Ứng dụng kỹ thuật flow cytometry khảo sát tần suất xuất hiện kháng thể đồng loài kháng hồng cầu ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần tại viện huyết học - Truyền máu trung ương

Nội dung text: Ứng dụng kỹ thuật flow cytometry khảo sát tần suất xuất hiện kháng thể đồng loài kháng hồng cầu ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần tại viện huyết học - Truyền máu trung ương

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FLOW CYTOMETRY KHẢO SÁT TẦN SUẤT XUẤT HIỆN KHÁNG THỂ ĐỒNG LOÀI KHÁNG HỒNG CẦU Ở BỆNH NHÂN TRUYỀN MÁU NHIỀU LẦN TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƢƠNG Lê Xuân Hải* và CS TÓM TẮT Lần đầu tiên ở Việt Nam chúng tôi đã ứng dụng thành công kỹ thuật phân tích Flow Cytometry đơn màu để phát hiện kháng thể bất thường kháng hồng cầu. Khảo sát 261 bệnh nhân (BN) được truyền máu nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, chúng tôi thấy tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loại kháng hồng cầu là 42.15%. 100% BN được truyền máu trên 10 lần có kháng thể bất thường kháng hồng cầu. Tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loài chống hồng cầu ở BN nữ cao hơn nhiều so với BN nam và tỷ lệ thuận với tuổi và số lần nhận máu. * Từ khóa: Kỹ thuật Flow Cytometry; Kháng thể đồng loài; Truyền máu nhiều lần. APPLYING FLOW CYTOMETRY TO STUDY FREQUENCY OF APPEARANCE OF ALLOANTIBODY AGAINST RED BLOOD IN MULTIPLY TRANSFUSION PATIENTS AT NATIONAL INSTITUTE OF HEMATOLOGY AND BLOOD TRANSFUSION Summary It is the first time in Vietnam, an analysis technique based on flow cytometry has been applied successfully in dectecting alloantibodies against red blood cell in multiple transfusion patients. Study on 261 patients with multiple transfusions, we discovered that 42.15% of the objects had developed alloantibodies. Alloantibodies were detected in 100% of patients who have received transfusion more than 10 times. The incidence of alloantibodies detected in women patients was higher than that in men and closely related with age and times of transfusion. * Key words: Flow Cytometry technique; Alloantibodies; Multiple transfusions. ĐẶT VẤN ĐỀ có thể gây ra tai biến nghiêm trọng nếu không tuân thủ nguyên tắc về an toàn truyền Máu rất quan trọng và cần thiết cho sự máu. Phát hiện nhóm máu hệ ABO, Rh và sống, nhờ có truyền máu nhiều người bệnh các hệ nhóm máu hồng cầu khác đã giúp đã được cứu sống, nhưng truyền máu cũng việc truyền máu hiệu quả và an toàn hơn. * Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: TS. Nguyễn Đặng Dũng TS. Phạm Văn Trân 19
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Tại các nước tiên tiến, an toàn truyền máu qua đó, có thể chọn đơn vị máu phù hợp, được thực hiện một cách triệt để hòa hợp nhằm nâng cao hiệu quả của những lần về nhóm máu hệ ABO, Rh và một số nhóm truyền máu. Trong nghiên cứu này, chúng máu khác phải thực hiện sàng lọc kháng tôi ứng dụng kỹ thuật Flow Cytometry để: thể bất thường. Tại Việt Nam, thực hiện an Phát hiện tỷ lệ mang kháng thể miễn dịch toàn truyền máu về miễn dịch còn hạn chế. đồng loài kháng hồng cầu ở BN được Chúng ta mới chỉ định nhóm máu hệ ABO, truyền máu nhiều lần (≥ 2 lần). làm phản ứng chéo ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm mà chưa có điều kiện ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP quan tâm nghiên cứu tới các nhóm máu NGHIÊN CỨU khác ngoài ABO. Do vậy, ở BN được truyền 1. Đối tƣợng nghiên cứu. máu nhiều lần việc sinh kháng thể bất 261 BN được truyền máu nhiều lần tại thường là khó tránh khỏi. Về bản chất, các kháng thể gọi là “bất thường” là các kháng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, thể miễn dịch đồng loài (chủ yếu là kháng trong đó, 175 BN được chẩn đoán thalassaemia, thể lớp IgG) chống lại các kháng nguyên lạ 49 BN suy tủy xương, 37 BN xuất huyết giảm có trên bề mặt hồng cầu, bạch cầu (hệ tiểu cầu. Các BN này thỏa mãn những tiêu HLA) hoặc tiểu cầu (hệ HPA) của người chuẩn sau: cho. Có rất nhiều cách để phát hiện các - Được chẩn đoán là thalassaemia, suy kháng thể này với mức độ chính xác, độ tủy xương hoặc xuất huyết giảm tiểu cầu nhạy khác nhau. Các kỹ thuật này cũng theo tiêu chuẩn chẩn đoán của Viện Huyết khác nhau về độ phức tạp. Hiện nay, phát học - Truyền máu Trung ương. hiện kháng thể bất thường ở người truyền - Truyền máu nhiều lần (≥ 2 lần). máu nhiều lần mới chỉ chủ yếu tập trung - Lấy mẫu máu cho nghiên cứu sau lần vào kháng thể đồng loài kháng hồng cầu. truyền máu cuối cùng tối thiểu 2 tuần. Phương pháp truyền thống hay sử dụng là phương pháp huyết thanh học dựa trên 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. nguyên tắc phản ứng ngưng kết Coombs * Thiết kế nghiên cứu: lấy mẫu thuận tiện, gián tiếp. Phương pháp này tuy độ nhạy nghiên cứu mô tả cắt ngang. không cao, nhưng có ưu điểm là đơn giản, * Chuẩn bị bệnh phẩm: Lấy 4 ml máu giá rẻ nên dễ ứng dụng triển khai trên ngoại vi vào ống không chống đông, ly tâm diện rộng. Ngày nay, với sự phổ biến của tách huyết thanh và lưu trữ ở -600C cho tới phương pháp flow cytometry dựa trên khi làm thí nghiệm sàng lọc kháng thể đồng nguyên lý phân tích tự động phản ứng đặc loài kháng hồng cầu bằng phương pháp hiệu kháng nguyên-kháng thể có đánh dấu Flow Cytometry. huỳnh quang, các nghiên cứu phát hiện * Chuẩn bị hồng cầu nhóm O: lấy ngẫu kháng thể bất thường có thể thực hiện với nhiên 20 mẫu hồng cầu nhóm O (mỗi mẫu 2 độ nhạy cao hơn các phương pháp truyền ml) từ người cho máu tính nguyện. Ly tâm thống. Flow cytometry được ứng dụng trong lấy khối hồng cầu, từ mỗi khối hồng cầu O xác định các kháng thể đồng loài kháng pha thành huyền dịch hồng cầu 1%, trộn HLA [3], tiểu cầu [4] và hồng cầu [5, 6]. Việc pool 20 mẫu hồng cầu O thành huyền dịch phát hiện kháng thể bất thường ở BN được “pool 1% O”. Với cách chuẩn bị huyền dịch truyền máu nhiều lần rất cần thiết để đảm hồng cầu như vậy, mỗi mẫu hồng cầu O bảo an toàn truyền máu về mặt miễn dịch, ban đầu sẽ đại diện cho 5% trong “pool 1% O”. 21
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Do vậy, chúng tôi lấy ngưỡng dương tính là trong 20 phút, tránh ánh sáng. Thêm 1 ml 5% trên Flow Cytometry [6]. PBS, phân tích bằng chương trình “kháng * Phân tích phát hiện kháng thể kháng thể kháng hồng cầu” lập sẵn trong phần hồng cầu bằng Flow Cytometry: theo phương mềm CXP 2.0 ở máy Cytomics FC500. Lấy pháp được Won mô tả [6]; ủ 100 ul huyền ngưỡng âm tính là mẫu huyền dịch hồng dịch hồng cầu “pool 1% O” với 200 ul huyết cầu ủ với anti mouse IgG-FITC. thanh BN trong 45 phút ở 370C. Rửa 2 lần * Xử lý số liệu: bằng phương pháp thống bằng PBS, tái tạo huyền dịch cặn tế bào kê y học sử dụng thuật toán 2 test (Chi trong 100 ul PBS. Tiếp tục ủ với 5 ul anti- test). human IgG-FITC (Beckman Coulter, Mỹ) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Chƣơng trình và kết quả phân tích. Dùng phần mềm CXP cytometer 2.2 có sẵn trên máy Cytomics FC500, lập chương trình phân tích kháng thể bất thường trên hồng cầu với các bước phân tích sau: - Thiết lập đồ hình thông số FS line Vs SS line, chọn khoanh vùng đại diện nhất của hồng cầu là vùng E (hình 1A). - Thiết lập chế độ phân tích đơn màu cho kháng thể anti-human IgG-FITC theo kênh huỳnh quang -FL1 log và xác lập điện thế để chỉnh ngưỡng cut off về mức 100 (hình 1B). Với mức POS ≥ 5% được coi là mẫu dương tính [6]. Hình 1: Minh họa một trường hợp dương tính với kháng thể miễn dịch đồng loài kháng hồng cầu ở BN truyền máu > 10 lần. (A) Khoanh vùng phân tích ở vùng quần thể hồng cầu đại diện (vùng E). (B) Phân tích trên vùng E thấy 77,4% quần thể có biểu hiện dương tính với anti-human IgG-FITC, chứng tỏ có tồn tại kháng thể miễn dịch đồng lớp IgG bám trên bề mặt hồng cầu, nói cách khác mẫu huyết thanh của BN có kháng thể “bất thường” kháng hồng cầu thử. 22
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Chúng tôi đã thiết lập được chương trình (1) (2) (3) (4) phân tích và sử dụng chương trình này Xuất huyết phân tích các mẫu huyết thanh BN đã được 37 15 40,54 giảm tiểu cầu lưu trữ. Trong 261 mẫu phân tích, mẫu phát hiện dương tính thấp nhất thu được là 5,2% Cộng chung 261 110 42,15 và mẫu phát hiện dương tính cao nhất thu Chi test: p 0,454 được là 97,8%. 2. Đặc điểm kháng thể đồng loài lớp Nhóm bệnh thalassemia có tỷ lệ bắt gặp IgG kháng hồng cầu ở BN truyền máu cao nhất (44,57%), sau đó là nhóm xuất nhiều lần. huyết giảm tiểu cầu (40,54%). Nhóm suy * Tỷ lệ kháng thể đồng loài kháng hồng tủy xương có tỷ lệ bắt gặp thấp nhất cầu (%) ở BN truyền máu nhiều lần: (34,69%). Sở dĩ tỷ lệ này thấp do trong suy Số mẫu nghiên cứu: 261; số mẫu dương tủy xương, các tế bào dòng lympho cũng tính: 110. Kết quả nghiên cứu của chúng giảm nên khả năng đáp ứng miễn dịch tiết tôi (42,15%) cao hơn nhiều so với của kháng thể cũng giảm. Nguyễn Thị Thanh Mai (2005: 27,4%) [2] và Bùi Mai An (2006: 9,8%) [1]. Điều này là Bảng 2: Một số yếu tố liên quan đến tỷ lệ do chúng tôi sử dụng phương pháp Flow xuất hiện kháng thể đồng loại kháng hồng Cytometry để phát hiện kháng thể đồng loài cầu ở BN thalassaemia. có mặt, trong khi các tác giả khác dùng SỐ MẪU phương pháp ngưng kết thông qua phản SỐ MẪU CÓ KHÁNG TỶ LỆ GIỚI NGHIÊN THỂ ĐỒNG LOẠI (%) ứng Coomb gián tiếp. Flow Cytometry là CỨU KHÁNG HỒNG CẦU phương pháp phân tích lượng lớn cho kết quả chính xác, có độ nhạy cao hơn rất Nam 135 49 36,30 nhiều so với phản ứng Coomb gián tiếp, Nữ 126 61 48,41 chính vì vậy Fow Cytometry có thể phát hiện được kháng thể ở cả những trường Cộng chung 261 110 42,15 hợp không phát hiện được bằng phương Chi test: p = 0,047 pháp huyết thanh học thông thường [3, 4]. 3. Tỷ lệ kháng thể đồng loài liên quan Tỷ lệ gặp kháng thể đồng loài kháng đến tuổi, giới, chẩn đoán lâm sàng và số hồng cầu lớp IgG ở nữ cao hơn ở nam có ý lần truyền máu. nghĩa thống kê (p < 0,05) khi so sánh bằng Bảng 1: Tỷ lệ gặp kháng thể đồng loài thuật toán 2, phù hợp với nhận xét của kháng hồng cầu (%) ở BN truyền máu nhiều Bùi Mai An [1], Nguyễn Thị Thanh Mai [2] lần theo chẩn đoán lâm sàng. khi nghiên cứu về kháng thể bất thường SỐ MẪU CÓ SỐ MẪU KHÁNG THỂ TỶ LỆ kháng hồng cầu ở BN truyền máu nhiều ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN ĐỒNG LOẠI (%) CỨU lần. Sở dĩ có sự chênh lệch như vậy là do ở KHÁNG HỒNG CẦU nữ, ngoài yếu tố truyền máu, kháng thể Thalassaemia 175 78 44,57 kháng đồng loài kháng hồng cầu lớp IgG Suy tủy xương 49 17 34,69 xuất hiện do quá trình chửa đẻ. 23
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Bảng 3: Tỷ lệ xuất hiện kháng thể đồng thường ở những BN truyền máu từ 5 - 10 loại kháng hồng cầu liên quan đến tuổi. lần là 70%, trong khi đó ở các BN mới được SỐ MẪU SỐ MẪU CÓ KHÁNG truyền máu 2 lần là 11,34%. Tỷ lệ bắt gặp TỶ LỆ NHÓM TUỔI NGHIÊN THỂ ĐỒNG LOẠI (%) CỨU KHÁNG HỒNG CẦU kháng thể bất thường tăng lên theo số lần 10 - 20 29 9 31,03 truyền máu, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) bằng Chi test. 21 - 40 98 30 34,69 KẾT LUẬN 41 - 60 73 34 41,10 Với phần mềm CXP Cytometer 2.2, chúng > 60 61 367 60,66 tôi đã thiết lập được chương trình phân tích Tổng 261 110 42,15 trên máy Flow Cytometry Cytomics FC500 Chi test: p = 0,006 để phát hiện kháng thể đồng loại lớp IgG Nhóm BN > 60 tuổi, tỷ lệ kháng thể đồng kháng hồng cầu trong huyết thanh BN được loài kháng hồng cầu cao nhất (66,66%), truyền máu nhiều lần. sau đó đến nhóm 41 - 60 tuổi (41,10%). Qua sàng lọc kháng thể kháng hồng cầu Ở nhóm tuổi 10 - 20 và 21 - 41, tỷ lệ bắt trong huyết thanh của 261 BN truyền máu gặp kháng thể bất thường tương ứng là 31,03% và 34,69%. Nhận xét này phù hợp nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu với kết quả của Bùi Thị Mai An [1]. Sự khác Trung ương chúng tôi thấy: biệt về tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loại - Tỷ lệ phát hiện kháng thể đồng loài lớp kháng hồng cầu giữa các nhóm tuổi là rõ IgG kháng hồng cầu bằng kỹ thuật Flow rệt, có ý nghĩa thống kê, với p < 0,05 khi so sánh bằng thuật toán Chi test. Cytometry ở BN truyền máu nhiều lần là 42,15%. Bảng 4: Tỷ lệ xuất hiện kháng thể đồng loại kháng hồng cầu liên quan đến số lần - Tỷ lệ bắt gặp kháng thể rất cao ở nhóm truyền máu. được truyền máu > 5 lần (70% ở nhóm SỐ MẪU SỐ MẪU CÓ KHÁNG truyền máu 5 - 10 lần), 100% ở nhóm được SỐ LẦN TỶ LỆ NGHIÊN THỂ ĐỒNG LOẠI NHẬN MÁU (%) CỨU KHÁNG HỒNG CẦU truyền máu > 10 lần. 2 lần 95 17 11,34 - Tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loại 3 - 5 lần 107 46 42,99 chống hồng cầu ở BN truyền máu nhiều lần 5 - 10 lần 40 28 70,00 ở nữ cao hơn ở nam và tỷ lệ thuận với tuổi và số lần nhận máu. > 10 lần 19 19 100,00 TÀI LIỆU THAM KHẢO Céng chung 261 110 42,15 -13 Chi test: p = (2,479) 1. Bùi Thị Mai An, Bạch Quốc Khánh, Hoàng 100% BN truyền máu > 10 lần có kháng Thị Thanh Nga, Hoàng Nhật Lệ và CS. Nghiên thể bất thường. Tỷ lệ bắt gặp kháng thể bất cứu sàng lọc kháng thể bất thường hệ hồng cầu 24
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 ở BN bị bệnh máu tại Viện Huyết học - Truyền 4. Scornik JC. Detection of alloantibodies by máu Trung ương (2009 - 2010). Y học Việt Nam. flow cytometry: relevance to clinical transplantation. Cytometry. 1995, 22 (4), pp.259-263. 2010, số 2, tập 373, tr.409-413. 5. Stussi G, Huggel K, Lutz HU, Schanz U, 2. Nguyễn Thị Thanh Mai. Nghiên cứu các Rieben R, Seebach JD. Iso-type-specific detection kháng thể bất thường kháng hồng cầu ở một số of ABO blood group antibodies using a novel đối tượng tại Bệnh viện Chợ Rẫy. Y học thực flow cytometric method. Br J Haematol. 2005.130, pp.954-963. hành. 2005, số 5, tập 228, tr.14-15. 6. Won DI, Jung OJ, Lee YS, Kim SG, Suh 3. Robert AB, Howard MG, Thomas ME. Flow JS. (2010). Flow cytometry antibody screening cytometric assessment of HLA alloantibodies. 2006. using pooled red cells. Cytometry B Clin. Cytom. 2010, 78 (2), pp.96-104. Ngày nhận bài: 23/11/2012 Ngày giao phản biện: 5/1/2013 Ngày giao bản thảo in: 6/2/2013 25
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 26