Tối ưu hoá kỹ thuật PCR HRM nhằm bước đầu khảo sát mối liên hệ giữa SNP rs10941679 và bệnh ung thư vú ở người Việt Nam

Nội dung text: Tối ưu hoá kỹ thuật PCR HRM nhằm bước đầu khảo sát mối liên hệ giữa SNP rs10941679 và bệnh ung thư vú ở người Việt Nam

1. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T4 - 2016 Tối ưu hoá kỹ thuật PCR HRM nhằm bước đầu khảo sát mối liên hệ giữa SNP rs10941679 và bệnh ung thư vú ở người Việt Nam Phan Thành Phát Cao Thị Dạ Lan Nguyễn Thị Tuyết Lan Nguyễn Thị Ngọc Thanh Nguyễn Thị Huệ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG–HCM ( Bài nhận ngày 12 tháng 12 năm 2015, nhận đăng ngày 20 tháng 08 năm 2016) TÓM TẮT Ung thư là loại phổ biến thứ hai trên thế được lựa chọn là 58 oC và 3,0 mM. Bộ mẫu 100 giới, ảnh hưởng đến hàng triệu người và gây ra ca/chứng được phân tích kiểu gen cho SNP rất nhiều trường hợp tử vong. Việc nhận diện các rs10941679 bằng điều kiện hrm tối ưu. Kết quả chỉ thị di truyền là một trong số những cách thức phân tích cho thấy tần số của allele nguy cơ là chẩn đoán từ sớm, giúp bệnh nhân phát hiện 48,5 % trong nhóm bệnh nhân ung thư vú và 54,0 bệnh, cũng như nhận được hướng chữa trị hợp lý. % trong nhóm người không bệnh. Phân tích hồi Các nghiên cứu gần đây cho thấy một vài điểm quy tuyến tính giữa sự hiện diện allele nguy cơ và đa hình (SNP) ứng viên như rs10941679 (ở vị trí kiểu gen chứa allele nguy cơ với biểu hiện bệnh thượng nguồn gen MRPS30) có mối liên hệ chặt cho thấy rs10941679 không liên quan với ung thư chẽ với ung thư vú ở người châu Âu và các dân vú ở người Việt Nam (or = 0,80; 95 % ci = [0,54 tộc khác. Trong nghiên cứu này, mối liên hệ giữa – 1,19]; pG = 0,27; pGG/GA = 0,56). Với cỡ SNP rs10941679 và ung thư vú ở người Việt Nam mẫu nhỏ 100 ca/chứng độ tin cậy của phân tích đã được khảo sát bước đầu. Phương pháp tầm này chỉ đạt 12,02 %. Để đạt được độ tin cậy 90 soát kiểu gen của SNP sử dụng trong nghiên cứu % cần sử dụng bộ mẫu lên tới 1691 ca/chứng. này là phương pháp high resolution melt (HRM). Kết quả nghiên cứu này cho thấy khả năng của HRM được thiết kế sử dụng phần mềm Umelt và rs10941679 liên quan đến sự phát triển ung thư được tối ưu hóa bằng cách thay đổi nhiệt độ bắt vú ở người Việt Nam là rất thấp vì vậy chưa cần cặp mồi, cũng như nồng độ MgCl2 để kết quả có tập trung nghiên cứu SNP này trong các nghiên thể phân biệt 3 dạng đường cong nóng chảy của cứu sắp tới nhằm tìm kiếm chỉ thị di truyền cho 3 kiểu gen cho SNP rs10941679. Điều kiện tối ưu ung thư vú ở người Việt Nam. Từ khóa: ung thư vú, MRPS30, rs10941679, High Resolution Melt MỞ ĐẦU Ung thư vú là loại ung thư phổ biến thứ 2 nữ trên cả các nước phát triển và các nước đang trên thế giới với khoảng 1,67 triệu ca mới được phát triển. Ở Việt Nam, tốc độ mắc ung thư vú đã chẩn đoán vào năm 2012 (chiếm 25 % tổng số tăng gấp 2 lần từ năm 2000 đến năm 2010 [2]. ung thư) [1]. Đây là loại ung thư phổ biến ở phụ Vào năm 2012, số ca mắc ung thư vú trên cả Trang 5
2. Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 nước là 11067, cùng với 4671 ca tử vong [3]. ung thư vú ở từng quần thể riêng biệt, như người Thêm vào đó, phần lớn phụ nữ thường được chẩn Việt Nam là hết sức cần thiết. đoán bị ung thư vú khi ở giai đoạn 2 [2], trong Phương pháp High Resolution Melt (HRM) khi ở các nước phát triển là từ giai đoạn 1 hoặc 0 đã được sử dụng trong việc tầm soát kiểu gene [4]. Do đó, mặc dù có tỉ lệ mắc bệnh thấp nhưng của SNP trong một số nghiên cứu trước đây [16, tỉ lệ tử vong ở bệnh nhân ung thư vú tại Việt 17] và cho thấy nhiều ưu điểm so với các phương Nam lại cao hơn so với các nước phát triển; và do pháp khác bởi tính nhanh, nhạy, hiệu quả và tiết đó cũng cho thấy rằng việc tìm kiếm các phương kiệm [18]. Đây là một phương pháp xác định pháp chẩn đoán mới và đầy đủ hơn cho ung thư kiểu gen với độ phân giải cao, có thể phân biệt vú ở người Việt Nam là hết sức cần thiết. được các trình tự DNA chỉ khác nhau một Có rất nhiều yếu tố đã được xác định có liên nucleotide dựa vào kết quả phân tích nhiệt độ quan đến sự hình thành và phát triển của ung thư nóng chảy (Tm) của sản phẩm PCR, trong đó, độ vú như yếu tố tuổi tác, giới tính, lối sống, môi đặc hiệu cũng như sự tách biệt của các đường trường, Trong số đó, mặc dù chỉ chiếm từ 5 – cong nóng chảy đại diện cho các kiểu gen của 10 % số trường hợp mắc ung thư vú [5] nhưng SNP là các thông số quan trọng nhất, quyết định yếu tố di truyền lại có thể được sử dụng cho việc đến kết quả phân tích kiểu gen. chẩn đoán và phát hiện bệnh từ rất sớm, góp phần Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành giảm tỉ lệ tử vong và định hướng cho các điều trị tối ưu hóa phương pháp HRM nhằm tầm soát trúng đích. Các điểm đa hình (SNP – Single kiểu gen của rs10941679 trên bộ mẫu 100 Nucleotide Polymorphism) hiện diện trên các gen ca/chứng và phân tích mối liên hệ của SNP này tham gia vào sự điều hòa và phát triển của ung với ung thư vú ở người Việt Nam. thư vú đang là đối tượng rất được quan tâm bởi VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP tác động của nó và các haplotype giữa các SNP đối với sự phát triển ung thư vú [6]. Thu nhận mẫu và tách chiết DNA bộ gene từ máu toàn phần Một trong số những SNP nhạy cảm với ung thư vú đang được quan tâm là rs10941679 (A>G) Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu nhận hiện diện ở thượng nguồn gen tiền-apoptosis mẫu máu cho nghiên cứu từ Bệnh viện Ung bướu MRPS30 (mitochondrial ribosomal protein s30) thành phố Hồ Chí Minh. Các mẫu máu ung thư [7, 8]. SNP này đã được nhận thấy có liên quan vú được thu nhận từ các bệnh nhân đã được chẩn đến ung thư vú ở các quần thể người châu Âu và đoán có khối u ác tính trong vú ở khoa ngoại 4. Mỹ, với khả năng làm gia tăng ung thư từ 1,12 – Trong khi đó, các mẫu máu không bệnh được thu 1,19 lần [9, 10]. SNP này cũng cho thấy có sự nhận ở khoa ngoại 6 từ những người được chẩn liên quan chặt chẽ đến các khối u dương tính với đoán không mắc ung thư vú. Mẫu máu sau khi progresterone receptor [11] và người có đột biến thu nhận sẽ được vận chuyển về phòng thí o BRCA2, chứ không phải trên những người có đột nghiệm và bảo quản ở -20 C. Các mẫu máu được biến BRCA1 [12]. Mặc dù vậy, rs10941679 lại thu nhận và tiến hành xử lý với sự đồng thuận không cho thấy có sự liên hệ với ung thư vú ở của người cho mẫu. quần thể người Trung Quốc [13, 14] và Mỹ gốc DNA bộ gen được ly trích từ tế bào máu Phi [15]. Những nhận định trên cho thấy rằng bằng phương pháp muối theo quy trình của mối liên hệ giữa rs10941679 và ung thư vú là đặc Nguyễn Thị Huệ và cs (2012) [19] với một số trưng cho từng quần thể, dân tộc; và do đó cũng điều chỉnh như sau: 500 µL máu cùng với 1,5 mL cho thấy việc phân tích mối liên hệ của nó với cell lysis buffer được cho vào trong eppendorf rồi Trang 6
3. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T4 - 2016 tiến hành vortex và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 ràng nhất sẽ được chọn để sử dụng cho các thí phút. Sau đó, dung dịch huyền phù này được ly nghiệm tiếp theo. tâm 10000 rpm trong 3 phút để thu nhận phần Tìm các mẫu chứng và tối ưu điều kiện PCR cặn (pellet) dưới đáy. Tiến hành lặp lại các bước HRM trên thêm 2 lần cùng với 1 mL cell lysis buffer để Để đảm bảo sản phẩm khếch đại có đủ lượng thu nhận phần cặn đã loại bỏ hoàn toàn màng tế sử dụng cho HRM, trước tiên các cặp mồi được bào và cho bổ sung với 300 µL nucleic lysis lựa chọn được tối ưu nhiệt độ bắt cặp Ta bằng buffer. Huyền phù trên được ủ trong 10 phút ở 37 phương pháp PCR. Phản ứng PCR được tiến oC và tiếp tục được bổ sung với 100 µL NaCl 5 hành với tổng thể tích là 25 µL, bao gồm: 12,5 M và 600 µL chloroform. Tiến hành ly tâm µL Toptaq Mastermix 1, 0,5 µL cho mỗi loại mồi 10000 rpm trong 5 phút và thu nhận dịch nổi có ngược và mồi xuôi 0,2 µm, 1 µL DNA 50 ng/µL, chứa DNA qua eppendorf mới. Bổ sung 1000 µL và 10,5 µL dH2O. Chu trình nhiệt PCR được tiến ethanol 100 % vào eppendorf trên, đảo đều và ly hành như sau: 94 oC trong 1 phút; theo sau bởi 40 tâm 13000 rpm trong 5 phút ở 4 oC. Loại bỏ phần chu kỳ bao gồm 94 oC trong 30 giây, gradient Ta dịch nổi rồi bổ sung 700 µL ethanol 70 %, đảo 56 – 64 oC trong 30 giây, 72 oC trong 60 giây; và đều và tiếp tục ly tâm 13000 rpm trong 5 phút ở 4 cuối cùng là 72 oC trong 60 giây. sản phẩm PCR oC. Sau đó, loại bỏ phần dịch nổi và làm khô được kiểm tra bằng điện di 90 V, 30 phút trên gel eppendorf ở 55 oC trong 30 phút. Thêm 50 µL agarose 1,5 % nhằm kiểm tra kích thước sản nước phân tử vào trong eppendorf và dung dịch phẩm mục tiêu, cũng như sự hiện diện của các chứa DNA trên được bảo quản ở -20 oC. DNA sản phẩm phụ. sau tách chiết sẽ được xác định nồng độ và độ Sau khi đã tối ưu nhiệt độ bắt cặp, chúng tôi tinh sạch bằng cách đo giá trị OD260/OD280 với máy Nanodrop. các mẫu DNA có giá trị trị tiến hành HRM cho một số mẫu DNA ngẫu nhiên với nhiệt độ bắt cặp đã được tối ưu trước đó và OD260/OD280 từ 1,7 – 2,0, và nồng độ ≥ 10 ng/µL được chọn lựa cho phân tích HRM. nồng độ MgCl2 được lựa chọn từ phần mềm Umelt, nhằm tìm kiếm 3 dạng đường cong nóng Thiết kế mồi cho kỹ thuật HRM phân tích chảy đại diện cho 3 kiểu gen (đồng hợp tử đột SNP biến, đồng hợp tử bình thường, dị hợp tử). phản Mồi sử dụng cho phân tích HRM được thiết ứng HRM được tiến hành với tổng thể tích 6 µL, kế dựa trên phần mềm Primer3plus bao gồm: 3 µL Lightcycler ® 480 high resolution ( melting dye 1x 0,12 µL cho mỗi loại mồi ngược plus/primer3plus.cgi) và kiểm tra độ đặc hiệu và mồi xuôi 0,2 µm; MgCl2 2,0 – 3,5 mm tùy bằng phần mềm Primer-blast thuộc kết quả dự đoán umelt, 1 µL DNA 30 ( ng/µL và dH2O cho đủ 6 µL. Chu trình nhiệt cho cũng như sự hình thành cấu trúc bậc 2 từ phần phản ứng HRM được tiến hành như sau: 95 oC mềm Oligoanalyzer 3.1 ( trong 300 giây; theo sau bởi 40 chu kỳ bao gồm /calc/analyzer). Cuối cùng, các cặp mồi ứng viên 95 oC trong 30 giây, 30 giây với nhiệt độ bắt cặp sẽ được sử dụng để dự đoán kết quả HRM với đã lựa chọn, 72 oC trong 30 giây (đọc tín hiệu 1 nồng độ MgCl2 từ 2,0 – 3,5 mM bằng phần mềm lần); theo sau bởi các bước 95 oC trong 90 giây, Umelt hets 40 oC trong 60 giây, 65 oC trong 30 giây, 95 oC ( Cặp (đọc tín hiệu liên tục) và làm nguội với 37 oC mồi cho kết quả dự đoán đường cong nóng chảy trong 30 giây. (Melting curve) của 3 kiểu gen với sự tách biệt rõ Trang 7
4. Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Các mẫu DNA ứng viên dựa trên kết quả Phân tích mối liên hệ giữa SNP rs10941679 và HRM sẽ được giải trình tự nhằm xác định chính ung thư vú xác kiểu gene của mẫu DNA bằng phương pháp Trong các nghiên cứu ca/chứng về di truyền, giải trình tự động. Chúng tôi tiến hành khuếch đại phân tích Hardy-Weigberg (HW) cho mẫu chứng một đoạn DNA dài 319 bp với mồi xuôi (5’- (không bệnh) thường được tiến hành trước khi GTGTGTGAATGAAGGCGGTTTCCA-3’) và phân tích mối liên hệ để phát hiện lỗi trong quá mồi ngược (5’- GCTAAACCTG trình xác định kiểu gene [20]. Do đó, trong AATGCAGCAAAATAGCA-3’). Sau đó sản nghiên cứu này, các mẫu chứng cũng được tiến phẩm PCR được giải trình tự tại trung tâm nghiên hành phân tích HW nhằm đảm bảo sự chính xác cứu OUCRU bằng thiết bị giải trình tự động ABI trong quá trình phân tích kiểu gen, cũng như sự 3130. Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích chọn lựa mẫu nghiên cứu. Sau khi kiểm tra sự bằng phần mềm Sequencing Analysis 5.3. cân bằng HW, chúng tôi tiến hành phân tích mối Sau khi đã có được 3 mẫu DNA đại diện cho liên hệ giữa các điểm đa hình và ung thư vú bằng 3 kiểu gen, chúng tôi tiến hành tối ưu phương cách so sánh sự xuất hiện của các allele hay kiểu pháp HRM dựa trên khả năng có thể phân biệt gene nguy cơ trong 2 nhóm đối tượng nghiên cứu được 3 kiểu gen đại diện của SNP. Phản ứng bệnh và không bệnh; sau đó sẽ tiến hành tính xác HRM được tiến hành với các điều kiện đã sử suất thống kê theo hồi quy tuyến tính để xác định dụng trước đó trong bước tiến hành HRM trên sự tương quan của việc xuất hiện các yếu tố nguy các mẫu DNA ngẫu nhiên, với nồng độ MgCl2 cơ và sự xuất hiện bệnh. Để đạt được độ chính được khảo sát từ 2,5 – 3,5 mM. Điều kiện MgCl2 xác cao nhất trong phân tích hồi quy tuyến tính, sau khi được tối ưu sẽ được sử dụng cho bước cũng như sự cân bằng HW, chúng tôi sử dụng xác định kiểu gene bằng phương pháp HRM. phần mềm Stata 12. Tầm soát và ước tính tần số kiểu gen và alen Kết quả phân tích HW dựa vào giá trị P- value, với P > 0,05 cho thấy quần thể nghiên cứu 100 mẫu DNA từ bệnh nhân ung thư vú và nằm trong cân bằng HW. Kết quả phân tích mối 100 mẫu DNA từ người không mắc bệnh sẽ được liên hệ di truyền dựa vào giá trị P-Value của kiểm xác định kiểu gene bằng phương pháp HRM cùng định hồi quy tuyến tính, với P < 0,05 cho thấy kết với 3 mẫu chứng và 1 mẫu chứng âm (H O). Dựa 2 quả phân tích có ý nghĩa về mặt thống kê. vào hình dạng đường cong nóng chảy đại diện cho 3 kiểu gene của các mẫu chứng, các mẫu Ước tính độ tin cậy và cỡ mẫu sử dụng DNA với các đường cong nóng chảy đặc trưng sẽ Trong các nghiên cứu di truyền quần thể, cỡ được xác định kiểu gen của chúng. Tần số kiểu mẫu sử dụng là yếu tố ảnh hưởng đến độ tin cậy gen và alen của SNP rs10941679 (A/G) trong của kết quả nghiên cứu. Việc sử dụng đúng cỡ từng nhóm đối tượng bệnh và không bệnh được mẫu sẽ mang lại độ tin cậy cao và tiết kiệm được tính toán dựa trên công thức sau: kinh phí thực hiện. Trong nghiên cứu này cỡ mẫu ầ ố ạ ể được ấn định là 100 ca/chứng để phân tích bước ố á ể ể đó đầu mối liên hệ của SNP rs10941679 và ung thư = ổ ố á ể vú ở người Việt Nam. Sau khi đã có các thông tin . + ầ ố = . + + . Trang 8
5. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T4 - 2016 về sự phân bố kiểu gen trong quần thể, chúng tôi trên NCBI (Hình 1); đồng thời, trình tự sản phẩm tiến hành ước lượng độ tin cậy của kết quả khuếch đại cũng không chứa các SNP khác với nghiên cứu và dự đoán cỡ mẫu thích hợp cho các tần số > 1 %. Cặp mồi đã thiết kế được trình bày nghiên cứu sâu hơn trong tương lai bằng phần chi tiết ở Bảng 1. Cặp mồi này khi được kiểm tra mềm phân tích của Philippe Glaziou bằng phần mềm Primer-BLAST cho thấy có sự ( đặc hiệu cao, với duy nhất 1 sản phẩm mục tiêu KẾT QUẢ được khuếch đại. Bên cạnh đó, cấu trúc bậc 2 từ các cặp mồi không bền vững khi dự đoán với Thiết kế mồi phần mềm Oligo Analyzer, với giá trị Tm cao Các cặp mồi được thiết kế cho phân tích nhất của các sản phẩm bậc 2 này là 35,4 oC và giá rs10941679 dựa vào trình tự DNA có chứa SNP trị G cao nhất là -6,21 kcal/mole. Hình 1. vị trí của snp rs10941679 trên bộ gene Hình 1. Vị trí của SNP rs10941679 trên bộ gene Bảng 1. Mồi dùng cho phân tích HRM Chiều Sản Mồi Trình tự Tm dài phẩm Xuôi AATGCCAGTAAAATGTGGGATGCT 67.3 24 bp 90 bp Ngược TCGGTTGGGCTGTAAGATAAAAATA 64.5 25 bp AATGCCAGTAAAATGTGGGATGCTTTTTATTGACTATGGAAAGAACACAGCATAAAAA AAGCAAATATTTTTATCTTACAGCCCAACCGA Dự đoán kết quả HRM nhất khi tăng dần nhiệt độ; đường cong đồng hợp Sau khi đã có thông tin về cặp mồi, các sản tử thứ 2 có nhiệt độ tách mạch cao hơn và không phẩm khuếch đại cho mỗi SNP đã được dự đoán cắt 2 đường cong nóng chảy trên trong khoảng sự hình thành 3 dạng đường cong nóng chảy đại nhiệt độ tách mạch của sản phẩm. Với biểu đồ diện cho 3 kiểu gen trên Umelt. Kết quả dự đoán Normalized Melting Peak (Hình 2B), đường dị hợp tử có 2 đỉnh nóng chảy không tương xứng, tại điều kiện ban đầu (2,0 mM MgCl2, 0 % DMSO) cho thấy các sản phẩm khuếch đại có 3 trong khi đó, 2 đường đồng hợp tử chỉ có một dạng đường cong nóng chảy riêng biệt tương ứng đỉnh nóng chảy. Tại điều kiện ban đầu được khảo với 3 kiểu gene AA, AG VÀ GG (Hình 2). Trên sát trên Umelt, các kiểu gen của rs10941679 vẫn biểu đồ Normalized Melting Curves (Hình 2A) chưa có sự tách biệt rõ ràng, do đó, các nồng độ kiểu gen dị hợp tử được hiển thị bằng đường MgCl2 và DMSO đã được khảo sát nhằm cải cong màu đỏ và cắt đường cong đồng hợp tử thứ thiện sự tách biệt của các dạng đường cong nóng chảy cho 3 kiểu gen của SNP trong nghiên cứu. Trang 9
6. Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 AA GG AG Hình 2. Dự đoán đường cong nóng chảy của sản phẩm PCR chứa các SNP rs10941679 với điều kiện ban đầu. A) Normalized Melting Curves; B) Normalized Melting Peaks Dựa vào các nghiên cứu đã tiến hành, cũng Với nồng độ MgCl2 là 2,0 mM đã được lựa như đề nghị của nhà sản xuất MasterMix HRM chọn trong thí nghiệm trước, 3 nồng độ DMSO (0 được sử dụng trong nghiên cứu này, chúng tôi %, 5 % và 10 %) được khảo sát để xem ảnh khảo sát ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 từ 2,0 hưởng của chúng đối với sự phân biệt của 3 kiểu đến 3,5 mM đối với sự phân biệt của 3 dạng gen khi phân tích HRM bằng phần mềm Umelt. đường cong nóng chảy. Kết quả phân tích trên Ở các nồng độ được khảo sát, DMSO được nhận Umelt cho thấy tại các nồng độ MgCl2 khảo sát, thấy không có tác động đến sự tách biệt của 3 hình dạng của các đường cong nóng chảy đại dạng đường cong nóng chảy cho 3 kiểu gen của diện cho 3 kiểu gen đều có sự tương đồng (Hình rs10941679 (Hình 4) mà chỉ làm giảm nhiệt độ 3). Bên cạnh đó, khoảng nhiệt độ nóng chảy từ 2 Tm của sản phẩm PCR. Như vậy, DMSO không đỉnh của kiểu gene đồng hợp tử đều cách nhau có ảnh hưởng đến sự tách biệt của 3 kiểu gene, và 0,4 oC. Mặc dù vậy, sự tách biệt của 3 nhóm kiểu do đó, không cần sử dụng cho các phân tích gen cũng tương đối rõ ràng, với khoảng nhiệt độ HRM tiếp theo. o tách mạch là 78 – 86 C, phù hợp với phương Như vậy, điều kiện thích hợp cho phân tích pháp HRM. Do đó, nồng độ 2,0 mM MgCl2 được kiểu gene của SNP rs10941679 bằng phương lựa chọn cho phân tích HRM tiếp theo nhằm tiết pháp HRM đã được xác định dựa trên phần mềm kiệm lượng MgCl sử dụng 2 . Umelt, với nồng độ MgCl2 là 2,0 mM và 0 % DMSO. Trang 10
7. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T4 - 2016 AA GG AG Hình 3. Dự đoán đường cong nóng chảy của sản phẩm PCR chứa SNP rs10941679 theo khuynh độ nồng độ MgCl2. A,C,E,G: Normalized Melting Curves; B,D,F,H: Normalized Melting Peak AA GG AG Hình 4. Dự đoán đường cong nóng chảy của sản phẩm PCR chứa rs10941679 theo khuynh độ nồng độ DMSO. A,C,E,G: Normalized Melting Curves; B,D,F,H: Normalized Melting Peak Tối ưu hóa HRM - PCR Dựa vào nhiệt độ Tm của cặp mồi đã thiết phản ứng, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ bắt cặp kế, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR theo mồi tối ưu là 58 oC. o khuynh độ nhiệt độ từ 56 – 64 C để tìm ra nhiệt Bắt đầu tối ưu hoá điều kiện HRM trong thực độ bắt cặp tối ưu của cặp mồi này. Kết quả điện tế bằng điều kiện đã tối ưu in silico, kết quả phân di trên gel agarose 1,5 % cho thấy sản phẩm mục tích trên 1 mẫu DNA tại nồng độ 2,0 mM MgCl2 tiêu đã được khuếch đại thành công với vạch sản cho thấy không có sự xuất hiện của sản phẩm phẩm PCR nằm lân cận vị trí 90 bp trên thang PCR (dữ liệu không trình bày). Khi tăng nồng độ DNA chuẩn và không xuất hiện sản phẩm phụ, MgCl2 lên 2,5 mm và 3,0 mM, chúng tôi thấy có cho thấy cặp mồi được lựa chọn có độ đặc hiệu sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại và các đỉnh rất cao (Hình 5). Trong khoảng nhiệt độ được nóng chảy (Hình 6). Nồng độ 3,0 mm MgCl2 cho khảo sát, các vạch có độ sáng cao nhất ở nhiệt độ giá trị Ct thấp hơn (Hình 6A) và lượng sản phẩm o o 56 – 58 C, giảm dần từ nhiệt độ 60 – 62 C và khuếch đại nhiều hơn (Hình 7) so với tại nồng độ mất hẳn ở nhiệt độ 64 oC. Để đảm bảo lượng sản 2,5 mM; do đó 3,0 mM MgCl2 được lựa chọn cho phẩm được khuếch đại, cũng như độ đặc hiệu của phân tích HRM cho các thí nghiệm kế tiếp. Trang 11
8. Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Hình 5. Sản phẩm khuếch đại của SNP rs10941679 trên gel agarose 1,5 %. 1) Thang DNA 100bp; 2-6) Nhiệt độ bắt cặp ở 56 oC, 58 oC, 60 oC, 62 oC và 64 oC 2.5mM 3.0mM Hình 6. Phân tích sự khuếch đại (A) và đỉnh nóng chảy (B) của sản phẩm PCR Hình 7. Sản phẩm khuếch đại của SNP rs10941679 trên gel agarose 1,5 % theo nồng độ MgCl2 1) Thang DNA 100 bp; 2) 2,5 mM MgCl2; 3) 3,0 mM MgCl2 Trang 12
9. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T4 - 2016 Để xác định 3 mẫu chứng đại diện cho 3 kiểu thể là kiểu gen AA cho SNP rs10941679 (A/G). gen của các SNP mục tiêu, chúng tôi tiến hành Bên cạnh đó, đường cong liền được nhận thấy có phản ứng hrm cho vài mẫu DNA ngẫu nhiên với nhiệt độ tách mạch cao nhất, đồng thời hiện diện nhiệt độ Ta và nồng độ MgCl2 đã được lựa chọn với 1 đỉnh nóng chảy duy nhất được dự đoán là trước đó. Sau khi phân tích 8 mẫu DNA, chúng kiểu gen GG. Khoảng nhiệt độ cách biệt của 2 tôi thu nhận được 3 dạng đường cong nóng chảy đường cong gạch và đường cong liền là 0,7 oC, tách biệt rõ ràng (Hình 8). Với hình dạng đường thay vì 0,4 oC như đã được dự đoán trước đó trên cong nóng chảy có 2 đỉnh, đường chấm trong Umelt. Các nhận định trên cũng được phản ánh biểu đồ Normalized Melting Peak (Hình 8B) có thông qua biểu đồ different plot (Hình 8C) với khả năng rất cao chính là đường dị hợp tử AG. đường cong liền luôn duy trì cường độ huỳnh Nhận định trên cũng được củng cố thêm ở biểu quang cao nhất trong khoảng nhiệt độ tách mạch, đồ Normalized Melting Curves với hình dạng và đường cong chấm được dự đoán là kiểu gen dị đường cong chấm cắt đường cong gạch và đường hợp tử có cường độ thay đổi từ thấp đến cao so cong liền khi tăng dần nhiệt độ (Hình 8A). Từ với đường cong gạch. những dự đoán trên Umelt, đường cong gạch có Hình 8. Thực hiện HRM với 8 mẫu ngẫu nhiên. A) normalized melting curves; B) normalized melting peak; C) different plot 3 mẫu DNA ứng viên đại diện cho 3 dạng cong nóng chảy tách biệt rõ ràng nhất. Các mẫu đường cong nóng chảy đã được giải trình tự DNA đại diện cho 3 kiểu gen của rs10941679 nhằm xác định kiểu gen của chúng. Cặp mồi được khảo sát sự tách biệt với nồng độ MgCl2 từ được sử dụng cho giải trình tự cũng được thiết kế 2,5 – 3,5 mM (Hình 10). Với nồng độ 2,5 mM, ba dựa trên phần mềm Primer3Plus và kiểm tra độ dạng đường cong nóng chảy có sự trùng lắp trong đặc hiệu bằng phần mềm Primer-Blast. Kết quả nhiều giai đoạn của quá trình tách mạch (Hình giải trình tự cho thấy 3 mẫu DNA ứng viên có 3 10A,B,C). Ở nồng độ 3,5 mM, khoảng cách giữa kiểu gen khác nhau, tương ứng với 3 dạng đường 2 đỉnh AA và GG là 0,6 oC, thấp hơn 0,1oC so cong nóng chảy từ phân tích HRM trước đó với ở nồng độ 3,0 mM (Hình 10 E,H). Bên cạnh (Hình 9). Tại vị trí đa hình của mẫu được dự đó, tại nồng độ 3,0 mM, hình dạng của đường đoán có kiểu gen AA là 1 đỉnh huỳnh quang của cong nóng chảy cho kiểu gen AG có sự tách biệt nu A; đồng thời, mẫu có kiểu gen GG cũng được rõ ràng nhất so với kiểu gen AA và GG. Do đó, xác nhận với 1 đỉnh huỳnh quang G tại vị trí này. nồng độ 3,0 mM MgCl2 là nồng độ tối ưu cho Mẫu DNA được dự đoán mang kiểu gene AG có phân tích HRM của SNP rs10941679. Đồng thời, 2 đỉnh huỳnh quang của A và G trùng lắp tại vị khoảng nhiệt độ tách mạch cũng được xác định trí SNP. tại nồng độ này trong khoảng 72 – 78 oC. Thông Sau khi đã xác nhận được 3 mẫu chứng, tin trên giúp tiết kiệm thời gian tiến hành phân tích HRM trong các bước phía sau. chúng tôi tiến hành tối ưu nồng độ MgCl2 ở bước cuối cùng nhằm tìm ra điều kiện để 3 dạng đường Trang 13
10. Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Hình 9. Xác nhận 3 kiểu gen của SNP rs10941679 từ 3 mẫu DNA ứng viên Hình 10. Tối ưu nồng độ MgCl2 cho phân tích HRM rs10941679. A,D,G) Normalized Melting Curves; B,E,H) normalized melting peak; C,F,I) Different plot Như vậy, các điều kiện tối ưu cho phân tích Tầm soát kiểu gene và alen của rs10941679 kiểu gene của SNP rs10941679 bằng phương 200 mẫu DNA đã được xác định kiểu gene pháp HRM đã được xác nhận, với các thông số bằng phương pháp HRM đã tối ưu trước đó, bao như sau: Thành phần phản ứng HRM bao gồm: gồm 100 mẫu DNA từ người mắc ung thư vú và LightCycler®480 High Resolution Melting Dye 100 mẫu DNA người không mắc bệnh. Kết quả 1X; mồi xuôi và mồi ngược 0,2 µM mỗi loại; phân tích cho thấy 200 mẫu DNA trên phân bố DNA 30 ng; MgCl 3,0 mM; H O cho đủ 6 µL. 2 2 vào 3 dạng đường cong nóng chảy đại diện cho Thông số chu trình nhiệt HRM như sau: 95 oC ba kiểu gen; đồng thời không có sự xuất hiện của trong 300 giây; tiếp theo bởi 40 chu kỳ bao gồm: các dạng đường cong nóng chảy khác (Hình 11). 95 oC trong 30 giây, 58 oC trong 30 giây, 72 oC Tần số allele nguy cơ G trong quần thể người trong 30 giây; tiếp theo bởi 1 chu kỳ HRM bao bệnh ung thư vú chiếm 48,5 %; trong khi đó ở gồm: 95 oC trong 90 giây, 40 oC trong 60 giây, 72 quần thể người không mắc bệnh là 54,0 % (Bảng oC trong 30 giây và đọc liên tục ở 78 oC; kết thúc 2). bằng bước làm nguội ở 37 oC trong 30 giây. Trang 14