Ứng dụng kỹ thuật multiplex - pcr chẩn đoán escherichia coli gây tiêu chảy ở người

Nội dung text: Ứng dụng kỹ thuật multiplex - pcr chẩn đoán escherichia coli gây tiêu chảy ở người

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 ỨNG D ỤNG K Ỹ THU ẬT MULTIPLEX-PCR CH ẨN ĐOÁN ESCHERICHIA COLI GÂY TIÊU CH ẢY Ở NG ƯỜI Nguy ễn Đắc Trung*; Nguy ễn Th ị Thu Thái*; Tr ần Quang C ảnh** TÓM T ẮT Mục tiêu: phát hi ện gen độc l ực eae , sxt và ipaH ở các ch ủng E. coli phân l ập t ừ b ệnh nhân (BN) tiêu ch ảy b ằng ph ản ứng multiplex-PCR. Đối t ượng và ph ươ ng pháp: 4 ch ủng chu ẩn E. coli (EPEC, EIEC, EHEC và EC) và 23 ch ủng E. coli phân l ập t ừ BN tiêu ch ảy đã được tách ADN t ổng s ố tr ực ti ếp t ừ khu ẩn l ạc vi khu ẩn. Khu ếch đại gen eae , sxt và ipaH ở các ch ủng chu ẩn E. coli b ằng ph ản ứng PCR và multiplex-PCR. S ử d ụng ph ản ứng multiplex-PCR v ới các cặp m ồi t ươ ng t ự để phát hi ện đồng th ời gen eae , sxt và ipaH t ừ ADN genome các ch ủng E. coli phân l ập t ừ BN tiêu ch ảy. Kết qu ả và k ết lu ận: khu ếch đại thành công gen độc l ực eae , sxt và ipaH ở các ch ủng chu ẩn EPEC, EIEC và EHEC b ằng ph ản ứng PCR và multiplex-PCR. Với ph ản ứng multiplex-PCR, đã xác định được 9/23 ch ủng E. coli phân l ập t ừ BN tiêu ch ảy có mang gen độc l ực. Trong đó 2 ch ủng vi khu ẩn thu ộc nhóm EPEC (mang gen eae ), 4 ch ủng thu ộc nhóm EIEC (mang gen sxt ) và 3 ch ủng thu ộc nhóm EHEC (mang đồng th ời gen eae và sxt ). * T ừ khóa: E. coli ; Multiplex-PCR; Gen eae, sxt, ipaH. Multiplex-PCR Assay for Identification of Human Diarrheagenic Escherichia coli Summary Objectives: To identify virulent gene of eae, sxt and ipaH in the strains of E. coli isolated from diarrhea patients by multiplex-PCR assay. Subjects and methods: Four E. coli strains (EPEC, EIEC, EHEC and EC) and 23 strains of E. coli isolated from diarrhea patients were subjected to extract total DNA from bacterial colonies. Amplification of eae, sxt and ipaH genes in the standard E. coli strains were carried out by PCR and multiplex PCR. Multiplex-PCR assays with similar primer pairs were used to simultaneously detect eae, sxt and ipaH genes from the genomic DNA of E. coli strains isolated from diarrhea patients. Results and conclusions: Eae, sxt and ipaH genes were successfully amplified in EPEC, EIEC and EHEC strains by PCR and multiplex-PCR. By using multiplex-PCR, 9 out of 23 strains of E. coli isolated from diarrhea patients were identified. Two strains of EPEC (possessed single eae, four strains of EIEC (carried single sxt) and three strains of EHEC (possessed both eae and sxt). * Keywords: E. coli ; Multiplex-PCR; Gene eae , sxt, ipaH. * Tr ường Đại h ọc Y-Dược Thái Nguyên ** Tr ường Đại h ọc K ỹ thu ật Y t ế H ải D ươ ng Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Nguy ễn Đắc Trung (dactrung69@gmail.com) Ngày nh ận bài: 31/10/2017; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 10/01/2018 Ngày bài báo được đă ng: 24/01/2018 32
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 ĐẶT V ẤN ĐỀ trong m ột ph ản ứng PCR, nh ững k ỹ thu ật này cho độ nh ạy và độ đặc hi ệu cao trong Có nhi ều tác nhân đường ru ột gây tiêu phát hi ện các ch ủng E. coli gây tiêu ch ảy ch ảy đã được ghi nh ận nh ư virut, vi khu ẩn, ở ng ười [1, 2, 5, 6, 8]. Vi ệc xác định các ký sinh trùng. Trong s ố các vi khu ẩn, ch ủng E. coli gây tiêu ch ảy t ại B ệnh vi ện nhóm E. coli gây tiêu ch ảy th ường g ặp Trung ươ ng Thái Nguyên m ới ch ỉ d ựa hơn c ả ở các n ước đang phát tri ển [4]. trên th ử nghi ệm hóa sinh. Vì v ậy, ch ưa Dựa trên đặc điểm độc l ực, các ch ủng th ể kh ẳng định ch ắc ch ắn nh ững ch ủng vi E. coli gây tiêu ch ảy ở ng ười được phân khu ẩn này có th ực s ự gây tiêu ch ảy, thành nhóm STEC (shiga toxin producing mang gen độc l ực hay không?. Đề tài E. coli ), ETEC (enterotoxigenic E. coli ), được th ực hi ện nh ằm m ục tiêu: Phát hi ện EPEC (enteropathogenic E. coli ), EIEC gen độc l ực eae, sxt và ipaH ở các ch ủng (enteroinvasive E. coli ), EHEC E. coli phân l ập t ừ BN b ị tiêu ch ảy b ằng (enterohemorrhagic E. coli ), EaggEC ph ản ứng multiplex-PCR. (enteroaggregative E. coli ) và DAEC (diffusely adherent E. coli ) [7]. Nh ững ĐỐI T ƯỢNG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP bệnh lý tiêu ch ảy do E. coli có s ự ph ối NGHIÊN C ỨU hợp c ủa gen độc l ực khác nhau giúp cho vi khu ẩn g ắn bám, gi ải phóng y ếu t ố tan 1. Đối t ượng nghiên c ứu. máu và độc t ố ru ột. Có s ự khác bi ệt đáng 4 ch ủng E. coli chu ẩn qu ốc t ế do kể v ề trình t ự và đa hình thái trong tính Phòng Vi khu ẩn Đường ru ột, Vi ện V ệ sinh đồng nh ất phân t ử c ủa gen mã hóa cho Dịch t ễ Trung ươ ng cung c ấp, g ồm: các y ếu t ố độc l ực này. Trong s ố các gen EPEC, EHEC, EIEC và EC (EC là ch ủng độc l ực c ủa nhóm E. coli gây tiêu ch ảy đối ch ứng không có gen độc l ực). ph ải k ể đến ipaH - m ột gen n ằm trên 23 ch ủng E. coli phân l ập được t ừ BN nhi ễm s ắc th ể và plasmid, mã hóa cho tiêu ch ảy điều tr ị t ại B ệnh vi ện Trung một kháng nguyên 60 kDa và phát hi ện ở ươ ng Thái Nguyên t ừ tháng 01 đến tháng các ch ủng EIEC; gen nhi ễm s ắc th ể eae 6 - 2017. (E. coli attaching and effacing) mã hoá 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. cho m ột protein màng ngoài có tr ọng lượng phân t ử 94 - 97 kDa, được g ọi là Các ch ủng vi khu ẩn E. coli được phân intimin, protein này đóng vai trò quan lập và định danh trên h ệ th ống máy t ự tr ọng trong định v ị vi khu ẩn ở ru ột. Intimin động Vitek 2 compact 60. Các ch ủng gây t ổn th ươ ng d ạng bám dính và phá chu ẩn E. coli và E. coli phân l ập t ừ b ệnh hu ỷ ở đại tràng do vi khu ẩn bám ch ặt vào ph ẩm lâm sàng được nuôi c ấy qua đêm tế bào bi ểu mô. Gen eae hi ện di ện ở t ất trên môi tr ường th ạch MPA, thu khu ẩn cả các ch ủng EPEC, EHEC; các ch ủng lạc. Tách tr ực ti ếp ADN t ổng s ố t ừ khu ẩn EHEC còn t ạo ra cytotoxin, còn g ọi là độc lạc theo ph ươ ng pháp c ủa Cebula và CS tố Shiga sxt (Shiga toxins). K ỹ thu ật [3]. Khu ếch đạ i gen độ c l ực eae , stx và multiplex-PCR được phát tri ển để phát ipaH c ủa ch ủng E. coli b ằng ph ản ứng hi ện đồng th ời vài gen độc l ực c ủa E. coli PCR và multiplex-PCR v ới m ồi đặ c hi ệu 33
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 cho gen eae 376 bp là 5’-CACACGAA- đại m ột b ăng ADN có kích th ước 376 bp TAAACTGACTAAAATG-3’, gen stx 298 bp: ở các ch ủng: EPEC và EHEC. Các ch ủng 5’-ACCGTTTTTCAGATTTTGCACATA-3’ EIEC và EC s ẽ cho k ết qu ả âm tính do và gen ipaH 620 bp: 5’- genome c ủa chúng không ch ứa gen này. GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACC G-3’. H ỗn h ợp PCR mix (Hãng Thermo Scientific) cho ph ản ứng multiplex-PCR gồm: 200 µM c ủa m ỗi lo ại dNTP; 2,5 mM MgCI2; 0,2 pmol c ủa m ỗi lo ại ADN m ồi; 1 U Taq ADN polymerase và 1x đệm PCR (20 mM Tris-HCI, pH 8,4, 50 mM KCI), b ổ sung n ước kh ử ion t ới th ể tích 25 µl. Trên hệ th ống luân nhi ệt BioRad, th ực hi ện ph ản ứng PCR v ới chu trình nhi ệt: 3 phút bi ến tính ở 94 0C, 30 chu k ỳ (94 0C/1 phút; 52 0C/1 phút; 72 0C/1 phút), chu k ỳ t ổng hợp cu ối cùng ở 72 0C/10 phút; chu trình nhi ệt ph ản ứng multiplex-PCR: 3 phút Hình 1: K ết qu ả khu ếch đạ i gen eae ở bi ến tính ở 94 0C, 35 chu k ỳ (94 0C/1 phút; các ch ủng chu ẩn E. coli. 52 0C/1 phút; 72 0C/1 phút), chu k ỳ t ổng hợp cu ối cùng ở 72 0C/10 phút. Ki ểm tra (M: Marker ФX 174 c ắt b ằng Hae III; hi ệu qu ả quá trình khu ếch đại và kích 1: EPEC; 2: EIEC; 3: EHEC; 4: EC) th ước s ản ph ẩm PCR trên gel agarose Phân tích k ết qu ả điện di cho th ấy 1,5% trong dung d ịch đệ m TAE 1x, phân đoạn ADN khu ếch đạ i có kích th ước nhu ộm gel b ằng ethidium bromide và kho ảng 376 bp là gen eae, hoàn toàn phù ch ụp ảnh gel b ằng h ệ th ống ghi và phân hợp v ới tính toán lý thuy ết. Các ch ủng tích gel BioDoc. EPEC, EHEC đều cho k ết qu ả dươ ng tính, các ch ủng EIEC và EC đều âm, k ết KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU VÀ qu ả thu được hoàn toàn phù h ợp v ới BÀN LU ẬN nghiên c ứu đã công b ố [1, 5, 6, 8]. Nh ư 1. K ết qu ả khu ếch đại các gen độc vậy, n ếu s ử d ụng gen eae làm ch ỉ th ị lực ở ch ủng chu ẩn E. coli bằng ph ản phân t ử để ch ẩn đoán, tuy không phân ứng PCR. bi ệt được E. coli đó thu ộc nhóm nào trong * Gen độc l ực eae: các ch ủng EPECvà EHEC nh ưng có ý Trên c ơ s ở nghiên c ứu trình t ự c ủa ngh ĩa quan tr ọng để nh ận bi ết đó là gen eae đã công b ố trên Ngân hàng Gen E. coli gây b ệnh ch ứ không ph ải E. coli qu ốc t ế, c ặp m ồi đặ c hi ệu thi ết k ế nh ằm thông th ường. khu ếch đạ i gen này b ằng k ỹ thu ật PCR. * Gen độc l ực stx: Theo tính toán lý thuy ết, vi ệc s ử d ụng c ặp Các ch ủng thu ộc E. coli nhóm EHEC mồi eae cho ph ản ứng PCR s ẽ khu ếch sinh ra độc t ố cytotoxin hay Shiga toxin 34
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 (stx ). Stx là m ột protein có tính kháng kho ảng 620 bp [5, 6, 8]. Trên c ơ s ở đó, nguyên m ạnh, mang tính ch ất c ủa m ột cặp m ồi IpaH đã được l ựa ch ọn thi ết k ế ngo ại độ c t ố, có các gen mã hoá n ằm trên để khu ếch đạ i gen này b ằng ph ản ứng nhi ễm s ắc th ể. PCR. Hình 3: Kết qu ả khu ếch đạ i gen ipaH ở Hình 2: Kết qu ả khu ếch đạ i gen stx ở các các ch ủng chu ẩn E. coli. ch ủng chu ẩn E. coli. (M: Marker ФX 174 c ắt b ằng Hae III; (M: Marker ФX 174 c ắt b ằng Hae III; 1: EPEC; 2: EIEC; 3: EHEC; 4: EC) 1: EPEC; 2: EHEC; 3: EIEC; 4: EC) Kết qu ả điện di sau ph ản ứng PCR Trên hình ảnh điện di cho th ấy b ăng cho th ấy m ột b ăng ADN có kích th ước ADN khu ếch đạ i có kích th ước kho ảng kho ảng 620 bp được tìm th ấy ở ch ủng 298 bp và ch ỉ xu ất hi ện ở ch ủng EHEC EIEC ( đường s ố 2); các b ăng ADN có (đường s ố 2), các ch ủng còn l ại (EPEC, kích th ước t ươ ng t ự không th ấy xu ất hi ện EIEC và EC) không mang gen này. K ết ở ch ủng EPEC ( đường 1), EHEC ( đường qu ả này hoàn toàn phù h ợp v ới tính toán 3) và EC ( đường 4). Do đó, gen này có lý thuy ết. th ể s ử d ụng là marker chu ẩn cho nh ận * Gen độc l ực ipaH: di ện ch ủng EIEC. EIEC là nhóm E. coli gây b ệnh b ằng Bảng 1: Kết qu ả khu ếch đạ i gen độ c cơ ch ế xâm nh ập vào t ế bào bi ểu mô c ủa lực các ch ủng chu ẩn E. coli b ằng ph ản niêm m ạc đạ i tràng. Các gen mã hoá cho ứng PCR. yếu t ố liên quan đến quá trình này n ằm trên c ả plasmid và nhi ễm s ắc th ể. Nh ững Ch ủng Gen plasmid ch ứa m ột s ố gen mã hoá cho EPEC EHEC EIEC EC protein c ần thi ết c ủa quá trình xâm nh ập eae (376 bp) + + - - gồm IpaA , IpaB , IpaC , IpaD và IpaH . stx (298 bp) - + - - Trong đó, IpaH là gen ch ỉ có ở E. coli thu ộc nhóm EIEC, gen này có kích th ước ipaH (620 bp) - - + - 35
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 Bằng vi ệc s ử d ụng các c ặp m ồi đặ c đã s ử d ụng để khu ếch đạ i đồ ng th ời các hi ệu, thông qua ph ản ứng PCR, nhóm gen eae , stx và ipaH có trong ADN khuôn nghiên c ứu đã phát hi ện được m ột s ố gen tách tr ực ti ếp t ừ khu ẩn l ạc c ủa ch ủng độc l ực trong ADN tách tr ực ti ếp t ừ khu ẩn EPEC, EHEC và EIEC. Điều này c ũng có lạc các ch ủng chu ẩn E. coli . Qua b ảng 1 ngh ĩa có th ể xác đị nh được t ừng ch ủng cho th ấy gen eae được tìm th ấy ở ch ủng E. coli gây tiêu ch ảy k ể trên ch ỉ b ằng m ột EPEC và EHEC, gen stx ch ỉ xu ất hi ện ở ph ản ứng PCR, giúp kh ắc ph ục được h ạn ch ủng EHEC và ch ỉ có ch ủng EIEC mang ch ế c ủa các ph ản ứng PCR s ử d ụng c ặp gen ipaH, ch ủng E. coli thông th ường mồi riêng l ẻ. không mang gen độc l ực. K ết qu ả thu được c ũng phù h ợp v ới nh ững nghiên cứu đã công b ố trên th ế gi ới và ở Vi ệt Nam [1, 2, 5, 6, 8]. Nh ư v ậy, có th ể s ử dụng các gen độ c l ực eae , stx và ipaH nh ư ch ỉ th ị phân t ử để phát hi ện ch ủng E. coli gây tiêu ch ảy. N ếu k ết qu ả ph ản ứng PCR phát hi ện được duy nh ất gen eae s ẽ cho ch ủng E. coli thuộc nhóm EPEC, duy nh ất gen ipaH đó là ch ủng E. coli nhóm EIEC, phát hi ện đồ ng th ời hai gen eae và ipaH, ch ứng t ỏ ch ủng E. coli thu ộc nhóm EHEC. Hình 4: Kết qu ả khu ếch đại gen độc l ực 2. K ết qu ả khu ếch đại gen độc l ực ở bằng ph ản ứng multiplex-PCR. các ch ủng chu ẩn E. coli bằng ph ản (1: EHEC; 2: EIEC; 3: EPEC; M: Marker ứng multiplex-PCR. ФX 174 c ắt b ằng Hae III) Đối v ới ph ản ứng PCR, để phát hi ện được 3 ch ủng E. coli gây tiêu ch ảy Từ k ết qu ả điện di s ản phẩm c ủa ph ản (EPEC, EHEC và EIEC), c ần th ực hi ện ứng multiplex-PCR cho th ấy, trên các một lo ạt ph ản ứng PCR khác nhau v ới đường ch ạy đề u xu ất hi ện b ăng ADN khá nh ững c ặp m ồi t ươ ng ứng đặ c hi ệu cho rõ, không có s ản ph ẩm ph ụ. T ại đường từng ch ủng vi khu ẩn. V ới cách th ức này, ch ạy s ố 1 (EHEC), thu được 2 b ăng ADN tuy ph ản ứng PCR cho k ết qu ả có độ có kích th ước khác nhau, đố i chi ếu v ới chính xác cao, nh ưng đây ch ưa th ể coi là ADN marker chu ẩn, m ột b ăng có kích ph ươ ng pháp t ối ưu, vì v ẫn t ốn nhi ều th ời th ước kho ảng 298 bp (gen stx ), b ăng còn gian và hoá ch ất, đó c ũng chính là h ạn lại có kích th ước kho ảng 376 bp (gen ch ế c ủa ph ản ứng PCR s ử d ụng c ặp m ồi eae ). T ại đường ch ạy s ố 2 (EIEC) và s ố 3 đơ n l ẻ. Để tìm ra m ột ph ươ ng pháp t ối ưu (EPEC), ch ỉ thu được m ột b ăng ADN duy hơn, k ỹ thu ật multiplex-PCR được l ựa nh ất v ới kích th ước l ần l ượt kho ảng 620 ch ọn trong nghiên c ứu, ch ỉ v ới m ột ph ản bp (gen ipaH ) và 376 bp (gen eae ). K ết ứng multiplex-PCR, 3 c ặp m ồi đặ c hi ệu qu ả c ủa chúng tôi hoàn toàn phù h ợp v ới 36
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 tính toán lý thuy ết c ũng nh ư v ới nh ững còn l ại không tìm th ấy 3 gen độc l ực đã công b ố c ủa m ột s ố tác gi ả khác trên th ế kh ảo sát, điều này có th ể lý gi ải ho ặc đây gi ới và Vi ệt Nam [1, 2, 5, 6, 8]. Nh ư v ậy, có th ể là ch ủng E. coli thu ộc nhóm EAEC, có th ể kh ẳng đị nh, nhóm nghiên c ứu đã ETEC, STEC mà gen độc l ực c ủa nh ững th ực hi ện thành công k ỹ thu ật multiplex- ch ủng ch ưa được l ựa ch ọn để phát hi ện PCR v ới 3 c ặp m ồi đặ c hi ệu để xác đị nh trong nghiên c ứu ho ặc ch ủng vi khu ẩn gen độc l ực giúp ch ẩn đoán nhanh này là E. coli thông th ường ở đường ru ột, 3 ch ủng E. coli gây tiêu ch ảy là EPEC, không gây tiêu ch ảy. EHEC và EIEC. KẾT LU ẬN 3. K ết qu ả ch ẩn đoán ch ủng E. coli gây tiêu ch ảy ở BN b ằng k ỹ thu ật - Khu ếch đại thành công gen độc l ực multiplex-PCR. eae , sxt và ipaH ở ch ủng chu ẩn EPEC, EIEC và EHEC b ằng ph ản ứng PCR và Sau khi th ực hi ện thành công multiplex-PCR. ph ản ứng multiplex-PCR để phát hi ện gen độc l ực eae , stx và ipaH ở ch ủng E. coli - B ằng ph ản ứng multiplex-PCR, đã chu ẩn qu ốc t ế, nhóm nghiên c ứu đã ti ến xác định được 9/23 ch ủng E. coli phân hành ph ản ứng muliplex-PCR có s ử d ụng lập t ừ BN tiêu ch ảy có mang gen độc l ực. cặp m ồi t ươ ng t ự để xác đị nh xem nh ững Trong đó 2 ch ủng vi khu ẩn thu ộc nhóm ch ủng E. coli phân l ập t ừ BN tiêu ch ảy EPEC (mang gen eae ), 4 ch ủng thu ộc trên lâm sàng có mang gen độc l ực k ể nhóm EIEC (mang gen sxt ) và 3 ch ủng trên hay không?. Kết qu ả cho th ấy m ột s ố thu ộc nhóm EHEC (mang đồng th ời gen eae và sxt ). ch ủng E. coli phân l ập t ừ BN có mang gen độc l ực. TÀI LI ỆU THAM KH ẢO Bảng 2: K ết qu ả ch ẩn đoán E. coli gây 1. Nguy ễn V ũ Trung, Lê Huy Chính, Lê tiêu ch ảy b ằng ph ản ứng multiplex-PCR. Văn Ph ủng, Andrej Weintraub. Phát tri ển và ứng d ụng k ỹ thu ật PCR đa m ồi trong ch ẩn eae sxt ipaH Số Ch ẩn đoán đoán E. coli gây tiêu ch ảy t ừ phân. T ạp chí ch ủng E.coli Nghiên c ứu Y h ọc. 2003, tr.7-14. + - - 2 EPEC 2. Bui T.H, Flemming S, Phung D.C, - - + 4 EIEC Oralak S, Tran T.H, Tran M.T, Anders D. + + - 3 EHEC Diarrheagenic Escherichia coli and Shigella strains isolated from children in a hospital - - - 14 Ch ưa xác định case-control study in Hanoi, Vietnam. Journal Trong t ổng s ố 23 ch ủng E. coli phân of Clinical Microbiology. 2008, 46 (3), pp.996- 1004. lập t ừ BN tiêu ch ảy trên lâm sàng, ph ản ứng multiplex-PCR ch ỉ phát hi ện được 3. Cebula T.A, Payne W.L, Fegn P . Simulataneous identification of strains of 9 ch ủng vi khu ẩn mang gen độc l ực eae , Escherichia coli serotype O157:H7 and their stx và ipaH . Nh ững ch ủng vi khu ẩn này Shiga -like toxin type by mismatch thu ộc nhóm EPEC, EIEC và EHEC có amplification mutation assay multiplex-PCR. J kh ả n ăng gây tiêu ch ảy. 14 ch ủng E. coli Clin Microbiol. 1995, 33 (1), pp.248-250. 37
7. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 4. Davidson G, Barnes G, Bass D, Cohen coli in stool samples by using multiplex PCR M, Fasano A, Fontaine O, Guandalini S . technique. Asian Journal of Medical Sciences. Infectious diarrhea in children: working group 2010, 2 (5), pp.237-243. report of the First World Congress of Pediatric 7. Smith J.E, Fratamico P.M . Diarrhea- Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition. inducing Escherichia coli . In Foodborne J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2002, 35 (2), pathogens: microbiology and molecular pp.143-150. biology. Caister Academic Press, Norfolk, UK. 5. Jams P.N, Jams B.K. Diarrheagenic 2005, pp.357-382. Escherichia coli. Clilical Microbioly Review. 8. Tobias J, Vutukuru S.R . Simple and 1998, 11 (1), pp.142-210. rapid multiplex PCR for identification of the 6. Sehand K.A, Layla IFS. Identification of main human diarrheagenic Escherichia coli . different categories of diarrheagenic Escherichia Microbiol Res. 2012,167 (9), pp.564-570. 38