Tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 trên bệnh nhân ung thư phổi

Nội dung text: Tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 trên bệnh nhân ung thư phổi

1. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TÍNH ĐA HÌNH A4889G CỦA GEN CYP1A1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI Lê Hồng Công, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn Trường Đại học Y Hà Nội Đa hình A4889G trên gen CYP1A1 được chỉ ra là yếu tố nguy cơ cao gây ung thư phổi trên người Châu Á. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi so với nhóm đối chứng. 220 mẫu bệnh nhân ung thư phổi và 200 người không mắc bệnh ung thư được lựa chọn vào nghiên cứu. Kỹ thuật PCR - RFLP (PCR - Restriction fragment length polymorphism) được lựa chọn để xác định tính đa hình A4889G. Kết quả cho thấy, tần số alen A và G ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi chưa có sự khác biệt so với tần số alen A và G của nhóm đối chứng với p > 0,05. Tuy nhiên, kết quả cho thấy rõ mối liên hệ giữa kiểu gen AG, GG so với kiểu gen AA với yếu tố nguy cơ là hút thuốc lá và có ý nghĩa thống kê với tỷ suất chênh OR = 2,208; 95% CI = 1,127 - 4,326 p < 0,02. Bước đầu thấy được sự tương quan giữa đa hình thái A4889G của gen CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi với yếu tố nguy cơ hút thuốc lá ở người Việt Nam. Từ khóa: Ung thư phổi, đa hình A4889G, gen CYP1A1 I. ĐẶT VẤN ĐỀ nghề nghiệp và các đột biến gen di truyền qua những thế hệ khác nhau. Ung thư phổi là loại ung thư thường gặp nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu Cytochrome P450 (CYPs) là một liên họ ở nhiều nước trên Thế giới [1]. Hút thuốc lá lớn chứa các hemoprotein xúc tác rất nhiều được cho là nguyên nhân chính gây ung thư phản ứng enzym khác nhau để chuyển hóa phổi, 85 - 90% bệnh nhân ung thư phổi là do các chất nội sinh và ngoại sinh. Trong hệ hút thuốc lá. Tuy nhiên chỉ dưới 20% số người thống cytochrome P450, cytochrome P450 hút thuốc lá bị ung thư phổi, điều này cho thấy 1A1 (CYP1A1) là enzym chính hoạt hóa các các yếu tố khác bao gồm các biến thể di chất và là chìa khóa để kích hoạt quá trình truyền đóng một vai trò quan trọng trong cơ trao đổi chất giữa các hydrocarbons có nhân chế gây bệnh ung thư phổi [2]. Sự phát sinh, thơm, các amin dị vòng dẫn đến hình thành phát triển bệnh ung thư phổi diễn ra qua nhiều các phân tử DNA bất thường từ đó khởi đầu giai đoạn dưới tác động của các yếu tố nguy cho quá trình ung thư [3]. Kết quả của các cơ, sự mẫn cảm của gen và quá trình tích lũy nghiên mới được công bố gần đây cho thấy đột biến xảy ra trên các gen gây ung thư. Các có mối liên quan chặt chẽ giữa ung thư phổi yếu tố nguy cơ bao gồm hút thuốc lá, nhiễm với đa hình gen CYP1A1; trong đó, đa hình virus human papillomavirus (HPV), môi trường, A4889G của gen CYP1A1 được chỉ ra là yếu tố nguy cơ cao gây bệnh ung thư phổi trên các đối tượng người Châu Á [4 - 7]. Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường Để góp phần hiểu rõ hơn về mối liên quan Đại học Y Hà Nội Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn giữa đa hình A4889G của gen CYP1A1 với Ngày nhận: 15/12/2016 nguy cơ ung thư phổi, nghiên cứu được thực Ngày được chấp thuận: 26/2/2017 hiện nhằm: 48 TCNCYH 106 (1) - 2017
2. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 1. Xác định tính đa hình A4889G của gen + Thành phần phản ứng PCR (thể tích CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi và người 10,2μl) gồm: 4,7 μl Taq polymerase; 0,3μl mồi bình thường. xuôi; 0,3μl mồi ngược; 1,2μl DNA và 3,7μl H2O. 2. Đánh giá mối tương quan giữa tính đa + Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: hình A4889G của gen CYP1A1 ở bệnh nhân 94oC/5 phút, 35 chu kỳ [94oC/40 giây, 54oC/30 ung thư phổi và người bình thường. giây, 72oC/45 giây], 72oC/7 phút. Bảo quản II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP mẫu ở 15oC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, với điện thế 95V, trong 1. Đối tượng 25 phút. Nhóm bệnh lý: gồm 220 bệnh nhân ung Xác định đa hình A4889G của gen thư phổi được điều trị ở Bệnh viện Bạch Mai CYP1A1 bằng kỹ thuật cắt enzym giới hạn: trong đó có 165 nam và 55 nữ với tuổi trung + Thành phần phản ứng: 5μl H20; 1,5μl bình 60 ± 9,1. Bệnh nhân ung thư phổi được Buffer 10x; 0,5μl enzym MspI, 8μl sản phẩm thăm khám lâm sàng, làm các xét nghiệm cận PCR. Phản ứng cắt được ủ ở nhiệt độ 37oc lâm sàng và làm xét nghiệm giải phẫu bệnh để qua đêm, sau đó điện di trên gel agarose chẩn đoán xác định ung thư phổi. 2,5% với điện thế 80V, trong 90 phút và chụp Nhóm chứng: 200 người trong chương ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging system. trình quản lý tăng huyết áp và đái tháo đường, Khi enzym MspI cắt đoạn gen sẽ tạo ra các gồm 129 nam và 71 nữ, tuổi trung bình 66 ± đoạn DNA có kích thước 204 bp (kiểu gen 9,4. Được kiểm tra định kỳ bằng X-quang để GG); 149 bp và 55 bp (kiểu gen AA); 204bp, loại trừ ung thư phổi. 149 bp và 55 bp (kiểu gen AG). Bệnh nhân ung thư phổi và nhóm chứng - Phân tích số liệu được lấy 2ml máu chống đông trong EDTA. Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0 χ2 2. Phương pháp để phân tích số liệu. Dùng kiểm định để so sánh tỷ lệ kiểu gen của hai nhóm ung thư và Tách chiết DNA nhóm chứng. Để ước tính mối liên quan giữa DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu các kiểu gen và khả năng mắc ung thư phổi máu theo phương pháp sử dụng enzym pro- dùng tỷ xuất OR với khoảng tin cậy 95%. Các tein K và phenol: chloroform: isoamyl alcohol. kiểm định có ý nghĩa khi p < 0,05. - Kỹ thuật PCR-RFLP (PCR- Restriction 3. Đạo đức trong nghiên cứu Fragment Length Polymorphism): Đề tài đã được thông qua hội đồng đạo PCR được sử dụng để khuếch đại vùng đức của Trường Đại học Y Hà Nội theo chấp gen đa hình A4889G của gen CYP1A1 với thuận số 118/HĐĐĐ-ĐHYHN ngày 31/1/2013. cặp mồi: Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào Mồi xuôi: 5’ - TAG GAG TCT TGT CTC nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi ATG CCT - 3’. nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia Mồi ngược: 5’- CAG TGA AGA GGT GTA vào nghiên cứu. Các thông tin cá nhân sẽ GCC GCT - 3’. được đảm bảo bí mật. TCNCYH 106 (1) - 2017 49
3. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC III. KẾT QUẢ 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu Bảng 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu Các đặc điểm Ung thư phổi n1 (%) Nhóm chứng n2 (%) p Giới Nam 165 (75%) 129 (65%) > 0,05 Nữ 55 (25%) 71 (35%) Tuổi Trung bình (M) 60 66 > 0,05 Độ lệch (SD) 9,1 9,4 Hút thuốc lá Không 132 (60%) 143 (71,5%) Có 88 (40%) < 0,05 57 (28,5%) < 10 bao/năm 25 (37%) > 10 bao/năm 55 (63%) Giải phẫu bệnh K biểu mô tuyến 114 (51%) K không tế bào nhỏ 14 (6,2%) K tế bào nhỏ 13 (6%) Chưa xác định 84 (36,8%) Bảng 1 cho thấy tỷ lệ nam cao hơn nữ ở cả 2 nhóm nghiên cứu và độ tuổi trung bình là 60 ở nhóm ung thư phổi và 66 ở nhóm đối chứng. Ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi, tỷ lệ bệnh nhân không hút thuốc cao hơn nhóm bệnh nhân có hút thuốc và hút > 10 năm chiếm tỷ lệ cao hơn hút thuốc dưới 10 năm. Ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi đã được xác định giải phẫu bệnh; ung thư biểu mô tuyến chiếm tỉ lệ cao nhất (51%). 2. Xác định tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi và người bình thường Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại vùng gen chứa đa hình A4889G trên gen CYP1A1, sản phẩm PCR tiếp tục được cắt enzym MspI để xác định các kiểu gen khác nhau. 50 TCNCYH 106 (1) - 2017
4. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC BệnhBệnh nhânnhân ung thKưphổi phổi NgườiNgườibình bình thườngthường MK PCR (+) AA AG GG AG AG AA AG AG 204bp204 bp 149bp149 bp 55bp255 bp Hình 1. Kết quả xác định đa hình A4889G của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật PCR – RFLP MK: Marker 100bp, PCR: sản phẩm PCR không cắt enzym, (+) mẫu đối chứng dương cắt enzym. Sản phẩm cắt đoạn vùng A4889G trên gen CYP1A1 bằng enzym MspI trên các mẫu bệnh nhân ung thư phổi và nhóm chứng có kích thước khác nhau phù hợp với tính toán lý thuyết. Mẫu mang kiểu gen GG gồm một băng DNA có kích thước 204 bp. Mẫu mang kiểu gen AG gồm 3 băng DNA có kích thước 204 bp, 149 bp, 55 bp. Mẫu mang kiểu gen AA gồm 2 băng DNA có kích thước 149 bp và 55 bp (hình 1). Nghiên cứu tiến hành đánh giá sự phân bố kiểu gen AA, AG, GG giữa nhóm bệnh nhân ung thư phổi so sánh nhóm đối chứng (bảng 2). Bảng 2. So sánh sự phân bố kiểu gen ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm đối chứng Kiểu gen Nhóm ung thư phổi n1 (%) Nhóm đối chứng n2 (%) p AA 85 (38,6%) 90 (45,0%) AG 103 (46,8%) 85 (42,5%) > 0,05 GG 32 (14,6%) 25 (12,5%) Tổng 220 200 420 Kết quả bảng 2 cho thấy sự phân bố kiểu gen AA, AG, GG của nhóm bệnh nhân ung thư phổi lần lượt là 85 (38,6%), 103 (46,8%), 32 (14,6%), không có sự khác biệt so với nhóm chứng, p > 0,05. Để tìm sự khác biệt giữa nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm chứng, chúng tôi tiếp tục so sánh các kiểu gen với nhau. TCNCYH 106 (1) - 2017 51
5. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng 3. So sánh sự phân bố kiểu gen AG với kiểu gen AA ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm đối chứng Kiểu gen Nhóm ung thư phổi n1 (%) Nhóm đối chứng n2 (%) Kết quả AG 103 (54,8%) 85 (45,8%) OR = 1,283 AA 85 (45,2%) 90 (54,2%) (95% CI = 0,849 - 1,939) Tổng 188 175 Bảng 3 cho thấy kiểu gen AG và AA của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không có sự khác biệt so với nhóm chứng với tỷ suất chênh OR = 1,283 với độ tin cậy (95% CI = 0,849 - 1,939), p > 0,05. Bảng 4. So sánh sự phân bố kiểu gen GG với kiểu gen AA ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm đối chứng Kiểu gen Nhóm ung thư phổi n1 (%) Nhóm đối chứng n2 (%) Kết quả GG 32 (27,4%) 25 (21,7%) OR = 1,355 AA 85 (72,6%) 90 (78,3%) (95% CI = 0,743 - 2,473) Tổng 117 115 Bảng 4 cho thấy kiểu gen GG so với kiểu gen AA của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không có sự khác biệt so với nhóm chứng với tỷ suất chênh OR = 1,355 với độ tin cậy (95% CI = 0,743 - 2,743), p > 0,05. Chúng tôi tiến hành đánh giá sự phân bố của 2 kiểu gen AG - GG kết hợp (kiểu gen đột biến) so với kiểu gen nguyên thủy AA (wild type) và so sánh các kiểu gen này với nguy cơ hút thuốc lá. Bảng 5. So sánh sự phân bố kiểu gen AG, GG với kiểu gen AA ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm đối chứng Kiểu gen Nhóm ung thư phổi n1 (%) Nhóm đối chứng n2 (%) Kết quả AG - GG 135 (61,4%) 110 (55,0%) OR = 1,299 AA 85 (38,6%) 90 (45,0%) (95% CI = 0,881 - 1,917) Tổng 220 200 Bảng 5 cho thấy kiểu gen AG, GG so với kiểu gen AA giữa nhóm bệnh nhân ung thư phổi không có sự khác biệt so với nhóm chứng với tỷ suất chênh OR = 1,299 với độ tin cậy (95% CI = 0,881 - 1,917), p > 0,05. 52 TCNCYH 106 (1) - 2017
6. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng 6. So sánh kiểu gen AG, GG và kiểu gen AA với yêu tố nguy cơ hút thuốc lá ở nhóm ung thư phổi và đối chứng Nhóm ung thư phổi Nhóm đối chứng Kiểu gen Kết quả có hút n1 (%) có hút n2 (%) AG - GG 53 (60,2%) 24 (40,7%) OR = 2,208 AA 35 (39,8%) 35 (59,3%) (95% CI = 1,127 - 4,326) Tổng 88 59 Mặc dù hai kiểu gen này không có sự khác biệt giữa hai nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm đối chứng. Tuy nhiên, kết quả bảng 6 cho thấy rõ mối liên hệ giữa kiểu gen AG, GG so với kiểu gen AA với yếu tố nguy cơ là hút thuốc lá và có ý nghĩa thống kê với tỷ suất chênh OR = 2,208; (95% CI = 1,127 - 4,326) p < 0,02. Điều này phù hợp với nhiều các nghiên cứu trên thế giới đã công bố về mối liên quan giữa hút thuốc lá và cơ chế gây ung thư phổi. IV. BÀN LUẬN Trong cộng đồng người châu Á, các đa Châu Á có tương quan với nguy cơ mắc ung thư phổi cao hơn so với cộng đồng người da hình thái của gen CYP1A1 đã được xác định làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi so với trắng và châu Mỹ [6]. Năm 2011, nghiên cứu cộng đồng người châu Âu và châu Mỹ [6; 7]. mới nhất của tác giả người Trung Quốc cũng cho thấy có mối liên quan chặt chẽ giữ nguy Một số nghiên cứu đối với người dân Nhật Bản cũng chỉ ra mối liên quan giữa kiểu gen cơ ung thư phổi với kiểu gen CYP1A1 CYP1A1 và nguy cơ ung thư phổi, đặc biệt ở T6235C và CYP1A1 A4889G [9]. ung thư phổi tế bào nhỏ [4; 5]. Ở Việt Nam, Tuy nhiên, kết quả ở nghiên cứu này các nghiên cứu về mối liên quan giữa đa hình không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống gen CYP1A1 và nguy cơ mắc ung thư phổi kê đối với sự phân bố alen của đa hình còn hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu này được A4889G trên gen CYP1A1 giữa nhóm bệnh thực hiện để hiểu rõ hơn về mối liên quan nhân ung thư phổi và nhóm chứng với p > giữa các kiểu gen của đa hình A4889G trên 0,05 điều này rất khác biệt với các nghiên cứu gen CYP1A1 với ung thư phổi. của các tác giả châu Á về đa hình A4889C trên gen CYP1A1 [2; 10; 11]. Có thể chúng tôi Năm 1990, tác giả người Nhật lần đầu tiên công bố mối liên quan giữa kiểu gen CYP1A1 cần một nghiên cứu với cỡ mẫu theo phân với ung thư phổi trong một quần thể người loại giải phẫu bệnh lớn hơn và thời gian dài châu Á, khi đó tác giả mới chỉ đưa ra kết luận hơn. ở bệnh nhân ung thư phổi có đa hình CYP1A1 Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ các kiểu cao gấp ba lần nhóm khỏe mạnh [8]. Năm gen AG và GG của đa hình A4889G gen 1993, một nghiên cứu cho thấy kiểu gen CYP1A ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi có A4889G của gen CYP1A1 ở cộng đồng người hút thuốc có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê TCNCYH 106 (1) - 2017 53
7. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC với kiểu gen AA của đa hình CYP1A1 của study of CYP1A1 polymorphisms identifies risk nhóm chứng với p < 0,05. Kết quả này tương haptotypes in nonsmall cell lung cancer. Tho- tự với rất nhiều các nghiên cứu của các tác racic oncology, 7, 152-159. giả Châu Âu và Châu Á [6; 7; 2; 11]. Đặc biệt 3. Vineis P, Alavanja M, Buffler P et al. theo kết quả nghiên cứu của một tác giả (2004). Tobacco an cancer: recent epidemiol- người Châu Âu trên quần thể người Châu Âu ogical evidence. J.Natl. Cancer. Inst, 96, 99 - và da trắng [12]. 106. 4. Nakachi K, Imai K, Hayashi S, Kawajiri V. KẾT LUẬN K (1993). Polymorphisms of the CYP1A1 and glutathione S-transferase genes associated Nghiên cứu đã xác định được đa hình with susceptibility to lung cancer in relation to A4889G trên gen CYP1A1 ở nhóm ung thư cicagette dose in a Japanes population. Can- phổi và nhóm chứng. cer Res, 53, 2994 - 2999. Sự phân bố giữa các kiểu gen AA với kiểu 5. Hayashi S, Watanabe J, Kawajiri K. gen AG và GG của đa hình A4889G gen (1992). Hight susceptibility to lung cancer CYP1A1 ở hai nhóm ung thư phổi và nhóm analysed in term of combined genotypes of chứng là chưa có sự khác biệt có ý nghĩa. CYP1A1 and Mu - class glutathione Tuy nhiên, có sự khác biệt có ý nghĩa thống S-transferase genes. Jpn J cancer Res, 83, kê ở nhóm ung thư phổi có hút thuốc và nhóm 866 - 870. chứng. 6. Cosma G, Crofts F, Currie D et al (1993). The relationship between genotype Lời cảm ơn and function of the human CYP1A1 gene. J Toxicol Environ Health, 40, 309 - 316. Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh 7. Garte S (1998). The role of ethnicity in phí của đề tài nhánh cấp nhà nước “Đánh giá cancer susceptibility gene polymorphisms: the sự phân bố kiểu gen của một số gen liên quan axample of CYP1A1. Carcinogenesis, 19, đến ung thư phổi và ung thư gan” thuộc đề tài 1329 - 1332. nhiệm vụ Quỹ gen “Đánh giá đặc điểm di 8. Kawajiri K, Nakachi K, Imai K et al truyền người Việt Nam”. Nhóm nghiên cứu (1990). Identification of genetically high risk trân trọng cảm ơn Trung tâm Hô hấp, Trung individuals to lung cancer by DNA polymor- tâm Y học hạt nhân và Ung bướu - Bệnh viện phisms of cytochrome P4501A1 gene. FEBS Bạch Mai, Trung tâm Nghiên cứu Gen - Pro- let, 263, 131 - 133. tein, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều 9. Chen Z (2011). The effect of CYP1A1 kiện giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu. polymorphisms on the risk of lung cancer: a global meta-analysis based on 71 case control TÀI LIỆU THAM KHẢO studies. Mutagenesis, 26, 437 - 446. 1. Walser T, Cui X, Yanagawa J, Lee JM, 10. Sheikh M Shaffi., Mohd Amin Shah., Heinrich LE et al (2008). Smoking and lung Imtiyaz Ahmad Bhat et al (2009). CYP1A1 cancer, Proc. Am. Thorac, 5, 811 - 815. polymorphisms and risk of lung cancer in 2. Wright C M, Larsen J E, Colosimo M Ethmic Kashmiri Popolation. Research L, Bar J J et al (2010). Genetic association communication, 5, 651 - 656. 54 TCNCYH 106 (1) - 2017
8. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 11. Nan Song, Wen Tan, Deyin Xing, 12. Paula Mota, David Silva Moura, Dongxin Lin (2001). CYP1A1 polymorphisms Maria Graca Vale, Henriqueta Coimbra, and risk of lung cancer in relation to tobacco Lina Carvalho et al (2010). CYP1A1 m1, m2 smoking: a case-control study in China. polymorphisms: genetic susceptibility to lung Carcinogenesis, 22, 11 - 16. cancer. Artigo Original, 9, 89 - 98. Summary POLYMORPHISM A4889G OF CYP1A1 GENE IN LUNG CANCER PATIENTS The polymorphism A4889G of CYP1A1 gene has been shown to cause high risk factor for lung cancer in Asian subjects. This study was carried out on 220 lung cancer patients compared with 200 control samples by PCR - RFLP method (PCR-Restriction fragment length polymorphism) to identify the polymorphism A4889G of CYP1A1 gene. Results showed that the frequency of A and G allele in lung cancer patients were not different from that of the control group with p > 0.05; the difference between the frequencies of G genotype (AG, GG) in the lung cancer group with to- bacco smoking and the frequencies of AA genotype in the control group with p < 0.05 level was statistically significant. In conclusion, we initially observed the correlation between polymorphism A4889G of CYP1A1 gene with lung cancer and tobacco smoking risk in Vietnam. Keywords: lung cancer, polymorphism A4889G, CYP1A1 gene TCNCYH 106 (1) - 2017 55