3. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC + 39 chu kỳ nhiệt: 95°C trong 15 giây/60°C Kết quả giải trình tự gen: các thông số và trong 1 phút/72°C trong 30 giây. chất lượng đỉnh được thu thập, kiểm định bằng các phần mềm ABI Data Collection v2.0 So sánh kết quả Real time PCR với giải và Sequencing Analysis Sotwave v5.3. trình tự gen FGB Trình tự đoạn promoter của gen Fibrinogen Gen Fibrinogen Beta được nhân lên bằng Beta của mẫu bệnh và chứng người Việt Nam kỹ thuật PCR (sử dụng cặp mồi FGBf3m - được so sánh với trình tự tham chiếu công bố FGBr4m) với 40 chu kì luân nhiệt (95oC - 5 trên GenBank thông qua sử dụng phần mềm phút/ 60oC - 30 giây/72oC - 30 giây). Thể tích phân tích Chromas Lite v2.1.1 và Seaview để phản ứng 50 µl, bao gồm các thành phần: xác định đột biến điểm. DNA mẫu, mồi, và các thành phần cho phản ứng PCR (Taq DNA polymerase, dNTP, Các số liệu được tổng hợp và tính toán MgCl2, dH2O). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Word và Excel 2010. TM bằng kit PureLink (Invitrogen). Giải trình tự 3. Đạo đức nghiên cứu gen Fibrinogen Beta bằng hệ thống ABI se- Đối tượng nghiên cứu được thông báo rõ quencer được thực hiện trên máy Applied Bio- về mục đích nghiên cứu, được cung cấp systems 3.100. thông tin và bệnh nhân đồng ý tự nguyện Đối chiếu kết quả phát hiện đột biến - tham gia nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu 455G/A của gen Fibrinogen Beta bằng kỹ được giữ kín bí mật cá nhân và được phản thuật realtime PCR với kết quả giải trình tự. hồi kết quả nghiên cứu. Kết quả phù hợp khi các bệnh nhân có kết quả Realtime PCR và giải trình tự tương ứng III. KẾT QUẢ với nhau. 1. Thông tin mẫu nghiên cứu Phân tích và xử lý số liệu Có tổng số 20 bệnh nhân tham gia nghiên Kết quả nghiên cứu gen Fibrinogen Beta cứu, trong đó có 14 nam và 6 nữ. Độ tuổi trên máy Realtime PCR được phân tích bằng trung bình của các bệnh nhân là từ 18 - 56 tuổi. phần mềm CFX Manager™Software. Bảng 2. Tuổi trung bình của các bệnh nhân nghiên cứu Giới Chỉ số Tuổi trung bình chung của các bệnh nhân ( X ± SD) Nam 40,86 ± 12,25 Nữ 34,83 ± 9,13 Cả 2 giới 39,00 ± 11,15 Tuổi trung bình ở những bệnh nhân nghiên cứu là 39,00 ± 11,15 tuổi. Tuổi trung bình ở những bệnh nhân nam (40,86 ± 12,25 tuổi) lớn hơn bệnh nhân nữ (34,83 ± 9,13 tuổi). TCNCYH 106 (1) - 2017 19
4. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2. Phát hiện đột biến -455G/A bằng kỹ thuật Realtime PCR 2.1. Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A Bảng 3. Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A Chỉ số Giới n Số bệnh nhân có đột biến gen Tỷ lệ đột biến/ giới (%) Nam 14 4 28,6 Nữ 6 1 16,7* Tổng 20 5 25 *: Không khác biệt so với nam (p > 0,05). Có 5 trên tổng số 20 bệnh nhân phát hiện mang đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta, chiếm 25%, trong đó có 4 nam (80%) và 1 nữ (20%). Tỷ lệ phát hiện đột biến gen ở nam và nữ có sự khác nhau, tuy nhiên không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). 2.2. Hình ảnh Realtime PCR phát hiện đột biến -455G/A Hình 1. Kết quả Realtime PCR và giải trình tự ở mẫu không có đột biến và mẫu đột biến -455G (không đột biến); -455A (đột biến). Chứng hoặc mẫu đột biến Chứng âm Chứng hoặc mẫu không đột biến Chu kì ngưỡng (Ct) 20 TCNCYH 106 (1) - 2017
5. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2.3. Kiểu gen đột biến -455G/A Bảng 4. Kiểu gen đột biến -455G/A Kiểu gen n % Đồng hợp tử 5 100 Dị hợp tử 0 0 Tổng 5 100 Trong số 5 bệnh nhân phát hiện có đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta, kiểu gen đều là đồng hợp tử, tức cả hai alen của gen đều bị đột biến, không có trường hợp nào kiểu gen là dị hợp tử (chỉ có 1 alen bị đột biến). 2.4. Đối chiếu kết quả Realtime PCR với giải trình tự đột biến -455G/A So sánh kết quả phân tích đột biến -455G/A của gen FGB ở 20 bệnh nhân bằng kỹ thuật Real- time PCR và kỹ thuật giải trình tự gen, kết quả như sau: Bảng 5. Sự phù hợp giữa kết quả Realtime PCR và giải trình tự gen Fibrinogen Beta với đột biến -455G/A Bệnh nhân Phân tích bằng kỹ thuật Phân tích bằng kỹ Tỷ lệ phù hợp nhồi máu cơ tim Realtime PCR (1) thuật giải trình tự (2) (1)/(2) Đột biến -455G/A 5 5 100% Không đột biến 15 15 100% Tổng số 20 20 100% Kết quả tìm đột biến của 2 phương pháp Realtime PCR và giải trình tự ở các bệnh nhân là như nhau, tỷ lệ phù hợp là 100%. IV. BÀN LUẬN tim trẻ tuổi trong nghiên cứu này là 25%. Theo Sau khi hoàn chỉnh thành công kỹ thuật một nghiên cứu năm 2004, tỉ lệ người mang Realtime PCR để phát hiện đột biến -455G/A đột biến -455G/A trong nhóm bệnh nhân xơ của gen Fibrinogen Beta, nghiên cứu này vữa động mạch là 25,8%, cao hơn so với tỉ lệ bước đầu ghi nhận và xử lý các số liệu về đột 15,2% ở nhóm chứng không mắc bệnh [9]. biến -455G/A ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim Nghiên cứu khác cho thấy, tỉ lệ đột biến - trẻ tuổi. Mặc dù còn hạn chế về cỡ mẫu, tuy 455G/A ở 885 nam giới tuổi dưới 70, có tiền nhiên đây cũng là mở đầu cho các nghiên cứu sử cơn đau thắt ngực là 21%, còn một nghiên tiếp theo chi tiết hơn về đột biến này. cứu năm 2014, tỉ lệ đột biến này là 35,3% tính Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen trên 486 bệnh nhân có tiền sử đột quỵ [10; Fibrinogen Beta ở các bệnh nhân nhồi máu cơ 11]. Như vậy có thể thấy, tỉ lệ phát hiện đột TCNCYH 106 (1) - 2017 21
6. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC biến trong nghiên cứu của chúng tôi khá Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen tương đồng so với các tác giả khác trên thế Fibrinogen Beta là 25%. Tỷ lệ phát hiện đột giới. Ngoài ra, một nghiên cứu năm 1999 cho biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57% thấy đột biến -455G/A làm tăng 5,4% lượng và 16,67%, tuy nhiên không có ý nghĩa thống fibrinogen, kết hợp với 1 đột biến khác cũng kê, (p > 0,05). trên gen Fibrinogen Beta là -854G/A thì tỉ lệ này tăng lên xấp xỉ 11%, hay nghiên cứu năm Lời cảm ơn 1998 cũng kết luận kiểu gen -455AA có nồng Nghiên cứu thực hiện thành công nhờ sự độ fibrinogen trung bình là 3,9 g/L so với trung hỗ trợ của Bộ môn Y sinh học - Di truyền, bình 3,1 g/L của kiểu gen -455GG [10; 12]. Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Tim mạch Việt Điều này cho thấy đột biến -455G/A đóng vai Nam và Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á. trò quan trong trong sự gia tăng nồng độ fi- brinogen, chứng tỏ tầm quan trọng của nghiên TÀI LIỆU THAM KHẢO cứu hoàn chỉnh kỹ thuật Realtime PCR để 1. Longo D (2012). Epidemiology of Car- phát hiện đột biến này. diovascular Disease, Harrisons Principles of 75% các trường hợp còn lại không phát internal Medicine, McGraw-Hill United States. hiện có đột biến -455G/A có thể bệnh nhân 2. Ngô Quý Châu (2012). Bệnh học Nội mắc các đột biến khác ngoài đột biến trên. khoa 1. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 185. Theo một thống kê, các bệnh nhân nhồi máu 3. Nguyễn Thị Hồng Huệ (2013). Nghiên cơ tim do đột biến gen Fibrinogen Beta, ngoài cứu giá trị NT-PRO-BNP trong nhồi máu cơ đột biến -455G/A hay gặp còn có thể xuất hiện tim cấp không ST chênh lên. Tạp chí Y dược các đột biến -148C/T, -249C/T, -854G/A, - lâm sàng, 108, 21. Detec- 993C/T [12]. Điều này sẽ giúp mở ra những 4. Brown E. T., Fuller G. M (1998). tion of a complex that associates with the Bβ hướng mới cho các nghiên cứu sau này. fibrinogen G− 455-A polymorphism. Blood, 92 Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có (9), 3286 - 3293. sự khác nhau: 28,57% ở nam và 16,67% ở 5. Mika M (2003). Fibrinogen gene pro- nữ, tuy nhiên không có ý nghĩa thống kê, moter− 455 A allele as a risk factor for lacunar (p > 0,05). 100% các trường hợp đột biến đều stroke. Stroke, 34(4), 886 - 891. có kiểu gen đồng hợp tử, điều này cũng phù 6. Sevimli S (2014). Impact of-455G/A hợp với đặc điểm di truyền lặn trên nhiễm sắc Polymorphism of the β-Fibrinogen Gene on thể thường của gen, khi ở trạng thái đồng hợp Platelet Aggregation in Patients With Acute tử mới biểu hiện bệnh. Coronary Syndrome. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis, 20(3), 238 - 243. V. KẾT LUẬN 7. Gu L (2014). Influence of the β- Đã ứng dụng thành công kỹ thuật Realtime fibrinogen-455G/A polymorphism on develop- PCR để phát hiện đột biến -455G/A trên gen ment of ischemic stroke and coronary heart Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim disease. Thromb Res, 133(6), 993 - 1005. cấp trẻ tuổi, các kết quả phân tích phù hợp với 8. Wilhelmsen L (1984). Fibrinogen as a kết quả giải trình tự gen. risk factor for stroke and myocardial infarction. 22 TCNCYH 106 (1) - 2017
7. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC New England journal of medicine, 311(8), 501 vascular biology, 18(2), 265 - 271. - 505. 11. Mika M (2014). Βeta-fibrinogen gene 9. Sun H (2004). [Relationship between promoter A− 455 allele associated with poor fibrinogen B beta gene FGB-455G/A polymor- longterm survival among 55 - 71 years old phism and atherosclerotic cerebral infarction]. Caucasian women in Finnish stroke cohort. Chinese journal of medical genetics, 21(4), BMC neurology, 14(1), 1. 382 - 385. 12. Van’t Hooft F. M (1999). Two com- 10. de Maat M. P (1998). -455G/A Poly- mon, functional polymorphisms in the pro- morphism of the β-Fibrinogen Gene is Associ- ated With the Progression of Coronary Athero- moter region of the β-fibrinogen gene contrib- sclerosis in Symptomatic Men Proposed Role ute to regulation of plasma fibrinogen concen- for an Acute-Phase Reaction Pattern of tration. Arteriosclerosis, thrombosis and vas- Fibrinogen. Arteriosclerosis, thrombosis and cular biology, 19(12), 3063 - 3070. Summary APPLICATIONS OF REALTIME PCR TO DETECT -455G/A IN FIBRINOGEN BETA (FGB) GENE IN YOUNG PATIENTS WITH MYOCARDIAL INFARCTION Myocardial infarction in younger individuals or familial myocardial infarction of unknown etiol- ogy may be related to genetic mutations, including mutations common -455G/A Fibrinogen Beta gene regulations fibrinogen chain synthesis. Mutations -455G/A of Fibrinogen Beta gene identified by using Real - time PCR is compared with sequencing results. Our study was conducted on 20 patients under 60 years old with acute myocardial infarction admitted in the Vietnam National Heart Institute. The mutation detection rates of -455G/A in the Fibrinogen Beta gene was 25%. Mutation detection rate in male and female were 28.57% and 16.67% respectively. These results fit with the sequencing results. Researchers have successfully applied Real-time PCR techniques to detect mutations 455G/A in the Fibrinogen Beta gene in younger patients with acute myocardial infarction. Keywords: Acute myocardial infarction, FGB, -455G/A TCNCYH 106 (1) - 2017 23