Thu nhận kháng thể igy có ái lực cao với độc tố vi nấm fumonisin sử dụng trong chẩn đoán miễn dịch

Nội dung text: Thu nhận kháng thể igy có ái lực cao với độc tố vi nấm fumonisin sử dụng trong chẩn đoán miễn dịch

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 THU NHẬN KHÁNG THỂ IgY CÓ ÁI LỰC CAO VỚI ĐỘC TỐ VI NẤM FUMONISIN SỬ DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH Đỗ Như Bình*; Trần Thị Huyền Trang** Tạ Mai Trang**; Lê Quang Hòa** TÓM TẮT Mục tiêu: tạo kháng thể có ái lực cao với fumonisin B1 và B2 (FB1 và FB2), làm nguyên liệu khởi đầu cho phương pháp miễn dịch phát hiện nhanh các độc tố trên. Vật liệu và phương pháp: độc tố FB1 được gắn với Keyhole limpet hemocyanin (KLH) tạo thành phức hợp FB1-KLH để gây miễn dịch cho gà mái. Kháng thể IgY tạo ra được tách chiết, tinh sạch và kiểm tra độ đặc hiệu với FB1 và FB2 thông qua phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp. Kết quả: thời điểm thu trứng tốt nhất từ 9 - 14 ngày sau lần tiêm cuối cùng và quy trình tinh sạch cho chế phẩm IgY có độ tinh sạch cao. Giá trị IC50 của FB1 và FB2 đối với chế phẩm IgY trong phản ứng ELISA cạnh tranh xác định được lần lượt là 10 và 49 ng/ml. Kết luận: chế phẩm IgY được tạo ra trong nghiên cứu có khả năng sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất bộ kit nhanh phát hiện nhanh FB. * Từ khoá: Fumonisin; Kháng thể lòng đỏ trứng (IgY); ELISA. Obtaining High Affinity IgY Against Fumonisin with Potential Use in Immunodiagnostic Summary Objectives: To produce high affinity antibody against fumonisin (FB) FB1 and FB2, that can be used as materials for some immunologic methods in detection of toxin. Materials and methods: FB1- Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate was made to generate immunogenicity in hen. Yolk immunoglobulin (IgY) antibody was purified by extraction and tested the specificity against FB1, FB2 by indirect competitive ELISA. Results: The best time for egg collection was 9 - 14 days after the last immunisation and the extraction protocol obtains high purity IgY antibody. The IC50 value of IgY against FB1 and FB2 in the indirect competitive ELISA were 10 and 49 ng/ml, respectively. Conclusion: IgY can be used as materials for developing rapid test kit to detect FB. * Key words: Fumonisin; Yolk immunoglobulin (IgY); ELISA. ĐẶT VẤN ĐỀ tố phổ biến, có độc tính cao nhất trong Độc tố fumonisin nhóm B (FB), thường nhóm fumonisin, gây nhiều bệnh ở người tồn tại trong ngô cũng như các thực phẩm và động vật như chứng nhũn não ở ngựa, có nguồn gốc từ ngô, được sản sinh từ chứng phù phổi ở lợn, có độc tính đối với chủng nấm Fusarium moniliforme [1]. gan thận ở nhiều loài khác và ung thư Trong đó, FB1 và FB2 được coi là hai độc thực quản ở người [5, 7]. * Học viện Quân y ** Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Như Bình (binhvef2006@gmail.com) Ngày nhận bài: 10/04/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/05/2016 Ngày bài báo được đăng: 27/05/2016 29
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 Hiện nay, phương pháp chuẩn để phát các cầu nối glutaraldehyde dư chưa gắn hiện và định lượng FB1, FB2 trong các được với FB1 sẽ cho tác dụng với 6,5 mg mẫu thực phẩm đều dựa trên kỹ thuật sắc L-lysine (Sigma) với điều kiện có khuấy ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau quá pháp này yêu cầu cao về thiết bị cũng trình thẩm tích loại FB1 tự do, sản phẩm như trình độ kỹ thuật viên, do vậy không cuối cùng tạo ra là cộng hợp KLH-FB1. thích hợp với các phép phân tích sàng lọc Cộng hợp BSA-FB1 được chế tạo để làm tại hiện trường. Gần đây, nhờ ứng dụng đối chứng dương cho quy trình. kỹ thuật sắc ký miễn dịch dưới dạng que * Kiểm tra hiệu quả tạo cộng hợp KLH- thử với hợp phần quan trọng nhất trong FB1: que thử phát hiện FB là kháng thể [4] việc Cộng hợp KLH-FB1 được đặc tính hóa phát hiện độc tố vi nấm nói chung và FB thông qua kỹ thuật ELISA kẹp đôi. Đo các nói riêng đã được đơn giản hóa. Mục tiêu giá trị mật độ quang (OD) ở bước sóng của nghiên cứu: Sản xuất kháng thể IgY 450 nm và 630 nm bằng máy đọc khay vi kháng FB1 bằng cách gây đáp ứng miễn thể (Synergy HT, BioTek). Hiệu số của dịch ở gà. IgY được vận chuyển qua lòng các giá trị OD450nm và OD630nm thể hiện đỏ trứng, do vậy có thể tinh sạch với số lượng cộng hợp KLH-FB1 có trong mẫu. lượng lớn từ trứng gà bằng phương pháp kết tủa đơn giản, chi phí thấp [2, 3]. * Tiêm cộng hợp gây miễn dịch trên gà mái: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 02 gà mái đang thời kỳ đẻ trứng được NGHIÊN CỨU tiêm gây đáp ứng miễn dịch với liều 0,2 mg cộng hợp KLH-FB1 trong tổng thể 1. Vật liệu nghiên cứu. tích 1 ml chứa 50% tá chất FCA (Freund’s Gà siêu trứng Ai Cập, số lượng 03 con complete adjuvant) ở ngày đầu tiên. Sau do Trang trại Gà giống Thụy Phương 10 ngày (ngày thứ 10), tiêm nhắc lại gà (Long Biên, Hà Nội) cung cấp. Hóa chất lần thứ nhất với liều 0,1 mg cộng hợp sử dụng gồm: độc tố FB1 (Santa Cruz KLH-FB1 trong tổng thể tích 1 ml chứa Biotechnology), FB2 (Sigma), kháng thể 50% tá chất FIA (Freund’s incomplete chuột đơn dòng kháng FB1 (Biotez), các adjuvant). 10 ngày tiếp theo (ngày thứ cộng hợp phát hiện gắn HRP kháng KLH 20), tiêm nhắc lại gà lần thứ hai với liều (Gallus Immunotech) và kháng IgY (Santa lượng tương tự như lần tiêm nhắc lại thứ Cruz Biotechnology) cùng những hóa nhất. Trứng gà không tiêm cũng như chất khác (Hãng Thermo Scientific, Sigma trứng gà tiêm KLH-FB1 ở các thời điểm và Promega). sau khi tiêm thu lại để tinh sạch kháng thể 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. IgY nhằm kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA. * Chế tạo cộng hợp KLH-FB1 và BSA- * Tinh sạch IgY từ trứng gà: FB1: Tách kháng thể IgY trong trứng gà thu Để tạo liên kết giữa FB1 với KLH, được ở các thời điểm tiêm khác nhau chúng tôi sử dụng glutaraldehyde để nối theo phương pháp kết tủa PEG (Polson gốc -NH2 của KLH và FB1. Cuối cùng, và CS, 1985) [6]. Sau đó, hòa tan kết tủa 30
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 thu được trong 3 ml PBS và đổi đệm bằng cột 100 kDa (Ultracell, Millipore) với PBS để thu nhận chế phẩm IgY tinh sạch, định lượng bằng cách đo OD ở bước sóng 280 nm và kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE (12%). * Xác định thời điểm thu trứng có hiệu giá kháng thể IgY cao nhất với FB1: Tiến hành kỹ thuật ELISA gián tiếp để tìm ra thời điểm thu trứng cho hiệu giá kháng thể IgY cao nhất với FB1. Cường Hình 1: Hiệu quả phản ứng của cộng hợp độ màu càng mạnh, lượng IgY kháng FB1 KLH-FB1 với kháng thể đơn dòng chuột có trong mẫu càng nhiều. kháng FB1. * Xác định khả năng phản ứng của chế (Giá trị OD được tính bằng hiệu số phẩm IgY với FB1 và FB2: OD450nm và OD630nm, biểu diễn bằng giá trị Xác định khả năng phản ứng của chế trung bình ± độ lệch chuẩn) phẩm IgY với FB1 và FB2 bằng kỹ thuật Khi lượng cộng hợp KLH-FB1 đạt ELISA cạnh tranh. Cho ủ lượng IgY lần 1 ng/giếng, tương ứng với nồng độ 10 lượt với 0, 1, 10, 100 và 1.000 ng FB1 ng/ml, giá trị OD thu được bắt đầu có sự hoặc FB2 trong 30 phút ở 37oC trước khi sai khác có ý nghĩa so với mẫu kiểm cho vào giếng. Để đánh giá khả năng chứng. Kết quả này phù hợp với nghiên phản ứng của chế phẩm IgY thu nhận cứu về hiệu quả cộng hợp của FB1 với được với FB1 và FB2, tiến hành xác định protein mang đã được công bố với lượng các giá trị IC50 của FB1 và FB2 (nồng độ cộng hợp cho kết quả dương tính trong FB1 và FB2 ức chế 50% phản ứng của phép thử ELISA nằm trong khoảng từ 1 - IgY với BSA-FB1 trong ELISA cạnh 300 ng/giếng [7, 8]. Từ đây, có thể nhận tranh). Tính giá trị này theo hàm hồi quy thấy đã tạo thành công cộng hợp KLH- logistic dựa trên mối liên quan giữa giá trị FB1 và có thể sử dụng cộng hợp này để log của lượng FB1 và FB2 với giá trị OD. gây đáp ứng miễn dịch cho gà. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 2. Đánh giá độ tinh sạch của kháng BÀN LUẬN thể IgY bằng SDS-PAGE. Sau quá trình tinh sạch bằng phương 1. Đặc tính hóa cộng hợp KLH-FB1 pháp kết tủa với PEG và siêu lọc với cột bằng ELISA kẹp đôi. 100 kDa, lượng IgY thu được từ một quả Cộng hợp KLH-FB1 chế tạo trong trứng đạt 40 - 50 mg (căn cứ theo kết quả nghiên cứu này trước khi tiêm gây miễn đo OD ở bước sóng 280 nm, không trình dịch trên gà được kiểm tra hoạt tính bằng bày trong bài báo). Đánh giá độ tinh sạch phản ứng với kháng thể đơn dòng kháng của các chế phẩm IgY bằng phương FB1. pháp điện di biến tính SDS-PAGE. 31
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 Hình 2: Điện di SDS-PAGE (12%) kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể IgY sau các bước của quy trình tinh sạch. (M: Marker protein Gangnam Stain; 1: 10 µg kháng thể IgY sau khi kết tủa với PEG; 2,3,4: 3, 10, 30 µg kháng thể IgY sau siêu lọc với cột 100 kDa). Ngoài các băng ở vị trí 65 kDa, tương phép tạo ra chế phẩm IgY có độ tinh sạch ứng với tiểu phần lớn của IgY và 25 kDa, cao. tương ứng với tiểu phần nhỏ của IgY, chế 3. Lựa chọn thời điểm thu trứng cho phẩm IgY sau khi kết tủa với PEG vẫn hiệu giá kháng thể cao nhất. chứa hai protein tạp có kích thước khoảng 40 và 45 kDa. Tuy nhiên, sau khi IgY từ trứng gà không tiêm, trứng gà siêu lọc qua cột 100 kDa, loại bỏ hoàn tiêm PBS và tá chất FCA/FIA, cũng như toàn được protein tạp nhiễm này. Ngay trứng gà thu ở các thời điểm khác nhau cả khi điện di 30 µg chế phẩm IgY cũng sau khi tiêm cộng hợp gây đáp ứng miễn không quan sát được các băng nhiễm tạp dịch đã được tinh sạch và kiểm tra khả này. Như vậy, quy trình tinh sạch kết hợp năng phản ứng cộng hợp BSA-FB1 thông kỹ thuật siêu lọc và kết tủa với PEG cho qua kỹ thuật ELISA gián tiếp. Hình 3: Ảnh hưởng của thời gian thu trứng lên hiệu giá của chế phẩm IgY. 32
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 Kết quả thử nghiệm cho thấy IgY thu là 0,2 và 0,1 mg, hiệu giá kháng thể đạt được từ trứng gà không tiêm cũng như cao nhất ở thời điểm 9 - 14 ngày sau lần trứng gà tiêm PBS và tá chất FCA/FIA tiêm cuối, phù hợp với nghiên cứu của không phản ứng với BSA-FB1. Chứng tỏ Schade và CS [7] ít nhất cần phải có 2 lần trước khi tiêm cộng hợp, gà không có đáp tiêm kháng nguyên để gây tính đáp ứng ứng miễn dịch với FB1, cũng như PBS và miễn dịch trên gà, kháng thể tinh sạch từ các thành phần tá dược không gây đáp lòng đỏ trứng, nên kiểm tra 14 ngày sau ứng miễn dịch trên gà tạo IgY có phản lần tiêm cuối cùng xem còn tính đáp ứng ứng với FB1. Trong khi đó, gà được tiêm miễn dịch hay không?. cộng hợp KLH-FB1, kể từ ngày thứ 23 4. Xác định khả năng phản ứng của sau tiêm, trong trứng bắt đầu tạo IgY có chế phẩm IgY với FB1 và FB2. phản ứng với FB1. Hiệu giá kháng thể đối với FB1 đạt mức cao nhất trong khoảng Để đánh giá khả năng phản ứng của 29 - 34 ngày sau tiêm, hay 9 - 14 ngày chế phẩm IgY thu nhận được với FB1 và sau lần tiêm cuối cùng. Như vậy, với quy FB2, chúng tôi tiến hành xác định các giá trình gây đáp ứng miễn dịch gồm 3 lần trị IC50 của FB1 và FB2 (nồng độ FB1 và tiêm, khoảng cách giữa các lần tiêm 10 FB2 ức chế 50% phản ứng của IgY với ngày, lượng cộng hợp KLH-FB1 sử dụng BSA-FB1 trong ELISA cạnh tranh). A B Hình 4: Khả năng phản ứng của IgY với FB1 và FB2. A. IgY và FB1 B. IgY và FB2 Ngay ở nồng độ thử nghiệm nhỏ nhất được là 10 ng/ml, trong khi đó IC50 của (10 ng/ml) (tương ứng với lượng độc tố FB2 là 49 ng/ml. FB1 và FB2 đưa vào giếng 1 ng), các giá So với nghiên cứu của Marcel và CS trị OD thu được giảm mạnh so với mẫu [5], các giá trị IC50 của FB1 với 14 dòng kiểm chứng. Khi nồng độ FB1 và FB2 đạt kháng thể chuột đơn dòng nằm trong mức 1 µg/ml, giá trị OD hầu như không khoảng 300 - 670 ng/ml. Như vậy, có thể giảm nữa, mặc dù nồng độ tăng lên đến nhận thấy ái lực của chế phẩm IgY tạo ra 10 µg/ml. Giá trị IC50 của FB1 xác định trong nghiên cứu này cao hơn nhiều lần 33
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 so với kháng thể đơn dòng trong nghiên a review. Biotechnol Agron Soc Environ. cứu trên. Nghiên cứu của Yan-son và CS 2009, 13 (2), pp.295-308. (2012) [10], IC50 của FB1 với kháng thể 3. Dias dSW; DV Tambourgi. IgY: đơn dòng là 11 ng/ml, đồng thời kháng a promising antibody for use in thể đơn dòng này cũng có phản ứng chéo immunodiagnostic and in immunotherapy. Vet với FB2 (60,4%). Các thông số này khá Immunol Immunopathol. 2010, 135, pp.173-180. trùng khớp với kết quả thu được của 4. Kadir MKA, IE Tothill. Development of chúng tôi. an electrochemical immunosensor for fumonisins Xét về mặt giá thành, nếu sử dụng 0,5 µg detection in foods. Toxins Basel. 2010, 2 (4), chế phẩm IgY cho một phép thử miễn pp.382-398. dịch như đã nêu ở trên, theo tính toán, từ 5. Marcel H, Elissalde et al. Development một quả trứng gà lựa chọn ở thời điểm tối of an improved monoclonal antibody‐based ưu, chúng tôi có thể tinh sạch được 40 - Elisa for fumonisin b1–3 and the use of 50 mg chế phẩm IgY đủ để thực hiện từ molecular modeling to explain observed 80.000 - 100.000 phản ứng miễn dịch. detection limits. 7 (2), Food and agricultural Đây chính là ưu điểm cơ bản của việc sử immunology. 1995, pp.109-122. dụng kháng thể IgY để chế tạo phép thử 6. Polson A, T Coetzer, J Kruger, E miễn dịch phát hiện nhanh FB nói riêng vonMaltzahn, KJ vanderMerwe. Immunol. và các tác nhân gây bệnh nói chung. Invest. 1985, 14, p.323 7. Schade R, Calzado EG, Sarmiento R, KẾT LUẬN Chacana PA, Porankiewicz-Asplund J, Terzolo HR. Chicken egg yolk antibodies (IgY- Nghiên cứu đã tạo thành công chế technology): a review of progress in phẩm IgY có ái lực cao với FB1 và FB2, production and use in research and human có khả năng sử dụng trong các sinh phẩm and veterinary medicine. Altern Lab Anim. miễn dịch phát hiện độc tố. Hiện nay, chế 2005, 33 (2), pp.129-154. phẩm này đang được sử dụng để chế tạo 8. Venkataramana M, K. Navya CS, SR que thử sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh Priyanka, HS Murali, HV Batra. Development các độc tố FB trong thực phẩm. Phản and validation of an immunochromatographic ứng chéo của kháng thể IgY với độc tố vi assay for rapid detection of fumonisin B1 from nấm khác như aflatoxin, ochratoxin A, cereal samples. J Food Sci Technol. 2014, 51 zearalenone sẽ được tiếp tục đánh giá (9), pp.1920-1928. trong thời gian tới. 9. Wang DS, Liang YX, Nguyen TC, Le DD, Tanaka T, Ueno Y. Natural co-occurrence TÀI LIỆU THAM KHẢO of fusarium toxins and aflatoxin B1 in corn for 1. Antonissen G et al. Fumonisins affect feed in north Vietnam. Nat Toxins. 1995, 3 (6), the intestinal microbial homeostasis in broiler pp.445-449. chickens, predisposing to necrotic enteritis. 10. Yan-Song L, Z Yu, L Shi-Ying, G De- Vet Res. 2015, 46 (1), p.98. Jun, R Hong-Lin, M Xian-Mei, BHZL Chao, W 2. Chalghoumi R, Y Beckers, D Portetelle, Zhe, L Xiao-Bing, L Zeng-Shan. Development A Théwis. Hen egg yolk antibodies (IgY), of a one-step test strip for rapid screening of production and use for passive immunization fumonisins B1, B2 and B3 in maize. Food against bacterial enteric infections in chicken: Control. 2012, 24, pp.72-77. 34