Tổng quan: Các hệ thống vector adenovirus trong nghiên cứu liệu pháp gen

Nội dung text: Tổng quan: Các hệ thống vector adenovirus trong nghiên cứu liệu pháp gen

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 TỔNG QUAN: CÁC HỆ THỐNG VECTOR ADENOVIRUS TRONG NGHIÊN CỨU LIỆU PHÁP GEN Hoàng Quốc Trường*; Hồ Anh Sơn** Dương Thuận Thiên***; Nguyễn Lĩnh Toàn** TÓM TẮT Adenovirus vector được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về liệu pháp gen, vắc xin virut tái tổ hợp và trong nghiên cứu cơ bản. Adenovirus vector được sử dụng để chuyển trở các gen trị liệu vào tế bào (TB) bệnh để phục hồi chức năng bị mất của một số gen, tăng cường hệ thống miễn dịch của vật chủ, hoặc làm tăng tính nhạy cảm của TB ung thư với thuốc hóa trị liệu. Một số hệ thống vector adenovirus đã được nghiên cứu phát triển, bao gồm: thế hệ vector đầu tiên là những vector được xóa bỏ các gen E1a và E1b, thế hệ vector thứ hai là những vector được xóa bỏ vùng gen E1 và các gen khác của virut, helper-dependent adenovirus vector được thiết kế xóa bỏ tất cả các trình tự mang mã hóa cho protein của virut. Thế hệ vector thứ nhất và thứ hai thiết kế và sản xuất tương đối dễ dàng. Thế hệ vector thứ ba ưu việt hơn cả so với bất kỳ hệ thống adenovirus nào khác do hiệu suất biểu hiện và thời gian biểu hiện lâu dài của gen chuyển đạt được trong nghiên cứu in vivo. Bài tổng quan này thảo luận những ưu điểm và hạn chế của vector adenovirus để phát triển các hệ vector ưu việt hơn cho những nghiên cứu về gen trị liệu trong tương lai. * Từ khóa: Adenovirus; Liệu pháp gen; Vector. REVIEW: ADENOVIRAL VECTOR SYSTEMS FOR GENE THERAPY summary Adenoviral (Ad) vectors are widely used in gene therapies, recombinant viral vaccine, and basic science studies. The vectors can deliver therapeutic genes into cells to recover lost function of some genes, to enhance the ability of host immune systems, or to increase the sensitivity of cancer cells to chemotherapeutic drugs. Several adenoviral vector systems have been developed: first-generation vectors are those with deletion of the E1a and E1b genes, second-generation vectors with deletions of the E1 and another viral gene, and helper- dependent adenovirus vectors removed all coding sequences for viral proteins. The first- and second-generation vectors are relatively easy to construct and produce. The helper-dependent adenovirus vectors are substantially superior to any other adenoviral systems for achieving high-level and longterm expression in vivo. This review focuses on the advantages and limitations of adenovirus vectors and discusses potential strategies for further improvement of vectors for gene therapy. * Key words: Adenovirus; Gene therapies; Vectors. * Bệnh viện TWQ§ 108 ** Học viện Quân y *** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Hoàng Quốc Trường (hqtruong2002@yahoo.com) Ngày nhận bài: 16/01/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 04/04/2014 Ngày bài báo được đăng: 07/04/2014 1
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 ®Æt vÊn ®Ò ứng viên số một để biểu hiện và chuyên chở các gen trị liệu đến TB đích với phạm Adenovirus được Rowe và CS phát vi rộng. hiện từ 1/2 thế kỷ trước qua các thí nghiệm nuôi cấy virut phân lập từ vùng vòm họng [1]. Mặc dù adenovirus gây các bệnh về đường hô hấp, mắt và đường tiêu hóa, nhưng virut này đã được tập trung nghiên cứu trong nhiều năm như một mô hình để tìm hiểu các cơ chế sinh học của TB có nhân bậc cao, bao gồm: quá trình phiên mã, xử lý ARN, khuếch đại ADN, dịch mã và cơ chế bệnh sinh ung Hình 1: Cấu trúc của adenovirus: A) Cấu thư. Adenovirus thuộc họ adenoviridae với trúc mô phỏng của adenovirus dựa trên 51 kiểu huyết thanh, được chia thành sáu sự hiểu biết về thành phần polypeptide và nhóm (từ A - F) dựa trên trình tự tương ADN. B) Ảnh chụp kính hiển vi điện tử đồng và khả năng ngưng kết TB hồng cầu của adenovirus [3]. người [2]. Hệ gen của adenovirus là chuỗi đôi có kích thước 36 Kb. Ở hai đầu tận Chu kú nh©n lªn cña cùng của hệ gen là hai trình tự lặp tận adenovirus cùng đảo ngược (ITR - inverted terminal repeat) với kích thước từ 100 - 400 bp, 1. Bám và xâm nhập vào bên trong TB. liên kết với protein kết thúc (TP - terminal protein) bằng liên kết hóa trị. Về hình thái, Trong tất cả các nhóm, loại trừ adenovirus adenovirus có vỏ và protein cấu trúc bao nhóm B, hạt virut ban đầu bám vào bề bọc hệ gen của virut với cấu trúc hình mặt TB thông qua liên kết của sợi Knob khối 20 mặt. Trên cấu trúc tiếp giáp giữa với thụ thể bề mặt TB tương thích cho hai mặt của vỏ có cấu trúc penton base coxsackie B virut [5] được gọi là thụ thể giữ vai trò neo giữ protein sợi (fibre coxsackie/adenovirus receptor (CAR). Đây protein) và làm cho virut bám dính với bề là một protein huyết tương màng có trọng mặt của TB. Mỗi mặt của vỏ virut bao lượng phân tử 46 kDa thuộc siêu họ gồm 03 protein hexon và các protein pIIIa, immunoglobulin, cấu trúc bao gồm các pVI, pVIII và pIX (hình 1). Protein VII, có domain bên ngoài màng TB, xuyên màng trình tự peptide nhỏ được gọi là mu [3], và domain trong TB chất [6], với phần liên kết chặt chẽ với ADN virut, trong khi domain ngoại bào cần thiết để liên kết protein V được đóng gói với phức hợp giữa virut với TB. CAR có chức năng như ADN-protein cung cấp liên kết cấu trúc phân tử liên kết TB với TB trên bề mặt với vỏ qua protein VI [4]. Các thành viên màng đáy của TB biểu mô [7]. Phân tử của họ adenovirus có khả năng lây nhiễm CD46, là protein điều hòa bổ trợ, được TB sau phân bào, thậm chí cả mô biệt biết đến như một thụ thể TB cho adenovirus hóa cao như cơ vân, phổi, não và tim. Với nhóm B [8]. Sau khi bám dính với bề mặt khả năng vận chuyển hệ gen tới nhân và TB (hình 2), bộc lộ mô típ RGD trên penton hiệu quả khuếch đại cao, adenovirus là tương tác với họ protein αν integrin cho 2
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 phép virut vào bên trong TB theo cơ chế ứng giải phóng hạt virut (virions) vào bên phụ thuộc clathrin, thụ cảm thể qua trung trong TB chất theo cơ chế chưa được biết gian nhập bào [8]. Integrins hình thành họ rõ. Trong TB chất (hình 3), protein dynein lớn thụ cảm thể dimer dị hợp như integrin chuyên trở các hạt virions theo suốt vi ανβ3 và ανβ5, cả hai hỗ trợ cho adenovirus ống TB (microtubeles) tới nhân, tại đây xâm nhập vào bên trong TB, ανβ5 biểu chúng tiếp xúc với phức hệ lỗ nhân hiện ở TB biểu mô cuống phổi người, là vị (nuclear pore complex, NPC). Loại bỏ vỏ trí chính của quá trình lây nhiễm adenovirus capsid tại NPC cho phép hệ gen virut xâm in vivo [9]. Tương tác giữa virut với màng nhập và bắt đầu quá trình phiên mã. TB cảm ứng một loạt đường truyền tín hiệu như hoạt hóa con đường phosphoinositide- 3-OH kinase (PI-3k), kích hoạt họ protein Rho của GTPases và polymer hóa, tái tổ chức cấu trúc của actin thuận lợi cho quá trình nhập bào [10]. Hình 3: Mô phỏng vận chuyển vào trong Hình 2: Bám và xâm nhập TB của adenovirus: nhân TB của Ad2: Hạt virut Ad2 tập trung A) Tương tác giữa virut và thụ thể TB liên trên sợi TB chất của lỗ nhân bằng cách quan đến liên kết ái lực mạnh qua phần bám với phức hợp protein CAN/Nup214. nhô ra của sợi fibre. Thụ thể bề mặt TB Protein histone H1 giải phóng từ nhân và để adenovirus serotype 5 nhận biết tương bám vào protein hexon trên bề mặt gần tự như thụ thể nhận biết của coxsackie B nhất của vỏ capsid. Protein importin  virut và được đặt tên là thụ thể Coxsackie/ hình thành liên kết dimer với protein Adenovirus receptor (CAR). Sau khi tiếp importin 7 liên kết protein H1, cảm ứng xúc TB, B) Tương tác giữa penton base xâm nhập phức hệ H1-hexon và kích hoạt và αν integrin trên bề mặt TB cho phép tháo bỏ vỏ capsid. ADN virut được giải virut xâm nhập vào TB qua quá trình nhập phóng gần vị trí mở của lỗ nhân để bào [10]. chuyển vào trong nhân TB [10]. Sau 20 phút xâm nhập, con đường 2. Gen sớm và sao chép ADN. truyền tín hiệu Raf/mitogen hoạt hóa Chu kỳ lây nhiễm của adenovirus được protein kinase (MAPK) được kích hoạt và chia thành 2 pha: Pha “sớm” và “muộn” sản xuất IL-8 [11]. Đối với Ad2 và Ad5, do tương ứng trước và sau quá trình sao pH axit của thể nội bào (endosome) cảm chép ADN virut (hình 4). Pha sớm bao 3
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 gồm quá trình xâm nhập của virut vào Hình 4: Phiên mã hệ gen adenovirus. bên trong TB và vận chuyển hệ gen của virut vào trong nhân, tiếp đến là quá trình Protein E1A được biết đến qua cơ chế phiên mã và dịch mã lựa chọn của những tham gia vào quá trình kiểm soát chu trình gen “sớm”. Quá trình này thúc đẩy các chức của TB, E1A bám trực tiếp và ức chế các năng của TB, tạo điều kiện sao chép ADN thành phần tham gia kiểm soát chu kỳ virut, dẫn đến kết quả phiên mã và dịch của TB như cyclin-dependent kinase inhibitor mã các gen “muộn”. Điều này cũng dẫn p21. E1A còn tương tác với một số protein đến sự hình thành protein cấu trúc và vật chủ liên quan đến sự hình thành hình thành virut hoàn chỉnh. Pha sớm kéo cấu trúc chromatin như p400 và histone dài từ 6 - 8 giờ, trong khi pha muộn acetyltransferases (HATs) p300/CBP, pCAF thường diễn ra nhanh, thời gian tạo virut và TRRAP/GCN5. Giảm điều hòa chu kỳ từ 4 - 6 giờ sau đó. Vùng gen được phiên TB bởi E1A, kết quả làm tích lũy protein mã đầu tiên là E1A để tạo ra rất nhiều ức chế u p53 và biểu hiện của E1A trong mARN và protein bởi quá trình xử lý suốt quá trình lây nhiễm, thúc đẩy quá mARN khác nhau. Hai vùng gen phiên mã trình chết theo chương trình của TB làm E1A được tạo ra suốt quá trình lây nhiễm cho TB nhạy cảm với yếu tố hoại tử u sớm là: 13S mARN mã hóa cho 289R ( TNF - α) và TRAIL (TNF - related apoptosis - (R là ký hiệu cho các amino axit) protein inducing ligand) theo con đường truyền của virut Ad5 và 12S mARN mã hóa cho tín hiệu death receptor pathways. Sản 234R. Những protein này tồn tại vĩnh viễn phẩm mã hóa bởi E1B-19K có khả năng trong TB nuôi cấy, khi chúng biểu hiện và ngăn tín hiệu xúc tác cho cả hai đường kết hợp với protein E1B, gây hình thành truyền tín hiệu kể trên, ngăn TB chết theo khối u ở động vật gặm nhấm. Trong suốt chương trình. Trong trường hợp TNF-α quá trình xâm nhiễm, protein E1A có xúc tác quá trình apoptosis, protein E1B- chức năng tăng cường hoạt hóa mức độ phiên mã của các vùng gen khác như: 19K có thể bám trực tiếp với protein tiền E1B, E2, E3 và E4 và cảm ứng TB đi vào apoptotic như Bak và Bax để ngăn chặn pha S của chu kỳ TB, tạo môi trường tối ty thể xúc tác TB chết theo chương trình. ưu cho quá trình sao chép của virut. Bên cạnh chức năng ức chế TB chết theo chương trình, protein E1B-55K còn có vai trò vận chuyển mARN của virut đến TB chất trong suốt pha muộn của quá trình lây nhiễm. Vùng gen E2 mã hóa cho một số protein cần thiết cho quá trình nhân lên của hệ gen virut như: ADN polymerase, protein tiền kết thúc và protein với kích thước 72 kDa bám chuỗi đơn ADN. Những protein này là bắt buộc cho cơ chế nhân lên của virut, tiếp theo là quá trình sao chép của gen muộn, toàn bộ quá trình được xúc tác qua tương tác với các yếu tố nội bào. Sản phẩm vùng gen E3 của virut có thể loại bỏ cho mục đích 4
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 nhân lên của virut trong môi trường nuôi protein này ngăn chặn protein p53 xúc tác cấy mô, với vai trò phá vỡ đáp ứng miễn trans-activation bằng cách ức chế liên kết dịch của vật chủ. Hệ thống miễn dịch phát các yếu tố phiên mã nội bào p53. Với triển cơ chế tiêu diệt TB nhiễm virut, bao nhiều chức năng sinh học đã được liệt kê, gồm ly giải TB bởi TB lympho T gây độc protein E4orf3 xúc tác cho hình thành cấu và hoạt hóa thụ thể xúc tác con đường trúc nhân được gọi là PML oncogenic chết bào bởi chemokines. Protein E3- domains. Mặc dù chức năng của những gp19k hoạt động theo 2 cách để ngăn domain này chưa được biết rõ, nhưng các chặn trình diện của kháng nguyên virut số liệu nghiên cứu cho thấy vai trò quan bởi phức hợp hòa hợp mô tổ chức lớp I trọng của chúng trong chuyển dạng TB, (MHC class I), sau đó là ly giải TB bởi TB sao chép và chết theo chương trình ở TB T gây độc (cytotoxic T cells). E3-gp19k lây nhiễm virut. Phần lớn sản phẩm của lần đầu được phát hiện do khả năng ngăn vùng gen E4 đều có hoạt tính kháng chặn quá trình chuyển vị của phân tử apoptotic, riêng protein E4orf4 tương tác MHC lớp I tới bề mặt của TB bằng cách với phosphatase 2A thúc đẩy quá trình cô lập chúng trong mạng lưới nội chất. chết bào không phụ thuộc p53. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy E3- 3. Biểu hiện gen muộn và đóng gói gp19k liên kết với TAP (transporter associated virut. with antigen processing), là protein chịu Promoter muộn chính (MLP, major late trách nhiệm vận chuyển kháng nguyên promoter) phiên mã cho gen muộn của TB chất trong lòng ống, đây là protein ảnh adenovirus được biểu hiện từ 5 vùng gen hưởng trực tiếp đến tải lượng của peptide (L1 - L5). Đơn vị sao chép muộn chính trên phức hệ hòa hợp mô tổ chức lớp I (MLTU - The major late transcription unit) (MHC class I molecules). Các protein E3- mã hóa cho khoảng 15 - 20 mARN khác 10.4K, 14.5K và 14.7K có chức năng ức nhau, đều có nguồn gốc từ một tiền chế cảm ứng chết bào bởi chemokines mARN bởi quá trình cắt lối khác nhau và TNF-α Fas ligand (FasL) và TRAIL. polyadenylation. Những đơn vị phiên mã Vùng gen sao chép E4 mã hóa protein này ban đầu mã hóa cho protein cấu trúc (ký hiệu orfs 1-6/7), là các protein giữ vai của virut và protein khác tham gia vào trò điều khiển chu trình TB và chuyển quá trình đóng gói virut. Sự điều khiển dạng. Protein E4orf1 của Ad9 được của gen muộn mã hóa cho cấu trúc của chứng minh có khả năng cảm ứng hình lớp vỏ capsid đã được nghiên cứu phát thành ung thư vú phụ thuộc estrogens trên hiện như một chiến lược để thay đổi định chuột. Ở Ad2 và Ad5, E4orf3 và E4orf6 hướng của vector liệu pháp gen. Protein có hoạt tính rất đa dạng, cả hai protein L1-52/55k là bắt buộc cho quá trình đóng này đều làm tăng chức năng của gen E1 gói của virut, trong khi protein L4-33K gây chuyển dạng TB động vật gặm nhấm, cũng tham gia vào quá trình lắp ráp virut, làm tăng mức độ biểu hiện của gen muộn đột biến một phần hay đột biến mất đoạn virut và ức chế hệ gen hình thành gen này sẽ ảnh hưởng đến khả năng concatemerization bởi enzym đọc sửa đóng gói của virut. ADN nội bào. Trong trường hợp protein E4orf6, làm tăng chuyển dạng của TB do 5
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Trình tự đóng gói của adenovirus là Vector adenovirus chuỗi 7 trình tự lặp (A1 - A7) và ở vị trí tận cùng trái của hệ gen. Sau khi lắp ráp Adenovirus có thể lây nhiễm nhiều loại và đóng gói ADN, adenovirus protease TB và mô cả ở TB phân chia và không cắt protein cấu trúc thành các protein phân chia, đặc tính này kết hợp với các thành thục để sản xuất hạt virut hoàn phương pháp chuẩn bị và tinh chế đơn chỉnh. TB ly giải và giải phóng hạt virut giản cho phép sử dụng vector này như hoàn chỉnh sau 30 giờ lây nhiễm với sự vật liệu di truyền chuyên trở gen. Các tham gia của protein E3-11.6K, còn được vector ở hình 5 có thể sử dụng cho: 1) gọi là ADP (adenovirus death protein). Liệu pháp ung thư bằng cách vận chuyển Không giống như protein mã hóa bởi gen có khả năng ức chế khối u; 2) Liệu vùng gen E3, ADP chỉ được tạo thành pháp gen; 3) Liệu pháp bổ sung vận trong suốt pha muộn của quá trình lây chuyển gen, biểu hiện gen chống bệnh nhiễm và chúng được sao chép từ MLP. tiến triển. Hình 5: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của adenovirus serotype 5 và các thế hệ adenovirus vector. Vùng gen phiên mã sớm và muộn được đánh dấu tương ứng với vùng E1 - E4 và L1 - L5. MLP: promoter muộn chính; : tín hiệu đóng gói. 1. Vector adenovirus thế hệ thứ nhất. dụng trong chiến lược thiết kế vector Trong hệ vector thứ nhất, vùng gen E1 adenovirus thế hệ 1. Vùng gen E1 bị loại cần thiết để hoạt hóa promoter của virut bỏ của adenovirus thế hệ 1 có thể được và biểu hiện cả gen sớm và muộn được bổ trợ bằng dòng TB mang vùng gen E1 loại bỏ, do vậy virut này không còn khả để cung cấp chức năng in trans. Về công năng sao chép. Việc thay thế vùng gen nghệ, dòng TB 293 đã được nghiên cứu E1 bằng gen trị liệu ban đầu được sử phát triển ứng dụng cho mục đích trên, 6
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 293 là dòng TB thận phôi thai người được loại bỏ, nhưng vẫn nhân lên trong quá chuyển và biểu hiện vùng gen E1 của trình sản xuất virut. Do vậy, virut tái tổ adenovirus. Việc sản xuất vector xóa hợp sau khi tạo thành công cần phải vùng gen E1 của adenovirus ban đầu kiểm tra có hay không có sao chép của được thực hiện do cơ chế tái tổ hợp virut xóa bỏ vùng gen E1 (replication - tương đồng bên trong TB động vật có vú competent viruses). Các dòng TB trợ giúp giữa thiết kế mang trình tự tận cùng đầu như PERC6 và 911, trong đó, sự chồng bên trái và phải của hệ gen. Việc loại bỏ lấp giữa trình tự gen E1 trong TB và trình vùng gen E1 cho phép chèn đoạn gen trị tự gen này có mặt trên nhiễm sắc thể liệu có kích thước lên đến 5,1 Kb vào virut tái tổ hợp thiết kế giảm thiểu sao cho vùng gen này, trong khi không ảnh hưởng sự trùng lặp về trình tự E1 là thấp nhất. đến hiệu giá của virut và tốc độ tăng Hạn chế thứ hai liên quan đến việc sử trưởng vì adenovirus có thể đóng gói kích dụng hệ vector Ad thế hệ 1 chính là khả thước đoạn gen đến 38 Kb. Nhiều thế hệ năng kích hoạt phản ứng miễn dịch của vector thứ nhất cũng bao gồm thiết kế TB dẫn đến TB được chuyển gen trị liệu xóa vùng gen E3, để tối ưu hiệu quả tạo sẽ bị tiêu diệt do chính cơ chế miễn dịch vector virut trong thí nghiệm sử dụng cơ của TB chuyển gen. Thực tế, trong một chế tái tổ hợp chồng lấp, các nhà khoa số nghiên cứu sớm đã chứng minh khi học đã sử dụng virut đột biến dl309 của tiêm vector đã loại bỏ vùng gen E1 vào Ad týp 5 hoặc biến thể của chúng, là các động vật, biểu hiện của gen trị liệu sau khi virut mà trong vùng gen E1 có chứa hai vị được chuyển vào TB chỉ mang tính chất trí enzym cắt giới hạn duy nhất do xóa tạm thời. Có giả thiết cho rằng đáp ứng một phần của vùng gen E3. Như vậy, khả miễn dịch được kích hoạt bởi số bản sao năng tái tạo của virut kiểu dại ban đầu chép của virut ở mức độ thấp, thậm chí trong quá trình tạo virut tái tổ hợp có thể ngay cả trường hợp không có gen E1. xảy ra do cắt enzym hạn chế không hoàn Giả thiết này được củng cố bởi các thí toàn hoặc do tái gắn nối ADN của virut nghiệm chứng minh sao chép hệ gen và bên trong TB được giảm thiểu. Hơn thế, biểu hiện gen muộn của Ad thế hệ 1 có gen E3 cần thiết cho quá trình nhân lên thể xảy ra từ vector được loại bỏ vùng của virut in vitro, việc loại bỏ chúng cùng gen E1 trong nghiên cứu in vivo. Mặc dù với việc xóa gen E1 cho phép tách dòng hệ vector Ad thứ nhất gây đáp ứng miễn kích thước biểu hiện gen trị liệu lên đến dịch mạnh, làm cản trở việc sử dụng hệ 8,2 Kb. Mặc dù thế hệ vector adenovirus vector này, nhưng đây cũng là hệ vector thứ nhất được chứng minh đầy triển vọng đầy hứa hẹn cho nghiên cứu ứng dụng, cho mục đích gen trị liệu, nhưng vẫn còn đòi hỏi dẫn chuyển biểu hiện gen trị liệu nhiều vấn đề tồn tại. Hạn chế đầu tiên trong thời gian ngắn, như nghiên cứu liên bộc lộ trong quá trình sản xuất hệ vector quan đến liệu pháp ung thư và vắc xin. này, tái tổ hợp giữa trình tự vùng gen E1 trong các dòng TB mang vùng gen này và 2. Vector thế hệ thứ hai. virut tái tổ hợp có thể làm tăng số lượng Để hạn chế đáp ứng miễn dịch gây ra virut với vùng gen chức năng E1 không bị do mức độ sao chép thấp của virut đã xóa 7
8. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 bỏ vùng gen E1, các vector được thiết kế cho vector virut nhân lên và trình tự Ψ xóa bỏ nhiều gen để ức chế hiệu quả hơn cần thiết để đóng gói thành virut tái tổ mức độ biểu hiện gen của virut. Thế hệ hợp hoàn chỉnh. Toàn bộ trình tự gen bị vector thứ hai ban đầu được thiết kế với xóa bỏ của virut sẽ được thay thế bằng việc loại bỏ trình tự mã hóa E2 và E4, do thiết kế mang gen trị liệu hoặc trình tự đó cung cấp lợi ích cho tách dòng gen trị ADN không mang mã được gọi là “stuffer”, liệu với kích thước lớn. Hạn chế lớn nhất để giữ cho vector có kích thước tương gặp phải trong quá trình thiết kế virut xóa thích cho việc đóng gói. Quy trình sản bỏ nhiều vùng gen là cần tạo được các xuất và tinh chế HdAd tái tổ hợp bắt buộc dòng TB mang trình tự gen chức năng in cần hai yếu tố: (1) Helper virut (ΔE1/ΔE3) trans đã bị xóa của adenovirus. Mặc dù là virut đã xóa bỏ vùng gen E1 và E3 với hạn chế này có thể khắc phục, nhưng tốn trình tự Ψ được xen giữa hai vị trí trình nhiều thời gian và công sức, các vector tự nhận biết loxP; (2) Dòng TB 293Cre4, được đóng gói trong dòng TB này ít có là dòng TB được thiết kế để biểu hiện khả năng tiếp tục tái tổ hợp để tạo nên protein tái tổ hợp Cre recombinase, là virut có khả năng sao chép. Ví dụ, trường protein xúc tác cho quá trình tái tổ hợp hợp của gen E2, dòng TB phải được tạo giữa trình tự loxP cắt vị trí đóng gói của để biểu hiện ổn định protein cần thiết cho virut helper. Như vậy, việc cắt bỏ trình tự việc đóng gói của Ad như: single stranded Ψ khiến virut helper không thể đóng gói, ADN-binding protein, preterminal protein nhưng tất cả gen chức năng khác của và ADN polymerase. Các vector virut xóa virut được giữ nguyên, giúp duy trì khả bỏ gen này không có khả năng sao chép năng sao chép và cung cấp chức năng hệ gen, trong trường hợp vector thiếu trợ giúp cho vector HdAd có thể sao chép polymerase, không xảy ra quá trình sao và đóng gói thành virut tái tổ hợp hoàn chép, thậm chí có biểu hiện mức độ mạnh chỉnh. của gen E1A. Vì HDAds bị xóa tất cả bộ mã di truyền 3. Vector thế hệ thứ ba (Helper- của virut, do đó cần phải có một virut trợ dependent adenovirus). giúp cho chúng nhân lên. Phương pháp hiệu quả đầu tiên để phát triển HDAds là Hệ vector Helper-dependent adenoviral hệ thống Cre-loxP được Graham và CS (HdAd) ưu việt hơn tất cả các hệ vector phát triển năm 1996 (hình 6). Để việc chuyển gen khác trong thí nghiệm về liệu đóng gói của HDAds đạt hiệu quả, kích pháp gen, do khả năng kéo dài thời gian thước của bộ gen phải được thiết kế sao biểu hiện quan sát ở chuột và khỉ, độc cho chúng nằm trong phạm vi có kích tính của virut giảm đáng kể, thậm chí thước từ 27,7 - 38 Kb. Do vậy, ADN "chèn" không còn gây độc. HdAd được thiết kế thường có trong hệ vector HDAds. Kích bằng cách loại bỏ tất cả gen gây độc của thước của ADN chèn có thể ảnh hưởng virut, chỉ giữ lại duy nhất trình tự lặp đảo đến hiệu suất đóng gói của vector. Để giải ngược (ITRs) ở hai đầu tận cùng cần thiết 8
9. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 phóng vector HDAd (chuyển đổi bộ gen hiệu đóng gói được cắt ra từ bộ gen của HDAd từ “dạng plasmid" sang "dạng virut"), virut trợ giúp này. Kết quả, bộ gen của các plasmid đầu tiên được cắt với enzym virut trợ giúp không thể đóng gói, nhưng giới hạn thích hợp để giải phóng bộ gen vẫn có thể trải qua sao chép ADN, do đó HDAd từ trình tự dạng plasmid và chuyển bổ sung trực tiếp cho sao chép và đóng vào dòng TB 293Cre4. Dòng TB 293Cre4 gói bộ gen của vector HDAd. Tuy nhiên, là dòng TB mang thiết kế biểu hiện enzym việc sản xuất hiệu quả số lượng lớn các recombinase nhận biết vị trí đặc hiệu loxP vector chất lượng cao còn gặp nhiều khó trên trình tự của vector HDAd, đồng thời khăn, chưa đáp ứng được nghiên cứu chuyển bộ gen HDAd vào dòng TB 293Cre4, tiền lâm sàng (trên mô hình động vật lớn) virut trợ giúp H14 cũng được gây đồng và trên lâm sàng. Để giải quyết vấn đề nhiễm vào dòng TB này. Các virut trợ này, người ta đã phát triển một hệ thống giúp là một FGAd (bị xóa gen E1), mang cải biến gồm dòng TB sản xuất thích ứng trình tự tín hiệu đóng gói hai đầu tận cùng dưới dạng hỗn dịch có biểu hiện Cre ở được thiết kế hai trình tự nhận biết loxP, mức độ cao và một loại virut trợ giúp là vị trí nhận biết cho enzym cắt recombinase. kháng đột biến, kèm theo là phương pháp Khi TB 293Cre4 gây nhiễm bằng H14, tín tinh chế hiện đại (hình 7). Hình 6: Sơ đồ thiết kế tạo gutless adenovirus hay helper-dependent adenovirus sử dụng hệ thống Cre/loxP. Hệ gen của gutless và helper cùng được chuyển gen vào dòng TB 293 biểu hiện protein Cre, cả hai hệ gen cùng được khuếch đại và protein 9
10. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 virut được tạo thành. Sau khi đồng chuyển gen, tín hiệu đóng gói của helper genome được cắt bằng enzym Cre recombinase. Kết quả, virut helper không thể đóng gói trong khi gutless genome vẫn được đóng gói thành virut hoàn chỉnh. Hình 7: Quy trình sản xuất HDAds quy mô lớn. HV, helper virut; pHDAd, HDAd plasmid. Với những cải tiến này, có thể dễ dàng sản xuất được > 1 x 1013 hạt virut (VP) từ 3 lít TB trong vòng 2 tuần. Tiến bộ này đã cải thiện đáng kể khả năng ứng dụng công nghệ sản xuất virut tái tổ hợp này trong nghiên cứu về gen trị liệu, đặc biệt trong mô hình thử nghiệm trên động vật lớn và trên lâm sàng. KẾT LUẬN nghiên cứu không yêu cầu biểu hiện lâu dài của gen chuyển. Hệ thống vector thế Tại thời điểm hiện tại, có 3 hệ thống hệ thứ ba ưu việt hơn các hệ vector adenovirus được sử dụng cho nghiên cứu adenovirus do chúng có khả năng đạt về gen trị liệu, thế hệ vector thứ nhất, thứ hiệu quả biểu hiện cao và duy trì mức độ hai và thứ ba (helper-dependent adenovirus). biểu hiện lâu dài của gen chuyển in vivo. Thế hệ vector thứ nhất và thứ hai không Điểm yếu chính của hệ thống này trong thể duy trì thời gian biểu hiện lâu dài của quy trình sản xuất bắt buộc cần 3 thành gen chuyển trong TB chủ, nhưng có lợi phần: dòng TB chuyên biệt, virut helper thế là có hiệu quả lây nhiễm cao vào và vector thu gọn adenovirus. Việc sản nhiều kiểu TB khác nhau, cũng như dễ xuất virut tái tổ hợp helper-dependent dàng thiết kế và sản xuất. Do vậy, hai hệ adenovirus mang và dẫn chuyển gen trị thống vector này được sử dụng rộng rãi liệu có thể lây nhiễm TB đích với hiệu quả trong thí nghiệm về gen trị liệu, như liệu cao, chất lượng tốt, loại bỏ được tạp pháp gen ức chế ung thư, chủng ngừa, là nhiễm của virut helper, đang tiếp tục cần 10