Ứng dụng kỹ thuật pcr - rflp để xác định các đột biến A2142g và A2143g trên gene 23s rrna gây đề kháng clarithromycin của vi khuẩn helicobacter pylori

Nội dung text: Ứng dụng kỹ thuật pcr - rflp để xác định các đột biến A2142g và A2143g trên gene 23s rrna gây đề kháng clarithromycin của vi khuẩn helicobacter pylori

1. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN A2142G VÀ A2143G TRÊN GENE 23S rRNA GÂY ĐỀ KHÁNG CLARITHROMYCIN CỦA VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI Hà Thị Minh Thi, Trần Văn Huy Trường Đại học Y Dược Huế Tóm tắt Đặt vấn đề và mục tiêu: Đề kháng clarithromycin của Helicobacter pylori là một nguyên nhân quan trọng làm giảm hiệu quả tiệt trừ H.pylori. Đề tài nhằm mục tiêu: (1) Đánh giá việc ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định các đột biến A2142G, A2143G trên gene 23S rRNA gây kháng clarithromycin của Helicobacter pylori. (2) Khảo sát tỷ lệ các đột biến A2142G, A2143G trên gene 23S rRNA gây kháng clarithromycin của Helicobacter pylori ở các bệnh nhân viêm loét dạ dày-tá tràng bằng kỹ thuật PCR-RFLP. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 38 bệnh nhân viêm loét dạ dày-tá tràng có nhiễm Helicobacter pylori được xác định bằng test nhanh và PCR. Kỹ thuật PCR-RFLP được thực hiện gồm hai bước: khuếch đại đoạn gene 23S rRNA chứa các vị trí 2142 và 2143, tiếp theo sau bởi phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme BbsI và BsaI để xác định các đột biến A2142G và A2143G. Lượng enzyme sử dụng trong phản ứng cắt được khảo sát ở các mức khác nhau (5U; 7,5U; 10U; 15U và 20U) nhằm xác định lượng enzyme tối ưu. Kết quả nghiên cứu: Thành phần phản ứng cắt được tối ưu hóa như sau: thực hiện trong thể tích dung dịch 20 µl, gồm 5 µl sản phẩm PCR (khuếch đại đoạn gene 23S rRNA chứa các vị trí 2142 và 2143), 10 U enzyme (BsaI để phát hiện A2143G, BbsI để phát hiện A2142G), 2 µl đệm G 2X, nước cất cho đủ thể tích. Đã phát hiện được 17 trường hợp mang đột biến A2143G, chiếm tỷ lệ 44,7%. Không có trường hợp đột biến A2142G nào được phát hiện. Kết luận: Kỹ thuật PCR-RFLP có thể ứng dụng thường quy để phát hiện đột biến A2142G và A2143G trên gene 23S rRNA gây kháng clarithromycin của Helicobacter pylori. Tỷ lệ mang gene đột biến trong nghiên cứu này khá cao. Từ khóa: kháng clarithromycin, gene 23S rRNA, Helicobacter pylori Abstract DETECTING POINT MUTATIONS A2142G AND A2143G IN THE 23S rRNA GENE CAUSING HELICOBACTER PYLORI RESISTANCE TO CLARITHROMYCIN BY PCR RFLP Ha Thi Minh Thi, Tran Van Huy Hue University of Medicine and Pharmacy Background: Clarithromycine-resistance of H.pylori is one important cause of decreasing eradication rate of H.pylori. This study is aimed at: (1): evaluating the application of PCR RFLP in detecting point mutations A2142G and A 2143G in the 23SrRNA gene resulting Clarithromycine-resistant H.pylori. (2) determining the rate of these point mutations by PCR RFLP in patients with gastroduodenitis or peptic ulcers. Patients and methods: 38 patients with gastroduodenitis or peptic ulcer were enrolled. H.pylori infection was confirmed by rapid Urease test and PCR. PCR was performed in two phases: amplification - Địa chỉ liên hệ: Trần Văn Huy, email: bstranvanhuy@gmail.com - Ngày nhận bài: 12/3/2013 * Ngày đồng ý đăng: 20/4/2013*Ngày xuất bản: 30/4/2013 56 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 14
2. of gene 23S rRNA containing A2143 and A2142, followed by digestion of PCR products by enzymes BbsI and BsaI in order to detecting point mutations A2143G and A2142G. Different quantities of enzyme of digestion were evaluated (5U; 7,5U; 10U; 15U and 20U) in order to determine an optimal quantity. Results: The components of digesting reaction were optimized as followings: performed in a solution volume of 20 µl, including 5 µl PCR products (to amplify gene 23S rRNA containing 2142 and 2143), 10 U enzyme (BsaI to detect A2143G, BbsI to detect A2142G), 2 µl buffer G 2X, and water for a sufficient volume. 17 point mutations A2143G were found (44.7%). Conclusion: PCR RFLP could be routinely applied to detect point mutations A2143G and A2142G in the 23S rRNA gene causing clarithromycine- resistant H.pylori. The rate of these point mutations in this group of patients was relatively high. Key words: Clarithromycin resistance, gene 23S rRNA, Helicobacter pylori 1. ĐẶT VẤN ĐỀ các đột biến điểm ở vị trí 2142 và 2143 trên gene Vi khuẩn Helocibacter pylori là một tác nhân 23S rRNA của Helicobacter pylori liên quan đến gây bệnh của nhiều bệnh lý dạ dày khác nhau như đề kháng clarithromycin của vi khuẩn này [15]. loét dạ dày-tá tràng, viêm dạ dày mạn, ung thư Hai đột biến thường gặp là A2142G, A2143G dạ dày. Năm 1994, Tổ chức Y tế thế giới đã xếp chịu trách nhiệm trong hơn 90% trường hợp Helocibacter pylori vào loại gây ung thư nhóm Helicobacter pylori đề kháng clarithromycin [11], 1 tức là nhóm đã được xác định rõ ràng [8]. Vì [13]. Vì vậy, việc sử dụng các kỹ thuật sinh học vậy, điều trị tiệt trừ Helocibacter pylori đóng vai phân tử nhằm phát hiện đột biến gene 23S rRNA của trò rất quan trọng trong phác đồ điều trị các bệnh Helicobacter pylori là một lựa chọn hàng đầu hiện lý viêm loét dạ dày- tá tràng và góp phần giảm nay trong việc chẩn đoán kháng clarithromycin. nguy cơ ung thư dạ dày. Clarithromycin là kháng Mặt khác, do các đột biến trên đều có liên quan sinh thuộc họ macrolide và được sử dụng hàng đến vị trí nhận biết của các enzyme cắt hạn chế đầu trong các phác đồ điều trị Helocibacter pylori. (restriction enzyme) nên có thể phát hiện bằng kỹ Tuy nhiên, một thách thức rất lớn trong điều trị tiệt thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – trừ Helicobacter pylori hiện nay là vấn đề kháng Restriction Fragment Length Polymorphism), là clarithromycin. Nhiều nghiên cứu gần đây cho một kỹ thuật sinh học phân tử đơn giản, có thể thấy Helicobacter pylori kháng clarithromycin ở thực hiện ở các phòng thí nghiệm có hệ thống PCR khu vực châu Á-Thái Bình Dương lên đến xấp xỉ cơ bản. Trong khi đó, ở Việt Nam có rất ít nghiên 20% [7] và làm giảm hiệu quả điều trị Helicobacter cứu về Helicobacter pylori kháng clarithromycin, pylori trong hơn 50% trường hợp [6]. và hầu như chưa có nghiên cứu phát hiện đột biến Từ trước đến nay, các kỹ thuật vi sinh vẫn được gene 23S rRNA của vi khuẩn này bằng kỹ thuật coi là tiêu chuẩn vàng trong việc xác định kiểu PCR-RFLP. hình đề kháng clarithromycin của Helicobacter Từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu pylori. Tuy nhiên đây là loại vi khuẩn rất khó nuôi này nhằm các mục tiêu sau: cấy và phát triển chậm. Vì thế các xét nghiệm nuôi 1. Đánh giá việc ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP cấy để xác định tính nhạy cảm kháng sinh như để xác định các đột biến A2142G, A2143G trên phương pháp pha loãng trên agar, pha loãng canh gene 23S rRNA gây kháng clarithromycin của thang, đĩa khuếch tán hay E-test thường cho kết Helicobacter pylori. quả muộn, mất 7-14 ngày, hơn nữa còn có thể bỏ 2. Khảo sát tỷ lệ các đột biến A2142G, A2143G sót những trường hợp có nhiễm nhưng nuôi cấy vi trên gene 23S rRNA gây kháng clarithromycin của khuẩn không mọc [17]. Helicobacter pylori ở các bệnh nhân viêm loét dạ Từ năm 1996, Versalovic đã phát hiện được dày-tá tràng bằng kỹ thuật PCR-RFLP. Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 14 57
3. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 1 phút, giai đoạn kéo dài mồi 72oC trong 1 phút; CỨU cuối cùng thêm 72oC trong 10 phút. Thực hiện trên 2.1. Đối tượng nghiên cứu máy Applied Biosystems 2720. Đối tượng nghiên cứu gồm 38 bệnh nhân Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose viêm loét dạ dày-tá tràng đã được chẩn đoán xác 0,8%, điện thế 80 V, 30 phút. Nhuộm ethidium định bằng nội soi và sinh thiết niêm mạc dạ dày bromide và đọc dưới đèn cực tím. Kích thước sản làm test nhanh (urease test) xác định có nhiễm phẩm là 109 bp. Helicobacter pylori. 2.2.4. Phương pháp các đột biến A2142G, Loại trừ những trường hợp có điều trị tiệt trừ A2143G bằng kỹ thuật PCR-RFLP Helicobacter pylori trong vòng 4 tuần. Bước 1: Thực hiện PCR khuếch đại đoạn gene 2.2. Phương pháp nghiên cứu 23S rRNA có chứa vị trí 2142 và 2143. Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Các bước nghiên Cặp mồi được thiết kế bởi Ménard (2002) [13]. cứu như sau: Trình tự mồi như sau: 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu nghiên cứu HPY-S: 5′-AGGTTAAGAGGATGCGTCAGTC-3′ Thu thập mẫu nghiên cứu tại khoa Nội Soi, HPY-A: 5′-CGCATGATATTCCCATTAGCAGT-3′ bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế. Các bệnh Thành phần phản ứng gồm 25 µl GoTaq Green nhân đến Nội soi dạ dày có thương tổn viêm loét MasterMix (Promega), 20 pmol mỗi mồi, 200 ng dạ dày-tá tràng được sinh thiết niêm mạc dạ dày DNA khuôn mẫu và nước cất cho đủ 50 µl. Điều gồm hai mảnh tại hai vị trí hang vị và thân vị để kiện luân nhiệt: 95oC trong 5 phút; tiếp theo là khảo sát nhiễm H. pylori và sau đó sẽ xác định đột 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm: giai đoạn biến tính biến gene đề kháng clarithromycin. 94oC trong 1 phút, giai đoạn gắn mồi 55oC trong Tiến hành thử test nhanh (urease test) ngay tại 1 phút, giai đoạn kéo dài mồi 72oC trong 1 phút; khoa Nội soi để xác định sơ bộ có nhiễm H. pylori. cuối cùng thêm 72oC trong 10 phút. Thực hiện trên Các mẫu sinh thiết niêm mạc dạ dày sau đó được máy Applied Biosystems 2720. lưu trữ trong TE ở -20oC tại bộ môn Di truyền Y Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose học, trường Đại học Y Dược Huế. 0,8%, điện thế 80 V, 30 phút. Nhuộm ethidium 2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu bromide và đọc dưới đèn cực tím. Kích thước sản mô sinh thiết niêm mạc dạ dày phẩm là 267 bp. Tách chiết DNA từ mảnh sinh thiết niêm Bước 2: Thực hiện phản ứng cắt sản phẩm mạc dạ dày theo protocol chuẩn của kit Wizard PCR bằng các enzyme cắt BbsI và BsaI (Thermo Genomic DNA purification (Promega). DNA sau Scientific). khi tách chiết được đo trên máy Nanodrop rồi pha Thể tích mỗi phản ứng cắt là 20 µl, gồm 2 loãng ở nồng độ 100 ng/uL µL dung dịch đệm G 10X, 5 µl sản phẩm PCR, 2.2.3. Phương pháp xác định nhiễm H. pylori enzyme cắt, nước cất cho đủ thể tích phản ứng 20 bằng kỹ thuật PCR µl. Mỗi phản ứng cắt được thử nghiệm ba lần với Sử dụng cặp mồi đặc hiệu gene 16S rRNA của ba lượng enzyme cắt khác nhau là 5U, 7,5 U và 10 H. pylori, được thiết kế bởi Bickley [5], trình tự U. Đối với các mẫu không xuất hiện sản phẩm cắt mồi: với cả ba thử nghiệm trên, chúng tôi tiếp tục thử Hp-F: 5’-AAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGGTTT-3’ nghiệm với các lượng enzyme lớn hơn nữa là 15 Hp-R: 5’-AAGCTTACTTTCTAACACTAACGC-3’ U và 20 U. Ủ trong bể điều nhiệt 37oC, thời gian Thành phần phản ứng gồm 12,5 µl GoTaq ủ là 20 giờ. Green MasterMix (Promega), 10 pmol mỗi mồi, Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 2,5%, 100 ng DNA khuôn mẫu và nước cất cho đủ 25 µl. thời gian 1 giờ 40 phút. Nhuộm ethidium bromide Điều kiện luân nhiệt: 95oC trong 5 phút; tiếp theo và đọc kết quả dưới đèn cực tím. là 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm: giai đoạn biến tính Đọc kết quả dựa vào sự xuất hiện của các băng 94oC trong 1 phút, giai đoạn gắn mồi 52oC trong tương ứng với các sản phẩm cắt như sau: 58 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 14
4. Sản phẩm sau khi cắt bằng BbsI Sản phẩm sau khi cắt bằng BsaI Bình thường A2142G Bình thường A2143G Số băng 1 2 1 2 Kích thước 267 bp 219 bp và 48 bp 267 bp 208 bp và 59 bp 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định đột biến A2142G và A2143G M: thang chuẩn 100 bp 1 đến 7: sản phẩm PCR, kích thước 267 bp Các băng tương ứng sản phẩm PCR đậm, sắc nét, không có băng không đặc hiệu, không có sản phẩm primer-dimer. Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gene 23S rRNA có chứa vị trí 2142 và 2143 M: thang chuẩn 25 bp 1: sản phẩm cắt với 10 U enzyme BsaI. Có 2 băng kích thước 208 bp và 59 bp. Phản ứng cắt hoàn toàn. 2: sản phẩm cắt với 7,5 U enzyme BsaI. Có 3 băng kích thước 267 bp, 208 bp và 59 bp. Phản ứng cắt không hoàn toàn 3: sản phẩm cắt với 5 U enzyme BsaI. Cột 3 có 3 băng 267 bp, 208 bp và 59 bp. Phản ứng cắt không hoàn toàn. Băng 267 bp ở cột 3 đậm hơn cột 2 chứng tỏ sản phẩm chưa bị cắt còn nhiều hơn, tức phản ứng cắt kém hơn. Cả 3 cột được thực hiện với cùng một mẫu sản phẩm PCR. Kết quả chẩn đoán là chủng Helicobacter pylori này mang đột biến A2143G Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm có mang đột biến A2143G được cắt với các lượng enzyme BsaI khác nhau M: thang chuẩn 25 bp 1: sản phẩm cắt với 10 U enzyme BsaI 2: sản phẩm cắt với 15 U enzyme BsaI 3: sản phẩm cắt với 20 U enzyme BsaI Cả 3 cột đều được thực hiện với cùng một mẫu sản phẩm PCR. Nhận xét: Tất cả các phản ứng đều không thấy xuất hiện sản phẩm cắt dù lượng enzyme đã tăng lên đến 20 U. Kết quả xác định mẫu này không mang đột biến A2143G Hình 3. Hình ảnh điện di sản phẩm không mang đột biến A2143G được cắt với các lượng enzyme BsaI khác nhau Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 14 59
5. Đối với phản ứng cắt thực hiện bằng enzyme loại đột biến trên, trong đó BsaI được sử dụng cho BbsI để phát hiện đột biến A2142G, chúng tôi phản ứng cắt phát hiện đột biến A2143G và BbsI không có mẫu nào xuất hiện sản phẩm cắt (219 được sử dụng cho phản ứng cắt phát hiện đột biến bp và 48 bp) ở cả 5 mức enzyme sử dụng là 5 U, A2142G [14]. Từ đó đến nay, kỹ thuật PCR-RFLP 7,5 U, 10 U, 15 U và 20 U. Như vậy không có được sử dụng một cách rộng rãi nhằm mục đích chủng Helicobacter pylori nào trong nghiên cứu phát hiện hai loại đột biến trên với kết quả nhanh của chúng tôi có mang đột biến A2142G. và chính xác. 3.2. Tỷ lệ các đột biến A2142G và A2143G Hình 1 là hình ảnh điện di sản phẩm PCR với của gene 23S rRNA của Helicobacter pylori ở cặp mồi của Menard cho phép khuếch đại đoạn bệnh nhân viêm loét dạ dày-tá tràng gene 23S rRNA có chứa các vị trí 2142 và 2143. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu DNA tách từ mảnh Bảng 2. Tỷ lệ các đột biến A2142G và A2143G sinh thiết niêm mạc dạ dày của bệnh nhân trong của gene 23S rRNA nghiên cứu này đều có sản phẩm PCR với cặp mồi Đột biến Số lượng Tỷ lệ % đặc hiệu gene 23S rRNA chứa các vị trí 2142 và A2142G 0 0 2143. Băng sản phẩm đậm, sắc nét, không có băng A2143G 17 44,7 không đặc hiệu và băng primer-dimer (xuất hiện Không có 2 loại đột 21 55,3 nếu có hiện tượng bắt cặp giữa hai mồi). Điều này biến khảo sát chứng tỏ cặp mồi chúng tôi sử dụng là đặc hiệu, Tổng 38 100 điều kiện luân nhiệt, các thành phần phản ứng khuếch đại cũng như trang thiết bị được sử dụng Nhận xét: Tỷ lệ mang đột biến A2143G là tại phòng thí nghiệm là đạt tiêu chuẩn. Với chất 44,7%, không có trường hợp nào mang đột biến lượng và số lượng sản phẩm PCR đã thu được là A2142G được phát hiện. đủ điều kiện để thực hiện bước tiếp theo. Trong kỹ thuật PCR-RFLP, bước thực hiện 4. BÀN LUẬN phản ứng cắt là rất quan trọng vì kết quả được xác 4.1. Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định đột biến hay bình thường tùy thuộc vào việc định đột biến A2142G và A2143G có hay không có sản phẩm cắt. Nếu lượng enzyme Kỹ thuật PCR-RFLP là một kỹ thuật sinh học cắt được sử dụng không đủ hoặc kém chất lượng phân tử tương đối đơn giản, có thể thực hiện ở các thì có thể không xảy ra hiện tượng cắt mặc dù phòng thí nghiệm được trang bị hệ thống PCR cơ vẫn có xuất hiện vị trí cắt do đột biến. Tuy nhiên, bản. Kỹ thuật này gồm có hai bước được nối tiếp chúng ta cũng không thể sử dụng một cách thừa nhau, bước 1 thực hiện PCR để khuếch đại đoạn thải lượng enzyme. Ngoài vấn đề lãng phí ra thì gene có chứa đột biến cần khảo sát, bước 2 thực việc sử dụng một lượng lớn enzyme sẽ dẫn đến hiện phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme lượng glycerol (là thành phần có trong các ống cắt hạn chế (restriction enzyme) thích hợp. Tùy enzyme được cung cấp từ các hãng sinh phẩm với theo đột biến tạo ra vị trí nhận biết và cắt mới hoặc nồng độ 50%) vượt quá 5% trong thể tích phản làm mất vị trí nhận biết và cắt có sẵn của từng ứng cuối cùng và làm giảm hoạt tính enzyme. Các enzyme cắt đặc hiệu trên gene khảo sát mà người điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ cũng như dung ta có thể chọn enzyme cắt sao cho thích hợp. Từ dịch đệm luôn được sử dụng theo đúng protocol năm 1996, lần đầu tiên Versalovic phát hiện ra hai của nhà cung cấp enzyme, vì vậy việc tối ưu hóa loại đột biến A2142G và A2143G, tác giả đã xác lượng enzyme sử dụng sao cho vừa đủ theo chúng nhận đột biến A2143G tạo nên vị trí nhận biết và tôi là quan trọng đối với mỗi phòng thí nghiệm, cắt cho enzyme BsaI [15]. Năm 1997, Occhialini trước khi sử dụng thường quy để chẩn đoán mỗi đã phát triển kỹ thuật PCR-RFLP để xác định hai loại đột biến. 60 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 14
6. Trong nghiên cứu này chúng tôi so sánh hiệu mạc dạ dày. Kỹ thuật này tương đối đơn giản, chi quả cắt giữa các lượng enzyme được sử dụng cho phí không cao, thời gian cho kết quả nhanh chóng mỗi phản ứng thể tích 20 µl (trong đó có 5 µl sản (sau 2 ngày). phẩm PCR của bước 1) lần lượt là 5 U; 7,5 U và 4.2. Tỷ lệ đột biến A2142G và A2143G trên 10 U. Hình 2 cho thấy ở cột 1 tương ứng lượng gene 23S rRNA của Helicobacter pylori ở bệnh enzyme BsaI được sử dụng 10 U có 2 băng xuất nhân viêm loét dạ dày-tá tràng hiện rõ với kích thước 208 bp và 59 bp, phù hợp Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện trên với đột biến A2143G. Các cột 2 và 3 tương ứng 38 bệnh nhân đã có kết quả test nhanh và PCR chẩn với lượng enzyme BsaI được sử dụng là 7,5 U và đoán xác định nhiễm Helicobacter pylori. Kết quả 5 U thì vẫn còn băng 267 bp ngoài hai sản phẩm cho thấy tỷ lệ các chủng Helicobacter pylori mang cắt 208 bp và 59 bp, chứng tỏ phản ứng cắt xảy ra đột biến A2143G trên gene 23S rRNA là 44,7%, nhưng chưa hoàn toàn. Băng 267 bp ở cột 3 đậm không có chủng nào mang đột biến A2142G. Như hơn cột 2 là phù hợp với lượng enzyme BsaI được vậy tỷ lệ các chủng Helicobacter pylori mang đột sử dụng ít hơn. Hình 3 là kết quả điện di sau khi biến gene 23S rRNA được chúng tôi phát hiện thực hiện phản ứng cắt được thực hiện với một là 44,7%, trong đó A2143G chiếm 100%. Các trong các mẫu không có sản phẩm cắt với các mức đột biến gene A2142G và A2143G được xem là enzyme BsaI là 5 U, 7,5 U và 10 U. Chúng tôi tiếp thường gặp nhất của gene 23S rRNA gây kháng tục thực hiện phản ứng cắt với lượng enzyme thuốc clarithromycin. Tần suất các các đột biến cao hơn, lần lượt là 15 U và 20 U (tương ứng trong số các chủng Helicobacter pylori đề kháng cột 2 và 3). Tất cả đều không có sản phẩm cắt clarithromycin là khác nhau tùy từng khu vực trên 208 bp và 59 bp mặc dù lượng enzyme đã tăng rất thế giới. Nhiều nghiên cứu đã được tổng kết và nhiều, chứng tỏ chủng Helicobacter pylori tương cho thấy ở Mỹ đột biến A2142G chiếm tỷ lệ 48- ứng không mang đột biến A2143G. 53%, còn A2143G chiếm tỷ lệ thấp hơn, khoảng Đối với phản ứng cắt bằng enzyme BbsI để xác 39-45%, đột biến A2142C chiếm tỷ lệ 0-7%. Còn định đột biến A2142G, chúng tôi đã thử cả 5 lượng ở châu Âu thì ngược lại, A2143G chiếm tỷ lệ cao enzyme BbsI khác nhau là 5 U, 7,5 U, 10 U, 15 U nhất, khoảng 44-67%, trong khi A2142G chỉ 23- và 20 U nhưng tất cả đều không có sản phẩm cắt 33% và A2142C thì chiếm 2-10% [11]. Ở châu 219 bp và 48 bp cho tất cả 38 trường hợp nghiên Á nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ A2143G thì cứu. Lượng enzyme BsaI cũng như BbsI mà các chiếm tỷ lệ cao hơn, như nghiên cứu của Kargar tác giả trên thế giới sử dụng cho mỗi phản ứng (Iran, 2011) có tỷ lệ A2143G là 68,3%, trong khi cắt để xác định các đột biến tương ứng cũng chỉ A2142G chiếm 15,8% [9]. Một số nghiên cứu ở trong khoảng từ 5-10 U (với thể tích phản ứng cắt Nhật Bản như của Maeda (2000) và Kato (2002) là 15-20 µl). Vì vậy, chúng tôi có thể khẳng định thì cho thấy tỷ lệ A2143G chiếm hơn 90% các rằng trong 38 mẫu nghiên cứu của mình không trường hợp kháng clarithromycin, trong khi không có chủng Helicobacter pylori nào mang đột biến tìm thấy trường hợp nào mang đột biến A2142G A2142G. [10], [12]. Như vậy nghiên cứu của chúng tôi khá Qua các kết quả đã phân tích, chúng tôi kết tương đồng với các nghiên cứu ở Nhật Bản. luận rằng có thể sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP Sau khi Versalovic phát hiện ra hai loại đột với cặp mồi của Menard, 10 U enzyme cắt mỗi biến kể trên, tác giả cũng nhận thấy có mối tương loại (BsaI và BbsI) lần lượt được sử dụng để cắt quan giữa đột biến gene 23S rRNA với nồng độ 5 µl sản phẩm PCR, thể tích phản ứng là 20 µl có ức chế tối thiểu (MIC) của clarithromycin, các thể được sử dụng thường quy nhằm phát hiện đột chủng mang đột biến A2142G có MIC cao hơn biến A2143G, A2142G trên gene 23S rRNA của (trên 64 mg/l) các chủng mang đột biến A2143G Helicobacter pylori từ các mẫu mô sinh thiết niêm [16]. Sau này, nhiều tác giả khác cũng xác nhận Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 14 61
7. kết luận trên. Như vậy các chủng mang đột biến còn khu vực dưới 20% được gọi là vùng đề kháng gene 23S rRNA gây kháng thuốc clarithromycin thấp. Việc xác định tỷ lệ đề kháng clarithromycin trong nghiên cứu của chúng tôi tương ứng với trong cộng đồng là rất quan trọng, đây chính là MIC không cao. Tuy nhiên, tỷ lệ có đột biến chìa khóa để lựa chọn phác đồ điều trị tiệt trừ gene 23S rRNA gây kháng clarithromycin trong Helicobacter pylori. Tỷ lệ kháng clarithromycin nghiên cứu của chúng tôi là khá cao, đến 44,7%. càng ngày sẽ tăng cao một cách nhanh chóng, do Hiện tại, ở Việt Nam chưa có các công bố được sự sử dụng không đúng cách kháng sinh này trong xuất bản nào liên quan đến tỷ lệ các đột biến điều trị nhiều bệnh lý khác nhau, chủ yếu là để gene 23S rRNA gây kháng clarithromycin nên điều trị các nhiễm khuẩn đường hô hấp và tiệt trừ chúng tôi chưa so sánh trực tiếp được. Từ trước Helicobacter pylori. Vì vậy, việc triển khai một đến nay, các nghiên cứu kháng clarithromycin kỹ thuật PCR-RFLP thường quy giúp xác định đề của Helicobacter pylori chỉ mới thực hiện bằng kháng clarithromycin của Helicobacter pylori là các phương pháp vi sinh học thông qua nuôi cấy. hết sức cần thiết giúp cho nhà lâm sàng có cơ sở Nghiên cứu của Lê Đình Minh Nhân năm 2006 để lựa chọn phác đồ điều trị. Kỹ thuật này có các cho thấy tỷ lệ kháng clarithromycin ở bệnh nhân ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện, giá thành không viêm loét dạ dày tá tràng là 38,5% [1]. Nghiên cao, cho kết quả nhanh chóng sau 2 ngày. cứu của Nguyễn Văn Thịnh (2009) có tỷ lệ này ở bệnh nhân loét hành tá tràng là 21,4% [3]. 5. KẾT LUẬN Năm 2010, Nguyễn Thị Nguyệt đã phân lập các 5.1. Chúng tôi đã ứng dụng kỹ thuật PCR- chủng H. pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày mạn, RFLP để xác định đột biến A3143G và A2142G loét dạ dày và ung thư dạ dày, kết quả cho thấy trên gene 23S rRNA của Helicobacter pylori từ có 26,67% đề kháng clarithromycin [2]. Nguyễn các mẫu sinh thiết dạ dày và có thể đưa vào làm Đức Toàn cũng khảo sát tình hình kháng kháng xét nghiệm thường quy. Phản ứng cắt được thực sinh của H. pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày hiện trong thể tích dung dịch 20 µl, gồm 5 µl sản và loét dạ dày tá tràng, nhận thấy tỷ lệ kháng phẩm PCR (khuếch đại đoạn gene 23S rRNA chứa clarithromycin là 36,6% [4]. Như vậy có thể các vị trí 2142 và 2143), 10 U enzyme (BsaI để thấy tỷ lệ kháng clarithromycin ở nghiên cứu phát hiện A2143G, BbsI để phát hiện A2142G), 2 của chúng tôi cũng như của các tác giả trên đều µl đệm G 2X, nước cất cho đủ thể tích. cao trên 20%. Theo đồng thuật Maastricht, những 5.2. Tỷ lệ đột biến A2143G là 44,7% (17/38). khu vực có tỷ lệ đề kháng clarithromycin trên 20% Không có trường hợp đột biến A2142G nào được đã được gọi là vùng đề kháng clarithromycin cao, phát hiện trong nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Đình Minh Nhân, Võ Thị Chi Mai (2006), 14-18. “Tính đề kháng kháng sinh của Helicobacter 4. Nguyễn Đức Toàn, Tạ Long (2012), “Tình hình pylori trong bệnh viêm loét dạ dày tá tràng”, Tạp kháng kháng sinh của Helicobacter pylori với chí Y học TP Hồ Chí Minh, 10(1), trang 73-75. kháng sinh đồ ở bệnh nhân viêm dạ dày và loét 2. Nguyễn Thị Nguyệt (2010), “Khảo sát tính kháng tá tràng”, Tạp chí khoa học Tiêu hóa Việt Nam, thuốc các chủng Helicobacter pylori phân lập từ VII(27), trang 1783-1789. các bệnh nhân viêm dạ dày mạn tính, loét dạ dày 5. Bickley J., Owen J.R., Fraser G.A., Pounder và ung thư dạ dày”, Tạp chí Y học thực hành, E.R. (1993), “Evaluation of the polymerase 712(4), trang 20-22. chain reaction for detecting the urease C gene of 3. Nguyễn Văn Thịnh (2009), “Tình hình kháng Helicobacter pylori in gastric biopsy sample and kháng sinh của Helicobacter pylori ở những bệnh dental plaque”, J. Med. Microbiol, 39:338-344. nhân loét hành tá tràng trong 6 tháng đầu năm 6. Dore M. P., Leandro G., Realdi G., Sepulveda A. 2009”, Tạp chí Y học thực hành, 669(8), trang R., Graham D. Y. (2000), “Effect of pretreatment 62 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 14
8. antibiotic resistance to metronidazole and Helicobacter pylori strains by a preferential clarithromycin on outcome of Helicobacter pylori homoduplex formation assay”, J. Clin. Microbiol, therapy: a meta-analytical approach”, Dig Dis 38:210-214. Sci, 45, pp. 68-76. 13. Ménard A., Santos A., Mesgnaud F., Oleastro 7. Fock K. M., Katelaris P., Sugano K., Ang T. L., Hunt M. (2002), “PCR-Restriction Fragment Length R., Talley N. J., Lam S. K., Xiao S-D., Tan H. J., Polymorphism can also detect point mutation Wu C-Y, Jung H. C., Bui Huu Hoang, Kachintorn A2142C in the 23S rRNA gene, associated with U., Goh K-L, Chiba T., Rani A. A. (2009), “Second Helicobacter pylori resistance to clarithromycin”, Asia-Pacific consensus guidelines for Helicobacter Antimicrobial Agent and Chemotherapy, pylori infection”, Gastroenterology and Hepatology, 46(4):1156-1157. 24, pp. 1587-1600. 14. Occhialini A., Urdaci M., Doucet-Populaire F., 8. IARC (International agency for research on Bebear C.M., Lamouliatte H., Megraud F. (1997), cancer) (1994), “Infection with Helicobacter “Macrolide resistance in Helicobacter pylori: pylori”, Schistosomes, Liver Fluke and rapid detection of point mutations and assays of Helicobacter pylori, Vol 61, pp.177-179, WHO. macrolide binding to ribosomes”, Antimicrobial 9. Kargar M., Ghorbani-Dalini S., Doosti A., Agent and Chemotherapy, 41:2724-2728. Baghernejad M. (2011), “Molecular assessment 15. Versalovic J., Shortridge D., Kibler K., Griffy of clarithromycin resistant Helicobacter pylori M.V., Beyer J., Flamm R.K., Tanaka S.K., Graham strains using rapid and accurate PCR-RFLP D.Y., Go M.F. (1996), “Mutation in 23S rRNA method in gastric specimens in Iran. are associated with clarithromycin resistance in 10. Kato S., Fujimura S., Udagawa H., Shimizu Helicobacter pylori”, Antimicrobial Agent and T., Maisawa S., Ozawa K., Iinuma K. (2002), Chemotherapy, 40(2):477-480. “Antibiotic resistance of Helicobacter pylori 16. Versalovic J., Osato M.S., Spakovsky K., Dore strains in Japanese childrend”, J. Clin. Microbiol, M.P., Reddy R., Stone G.G., Shortridge D., 40:649-653. Flamm R.K, Tanaka S.K., Graham D.Y. (1997), 11. Kim K.S., Kang J.O., Eun C.S., Han D.S., “Point mutation in 23S rRNA gene in Helicobacter Chol T.Y. (2002), “Mutations in the 23S rRNA pylori associated with different levels of gene of Helicobacter pylori associated with clarithromycin resistance”, Antimicrobial Agent clarithromycin resistance”, Journal Korean and Chemotherapy, 40:283-286 Medical Science, 17:599-603. 17. Xia H. H-X., Fan X-G., Talley N.J. (1999), 12. Maeda S., Yoshida H., Matsunaga H., Ogura “Clarithromycin resistance in Helicobacter pylori K., Kawamata O., Shiratori Y., Omata M. and its clinical relevance”, World Journal of (2000), “Detection of clarithromycin-resistant Gastroenterology, 5(3): 263-266. Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 14 63