Tối ưu hóa quy trình tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư bằng phần mềm tin học modde 5.0

Nội dung text: Tối ưu hóa quy trình tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư bằng phần mềm tin học modde 5.0

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH TỔNG HỢP ALTRETAMIN LÀM THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƢ BẰNG PHẦN MỀM TIN HỌC MODDE 5.0 Vũ Bình Dương*; Phan Đình Châu** TãM T¾T Altretamin được tổng hợp từ phản ứng giữa cyanuric clorid với dimethylamin trong dung môi aceton và sử dụng NaOH làm chất trung hòa axít. Đã ứng dụng phần mềm Modde 5.0 để thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa các điều kiện trong quy trình tổng hợp altretamin. Kết quả: đã tìm được các điều kiện tối ưu cho tổng hợp altretamin gồm: tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng cyanuric clorid:DMA:NaOH là 1:4,05:3,75; nhiệt độ phản ứng 490C; thời gian phản ứng 3,5 giờ. Với các điều kiện tối ưu tìm được, hiệu suất của cả quy trình đạt 88,19%. Sản phẩm altretamin thu được đạt các chỉ tiêu chất lượng theo Dược điển Mỹ 34 (USP 34) với phiếu kiểm nghiệm số 44G 566 ngày 26 tháng 8 năm 2014. * Từ khóa: Altretamin; Tổng hợp hóa học; Tối ưu hóa. Optimization of Synthesis Process of Altretamine Using Anticancer Medicines by Modde 5.0 Software Summary Altretamine was synthesized from the reaction between cyanuric chloride and dimethylamine in acetone solvent and NaOH as a neutralizer. Modde 5.0 software was applied to design experiments and optimize conditions of altretamine synthesis. The optimal molar ratio of materials in the reaction was CYA:DMA:NaOH (1:4.05:3.75) at 490C temperature in 3.5 hours. The total process performance achieved 88.19% in the optimal conditions. Substance (altretamine) meets requirements of USP 34 (Certificate of analysis - No. 44G566 dated 26 Aug. 2014). * Key words: Altretamine; Synthesis; Optimization. ĐẶT VẤN ĐỀ [1, 2, 5]. Altretamin hiện đang được lưu hành với biệt dược hexalen (U.S. Bioscience), Altretamin có tên khoa học 2,4,6-tris hexastat (Roger Bellon), hexamethylmelamin (dimethylamino)-s-triazin là chất kháng ung thư được sử dụng trong điều trị các loại (Rhone-Poulenc), là thuốc được coi là ít ung thư như: ung thư phổi, ung thư vú, độc hơn so với các thuốc hóa trị liệu khác ung thư buồng trứng (là các loại ung thư sử dụng điều trị ung thư và là thuốc có phổ biến), đặc biệt được dùng trong điều công thức đơn giản, quá trình tổng hợp ít trị ung thư buồng trứng tiến triển sau giai đoạn, tính khả thi trong sản xuất khá khi phương pháp trị liệu đầu tiên thất bại cao [4, 6]. * Học viện Quân y ** Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com) Ngày nhận bài: 23/09/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 21/11/2014 Ngày bài báo được đăng: 26/11/2014 7
2. T¹p chÝ y - d•îc häc qu©n sù sè 9-2014 Ở nước ta, nhu cầu về thuốc điều trị - Máy ghi phổ khối lượng (MS) AutoSpec ung thư khá lớn, các thuốc ung thư đều Primer tại Phòng Phân tích Cấu trúc, Viện phải nhập ngoại với giá thành quá đắt, chi Hóa học (Viện Khoa học và Công nghệ phí cho điều trị quá cao. Hiện nay, Học Việt Nam). viện Quân y đã và đang nghiên cứu cải - Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân tiến quy trình tổng hợp altretamin với hiệu (1H - NMR và 13C - NMR) Bruker - AV500 suất khá cao, thực hiện đơn giản, dễ dàng tại Phòng Phân tích Cấu trúc, Viện Hóa học triển khai sản xuất quy mô công nghiệp [3]. (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Trong bài này, chúng tôi thông báo kết quả ứng dụng phần mềm tin học Modde 3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 5.0 để thiết kế và tối ưu hóa quy trình * Phương pháp tổng hợp và tinh chế tổng hợp altretamin. altretamin: Tổng hợp altretamin từ nguyên liệu NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG cyanuric clorid (CyA) và dimethylamin PHÁP NGHIÊN CỨU (DMA) trong dung môi aceton với NaOH 1. Nguyên liệu, hóa chất. làm chất xúc tác và trung hòa axít theo sơ Cyanuric clorid, dimethylamin, aceton, đồ phản ứng sau: cồn 96º, natri hydroxyd, altretamin chuẩn. CH3 CH3 2. Thiết bị nghiên cứu. Cl N Cl H3C N N N NaOH CH3 - Cân điện tử Electronic Balance WT- + (CH3)2NH N N N N + NaCl + H2O CF; cân phân tích Metller có độ chính xác Aceton 0,1 mg, tủ sấy Medda, máy khuấy từ gia Cl N nhiệt IKA RH Basic 2 (Đức), máy cất quay H3C CH3 Cyanuric clorid Rotavapor R.200, bơm hút chân không, Altretamin phễu lọc hút chân không Buchner. Phản ứng được tiến hành trong điều kiện - Dụng cụ thủy tinh đạt tiêu chuẩn nhiệt độ, tỷ lệ mol các chất CyA:DMA:NaOH dùng cho phòng thí nghiệm tổng hợp hữu trong thời gian phản ứng khác nhau (theo cơ (bình ba cổ 500 ml, 1.000 ml, sinh hàn dõi bằng sắc ký lớp mỏng). Hỗn hợp sau hồi lưu, nhiệt kế, bình cầu 250 ml, bình phản ứng cho vào nước đá để thu lấy tủa, gạn có nút mài 250 ml, bình định mức, lọc rửa tủa và kết tinh lại trong cồn 960 [3]. pipet các ống nghiệm ). Sản phẩm kết tinh được xác định nhiệt độ - Bản mỏng silicagel Kieselgel 60 F254 nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, khối lượng (Merck), đèn soi sắc ký UV hai bước sóng và tính hiệu suất phản ứng. 254 và 360 nm. * Phương pháp thiết kế thí nghiệm và - Máy đo nhiệt độ nóng chảy Stuart, tối ưu hóa: SMP-10. - Thiết kế thí nghiệm: - Máy ghi phổ hồng ngoại (IR) GX- Sử dụng phương pháp thiết kế theo PerkinElmer (Mỹ). mô hình mặt hợp tử tại tâm với sự trợ 8
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 giúp của phần mềm Modde 5.0 [7] để độc lập hay tham số. Hiệu suất của phản khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu ứng được gọi là biến phụ thuộc hay hàm suất phản ứng bao gồm: nhiệt độ phản số (Y%). Sử dụng phần mềm thiết kế ứng, tỷ lệ mol DMA, tỷ lệ mol NaOH với tối ưu Modde 5.0 để thiết kế thí nghiệm, các mức khác nhau và được mã hóa phần mềm đưa ra thí nghiệm cần tiến như bảng 1. Các yếu tố này gọi là biến hành. Bảng 1: Ký hiệu và các mức của biển đầu vào. Mức dưới -1 Mức cơ sở 0 Mức trên 1 Nhiệt độ phản ứng (t 0C) X1 40 49 58 Tỷ lệ mol DMA (mol) X2 3 3,75 4,5 Tỷ lệ mol NaOH (mol) X3 3 3,75 4,5 - Tối ưu hóa: Sau khi có kết quả làm thực nghiệm, sử dụng phẩn mềm Modde để phân tích ảnh hưởng các biến độc lập đến hiệu suất phản ứng (biến phụ thuộc) bằng việc thiết lập phương hồi quy bậc 2 về mối tương quan giữa biến phụ thuộc và biến độc lập. Phương trình có dạng: 2 2 2 Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b1(X1) + b2(X2) + b3(X3) + b1,2,3(X1 X2 X3 ) Ngoài ra, phần mềm còn đưa ra dự đoán điều kiện tối ưu để hiệu suất phản ứng cao nhất (Y = max). Sau khi thu được điều kiện tối ưu từ phần mềm, làm lại thí nghiệm để thẩm định kết quả tối ưu. * Phương pháp xác định độ tinh khiết KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN và cấu trúc hóa học: 1. KÕt qu¶ thiÕt kÕ thÝ nghiÖm và thùc - Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản nghiÖm. phẩm bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt Sau khi đưa các biến độc lập vào phần độ nóng chảy. mềm Modde 5.0, phần mềm đưa ra kết quả - Xác định cấu trúc của altretamin tổng thiết kế gồm 17 thí nghiệm. Tiến hành 17 hợp được dựa vào phân tích phổ tử ngoại thí nghiệm tổng hợp altretamin theo thiết (UV), phổ hồng ngoại (IR) và phổ khối kế. Sau mỗi thí nghiệm, cân xác định khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân lượng sản phẩm và tính hiệu suất phản (1H - NMR và 13C -NMR). ứng. 9
4. T¹p chÝ y - d•îc häc qu©n sù sè 9-2014 Bảng 2: Kết quả thiết kế thí nghiệm và thực nghiệm thu được Đ STT (Y%) X1 X2 X3 X1 (X2) (X3) 1 -1 -1 -1 40 3 3 54,95 2 1 -1 -1 58 3 3 57,52 3 -1 1 -1 40 4.5 3 56,34 4 1 1 -1 58 4.5 3 60,92 5 -1 -1 1 40 3 4.5 78,94 6 1 -1 1 58 3 4.5 80,07 7 -1 1 1 40 4.5 4.5 85,35 8 1 1 1 58 4.5 4.5 87,91 9 -1 0 0 40 3.75 3.75 84,61 10 1 0 0 58 3.75 3.75 88,06 11 0 -1 0 49 3 3.75 79,19 12 0 1 0 49 4.5 3.75 88,03 13 0 0 -1 49 3.75 3 61,28 14 0 0 1 49 3.75 4.5 84,46 15 0 0 0 49 3.75 3.75 86,09 16 0 0 0 49 3.75 3.75 85,88 17 0 0 0 49 3.75 3.75 86,25 Nhập kết quả thực nghiệm vào phần mềm Modde 5.0, nhận được phương trình hồi 2 2 quy như sau: Y = 86,17 + 1,43X1 + 2,79X2 + 12,57X3 - 2,63X 2 - 13,37 X 3 + 1,18X2X3, Phương trình có hệ số tương quan R2 = 0,996. Điều này chứng tỏ có mèi tương quan rất chặt chẽ giữa các biến đầu ra và đầu vào theo phương trình hồi quy tìm được. Phần mềm cũng đưa ra mặt đáp về ảnh hưởng các biến độc lập (yếu tố khảo sát) tới hiệu suất phản ứng. Hình 1: Mặt đáp tối ưu thực nghiệm của các yếu tố đầu vào tới hiệu suất. 10
5. T¹p chÝ y - d•îc häc qu©n sù sè 9-2014 Phân tích ảnh hưởng yếu tố kết hợp Kết quả thực nghiệm tiến hành phản và từng yếu tố độc lập cho thấy: khi tăng ứng theo các điều kiện dự đoán của phần nhiệt độ thì hiệu suất phản ứng tăng, mềm tối ưu cho thấy hiệu suất của phản nhưng tăng không nhiều. Khi tăng tỷ lệ ứng đạt 88,19% (dự đoán của phần mềm mol NaOH, hiệu suất tăng, nhưng tăng tới là 88,06%). Như vậy, sự khác biết giữa tỷ lệ 3,75 thì hiệu suất ít tăng, thậm chí dự đoán của phần mềm và thực nghiệm giảm chút ít. Tỷ lệ mol DMA ảnh hưởng không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. nhiều tới hiệu suất phản ứng. Khi tăng Có thể sử dụng các điều kiện tối ưu mà tỷ lệ tới khoảng 4, hiệu suất tăng nhanh, phần mềm đưa ra là: tỷ lệ mol CYA:DMA: nhưng quá tỷ lệ này thì hiệu suất giảm. NaOH = 1:4,05:3,75, phản ứng được Trong 3 yếu tố khảo sát, mức độ ảnh hưởng thực hiện trong 3,5 giờ, nhiệt độ phản tới hiệu suất được sắp xếp từ ít tới nhiều o như sau: nhiệt độ < tỷ lệ NaOH < DMA. ứng 49 C. Chạy trương trình tổi ưu hóa trên phần 2. Thiết lập quy trình sản suất. mềm Modde với kết quả từ 17 mẻ thí Với các điều kiện tối ưu hóa, chúng tôi nghiệm thu được các điều kiện tối ưu xây dựng quy trình tổng hợp altretamin ở cho hiệu suất cao là: nhiệt độ (X ) = 490C; 1 quy mô phòng thí nghiệm như sau: cho tỷ lệ mol DMA:CYA (X ) = 4,05; tỷ lệ mol 2 9,4 g (0,05 mol) cyanuric clorid vào bình NaOH:CYA (X ) = 3,75. Khi đó, hiệu suất 3 ba cổ dung tích 500 ml, có lắp sinh hàn, theo tính toán của phần mềm là 88,06%. nhiệt kế, phểu nhỏ giọt, nồi cách thủy, Tiến hành thực nghiệm với các điều máy khuấy từ, cho vào 40 ml aceton, kiện tối ưu trên để kiểm chứng lại kết quả khuấy 10 phút, tiếp đó cho thêm vào dung dự đoán trên phần mềm Modde 5.0 đưa ra. dịch này 23 ml dimetylamin 40% (0,205 Bảng 3: Kết quả thực nghiệm kiểm tra mol). Làm lạnh ngoài bằng nước đá, vừa kết quả tối ưu hóa. khuấy vừa cho 7,5 g (0,1875 mol) natri (%) hydroxyd vào, khuấy 10 phút, sau đó đun Dự đoán Thực nghiệm hồi lưu 3 giờ 30 phút. Sau khi phản ứng (0C) (1) (2) kết thúc, vừa khuấy vừa cho nước đá để 1 88,06 88,52 171 - 173 thu lấy tủa, tinh chế lại sản phẩm vào hỗn hợp phản ứng trong 120 ml nước cất - đá, 2 88,06 88,01 171 - 173 tủa tạo ra được khuấy tiếp 30 phút, sau 3 88,06 87,65 171 - 173 đó lọc qua phễu Buchner lấy sản phẩm 4 88,06 87,99 171 - 173 thô. Kết tinh lại toàn bộ sản phẩm thô o o 5 88,06 88,34 171 - 173 trong etanol 96 , sấy khô sản phẩm ở 70 C 6 88,06 88,61 171 - 173 trong tủ hút chân không 3 giờ, thu được 9,37 g sản phẩm altretamin, tinh thể hình X 88,06 88,19 kim trắng, nhiệt độ nóng chảy 172 - 174oC. p p1, 2 > 0,05 Hiệu suất 89,19%. 11
6. T¹p chÝ y - d•îc häc qu©n sù sè 9-2014 3. Kết quả xác định độ tinh khiết, - Sắc ký bản mỏng: sơ bộ kiểm tra nhận dạng cấu trúc hóa học và kiểm bằng sắc ký lớp mỏng so với chất nghiệm sản phẩm. chuẩn với hệ dung môi khai triển Kết quả xác định độ tinh khiết của mẫu (toluen:AcOEt:CHCl3:MeOH là 6:1:4:3) thu được gồm: cho 1 vết gọn (Rf = 0,769) lên ngang đúng vết altretamin chuẩn, hiện thị rõ dưới ánh - Đo điểm chảy: nhiệt độ chảy của sản sáng đèn tử ngoại t¹i bước sóng 254 nm. phẩm altretamin ở các mẻ khác nhau dao động từ 171 - 174oC. - Số liệu phân tích phổ (bảng 4): UV, λmax (nm) 226 226 -1 IR (KBr), υmaxcm 2858 (υCaromatic-N-CH3); 2278 (δsC-H/N- 2866 (υCaromatic-N-CH3); 2278 (δsC-H/N- CH3), 1527 -1 CH3), 1528 (υC=N); 1385 (δsCH3); 1211 (υC=N); 1386 (δsCH3); 1211 (υC-N). δs max cm (υC-N). + + + + + + EI MS (m/z) 210 (M ); 195 [M -CH3]; 167 [M -N(CH3)2]; 210 (M ); 195 [M -CH3]; 167 [M -N(CH3)2]; 152[195- 152[195-N(CH3)2]; 96[167-NH=C-N(CH3)2]; N(CH3)2]; 96[167-NH=C-N(CH3)2]; 81[152-NH=C- 81[152-NH=C-N(CH3)2] N(CH3)2] 1 H-NMR (ppm) 3,08 (s, 18H, 6-CH3) 3,09 (s, 18H, 6-CH3) 13 C-NMR (ppm) 165,66(s,3C,Ctriazin); 35,65(s,6C,6CH3) 165,66(s,3C,Ctriazin); 35,65(s,6C,6CH3) Từ kết quả đo diểm chảy, phân tích sắc ký bản mỏng, phân tích phổ IR, MS,1H - NMR và 13C - NMR của hợp chất tổng hợp được và chất chuẩn cho phép chúng tôi kết luận altretamin tổng hợp được tinh khiết và có cấu trúc đúng như dự kiến. - Chất lượng của altretamin tổng hợp được: kiểm nghiệm theo Dược điển Mỹ 2010 (USP 34). Kết quả mẫu gửi kiểm nghiệm đạt yêu cầu chất lượng theo Dược điển Mỹ 2010 (USP 34), Phiếu kiểm nghiệm số 44G 566 ngày 26 tháng 8 năm 2014 của Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương. KẾT LUẬN của cả quy trình đạt 88,19%. Sản phẩm altretamin thu được đạt các chỉ tiêu chất Đã ứng dụng phần mềm Modde 5.0 để lượng theo Dược điển Mỹ 34 (USP 34) thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa các điều với phiếu kiểm nghiệm số 44G 566 ngày kiện trong quy trình tổng hợp altretamin. 26 tháng 8 năm 2014. Kết quả: đã tìm được điều kiện tối ưu cho tổng hợp altretamin gồm: tỷ lệ mol TÀI LIỆU THAM KHẢO các chất tham gia phản ứng cyanuric 1. Nguyễn Bá Đức. Hóa chất điều trị ung clorid:DMA:NaOH là 1:4,05:3,75; nhiệt thư . NXB Y học. Hà Nội. 2003, tr.130-137. 0 độ phản ứng 49 C; thời gian phản ứng 2. Trịnh Văn Quang. Bách khoa toàn thư, 3,5 giờ. Với các điều kiện tối ưu, hiệu suất ung thư học. NXB Y học. 2002, tr.69-70. 12
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 3. Phan Đình Châu, Vũ Bình Dương, 5. Goodman and Gilman’s. The Pharmacological Nguyễn Thị Thu Hằng, Bùi Thị Thu Hà. basis of Therapeutics. 10th Ed. MC Grow Hill Nghiên cứu quy trình sản xuất altretamin là Inc. New York, London, Seol, Tokyo, Singapore, thuốc điều trị ung thư. Tạp chí Dược học. Sydney, Toronto. 2001, Vol II, Chapter 52. 2014, số 462, tr.2-6. 6. Kaiser. D. W et al. J Am Chem Soc. 4. Đinh Thị Thanh Hải, Hoàng Thu Trang. 1952, 73, pp.2984-2986. Nghiên cứu tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư. Tạp chí Dược học. 2010, 7. Sartorius Stedim Biotech Company. User 407, tr.25-27. guide Bio Pat Modde 5.0. 2013. 13