Thiết lập hệ chuyển gen retrovirut tái tổ hợp biểu hiện IL - 12 ở mức độ mARN

Nội dung text: Thiết lập hệ chuyển gen retrovirut tái tổ hợp biểu hiện IL - 12 ở mức độ mARN

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 THIẾT LẬP HỆ CHUYỂN GEN RETROVIRUT TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN IL-12 Ở MỨC ĐỘ mARN Ngô Tất Trung*; Lê Hữu Song*; Phan Quốc Hoàn* Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Toàn** TÓM TẮT Protein được biểu hiện từ tế bào (TB) động vật có vú có hoạt tính cao. Tuy nhiên, việc đưa các đoạn gen mã hóa protein đích vào TB động vật rất phức tạp, làm tăng chi phí biểu hiện và tính chế sau này. Để khắc phục điều này, công nghệ chuyển gen dựa trên khung virut tái tổ hợp đã được triển khai. Bằng cách kết hợp chuyển gen retrovirut với các công nghệ tổng hợp nucleotid và tối ưu hóa codon, chúng tôi đã tạo ra dòng TB bài tiết virut mã hóa IL-12 mRNA. * Từ khóa: IL-12; Retrovirut; Protein tái tổ hợp. Construction of Recombinant Retrovirus Plasmid Engineering System for Expression of Interleukin-12 mRNA Level Summary Recombinant protein expressed from mammalian cell culture is a good activity. However, the current procedure of delivery target open reading frame into mammalian host is cumbersome, which makes the chimeric protein expension. To overcome the limits of available mammalian expression systems, many recombinant virus based gene deliver technologies have been implemented, in which the retrovirus backbone is one option of choice. In this study, by combining recombinant retrovirus plasmid engineering with codon optimization, we have successfully created a cell line with significant secreted level of IL-12 mRNA. * Key words: IL-12; Retrovirus; Recombinant protein. ĐẶT VẤN ĐỀ vai trò là tác nhân tăng trưởng cho TB Interleukin-12 ban đầu được biết đến giết tự nhiên (Natural killer cell growth như là một cytokine tiÒn viªm, thường factor). Cytokine này được hợp thành từ hai tiểu phần (subunit) mã hóa bởi hai được tạo ra bởi tÕ bµo Dendritic (DCs) và gen khác nhau. Khi các tiểu phần này thực bµo. Cytokine này có vai trò cảm được dịch mã tạo thành IL-12 p35 và IL- ứng bài tiết interferon-γ (IFN-γ), nhờ đó 12 p40. Hai tiền cytokine này sau khi bài kích thích quá trình biệt hóa hình thành tiết sẽ tiếp tục được sửa đổi sau dịch mã TB T helper 1 (TH1), đây chính là yếu tố và lai ghép với nhau, tạo thành phân tử kết nối các phản ứng miễn dịch bẩm sinh cytokine heterodimer IL-12 p70 với đầy với miễn dịch thích nghi. Sau này, khoa đủ chức năng sinh học cần thiết cho điều học đã chứng minh IL-12 đóng hòa miễn dịch. * Bệnh viện TWQĐ 108 ** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Lĩnh Toàn (toannl@vmmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 23/05/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/09/2014 Ngày bài báo được đăng: 02/12/2014 70
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Tác dụng kinh điển mà con người vẫn tính ức chế ung thư mạnh nhất IL-12 vào biết về IL-12 trong điều trị ung thư đó là: i) thử nghiệm lâm sàng tiếp theo. Vì vậy, kích thích quá trình biệt hóa và định hình công nghệ sản xuất interleukine tái tổ hợp tính đặc hiệu thụ thể (T cell receptor - IL-12 không chỉ đem lại lợi ích cho việc TCR) trên bề mặt TB lympho T trợ giúp phát triển các liệu pháp điều trị ung thư (helper T cell) thông qua kích thích quá liên quan đến IL-12, mà còn có thể phối trình tăng sinh của TB trình diện kháng kết hợp sử dụng IL-12 với các interleukine nguyên Dendritic; ii) định hướng độc tiềm năng khác như: IL-7, IL-15, IL-18, tính của TB T gây độc (cytotoxic CD8 IL - 21 T lymphocyte) [1, 2], iii) ức chế quá trình Do IL-12 được hợp thành từ hai tiểu tạo mạch máu: một trong những thay đổi phần mã hóa và hai gen khác nhau, việc căn bản của TB ung thư so với TB thông tạo ra p70 với đầy đủ chức năng sinh lý thường cùng mô, đó là liên tục tham gia phải được tiến hành trên hệ retrovirut cho phân bào, nhu cầu dinh dưỡng cao hơn phép biểu hiện đồng thời cả 2 tiểu phần mức bình thường. Vì thế, chúng tiết ra p40/p35. Các nghiên cứu thường tạo ra các hormon làm tăng quá trình phát triển IL-12 tái tổ hợp từ 2 ORF mã hóa tương của mạch máu tới khối u (angiogensis). ứng cho 2 tiểu phần p40, p35 nối với nhau Cho đến nay, người ta biết rằng IL-12 là bởi một linker peptide, hoặc tạo ra 2 đơn một trong những cytokine ức chế quá vị mARN độc lập nằm xen kẽ một internal trình đó, do đó gián tiếp ức chế phát triển ribosome entry site (IRES). Ở phạm vi khối u [2]. nghiên cứu này, chúng tôi sẽ mô tả chi tiết Gần đây, một khám phá quan trọng việc hình thành chủng retrovirut mã hóa liên quan đến tính chất sinh học của IL-12 IL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/ IL-12-p35. đó là cytokine này có khả năng ức chế quá trình phát triển của khối u trên mô ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG hình động vật thực nghiệm thiếu hụt miễn PHÁP NGHIÊN CỨU dịch (nude mice) [3]. Trên cơ sở các 1. Vật liệu nghiên cứu. nghiên cứu cơ bản, triển khai thử nghiệm Dòng TB đóng gói PT-76, human lâm sàng sử dụng protein tái tổ hợp IL-12. embryonic kiney - HEK 293T do Nolan lab - Tuy nhiên, độc tính của IL-12 rất mạnh, Standford University phát triển và được thậm chí gây chết người [4], điều này làm Clone Tech (USA) cung cấp; bộ khung chậm quá trình triển khai ứng dụng IL-12 retrovirut plasmid pMXs-IP của Trường trong điều trị ung thư. Để khắc phục độc Đại học Toshio Kitamura - Tokyo, phần tính do IL-12 gây nên, một số thử nghiệm mềm Vector NTI và các vật tư sinh học kết hợp IL-12 với các cytokine khác như phân tử khác. IL-2, interferon alpha, B7.1, IL-7, IL-21, IL- 15 [5], đặc biệt là IL-18. Bằng cách này, 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. độc tính của IL-12 giảm xuống mức gần * Hệ retrovirut mã hóa IL-12 cấu hình như không có [6], mang lại triển vọng cho IL-12-p40/linker/IL-12-p35: ứng dụng một trong các interleukine có 71
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Chiến lược thiết kế retrovirut plasmid để đảm bảo protein sẽ được tiết ra môi mang gen ghép IL-12 như sau: đoạn gen trường, ngoài ra phần C terminal sẽ được mã hóa cho các cấu phần p35, p40 của bổ sung đoạn mã hóa cho Tev - cleavage IL-12 được clon xen kẽ với một đoạn site và 6His tag, nhờ đó protein có thể ADN mã hóa cho một linker theo thiết kế được làm tinh sạch bằng kỹ thuật chelating của Mulligan RC [7], chúng tôi bổ sung và proteolytic cleavage sử dụng Tev-cleavage thêm đoạn ADN mã hóa leader peptide proteolytic enzyme. Hình 1: Chiến lược thiết kế retrovirut plasmid mang gen ghép IL-12. * Tối ưu hóa các trình tự codon IL-12: Trình tự polypeptid này được mã hóa Dựa trên trình tự human IL-12 subunit bởi một ORF có kích thước 1.680 bp, có beta (UniProtKB: accession P29460) và vị trí cắt của enzyme EcoRI đầu 5’, trong human IL-12 subunit alpha (UniProtKB: khi đó đầu 3’ của cassette có thể bị cắt accession P29459), kết hợp đoạn signal bởi XhoI. peptid đầu 5’ (MCHQQLVISWFSLVF- * Quy trình tạo chủng retrovirut mã hóa LASPLVA) và đoạn linker kết nối 2 tiểu phần IL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/IL-12-p35: p40/35 (GGGGSGGGGSGGGGSRNLPV), Retrovirut plasmid mang cấu hình IL-12- ngoài ra đầu 3’ của cấu hình IL-12-p40/ p40/linker/IL-12-p35 ®•îc t¨ng sinh b»ng linker/IL-12-p35 được tích hợp đoạn ADN vi khuÈn E. coli - DH5 alpha, thu ho¹ch mã hóa cho Tev-cleavage proteolytic site th«ng qua quy trình maxi-prep để có được (NQNLYFQG) và 6(His) tag 9 (HHHHHH), các lô plasmid với nồng độ ≥ 200 ng/ul, từ đó hình thành nên chuỗi polypeptid OD nằm trong khoảng 1,7 - 2,0. p40-linker-p35-His: 72
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Chuyển retro-plasmid mang cấu hình Hình 1: Kiểm chứng thiết kế retrovirut IL-12-p40/linker/IL-12-p35 vào TB human plasmid mang gen ghép IL-12 được cắt embryonic kidney - HEK 293T bằng quy bằng enzyme giới hạn. trình kết tủa canxi hoặc sử dụng phương Đoạn insert được cắt bởi 2 enzyme pháp cationic - liposome mediated gen XhoI/EcoRI cho kích thước điện di phù transfer. hợp với mong đợi 1.680 bp. 500 ml dịch nổi từ TB 108Retro@ 2. Kiểm chứng sự có mặt của virut linkerIL-12 và TB đối chứng H293T được mã hóa IL-12 trong dịch nổi TB đóng thu nhận riêng rẽ cho mục đích tách ARN gói. tổng số. Lượng ARN này sau đó sẽ được dùng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp cADN. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kiểm chứng thiết kế retrovirut plasmid mang gen ghép IL-12. Thiết kế retrovirut plasmid mang gen ghép IL-12 có đặc điểm là phần 5’ của expression cassette có vị trí cắt của enzyme E coRI, trong khi đó đầu 3’ của cassette có thể bị cắt bởi XhoI và nếu kết hợp cắt bằng cả 2 enzyme XhoI/EcoRI ta sẽ được một insert 1.680 bp. Điều này được kiểm chứng bằng phản Hình 2: Kết quả PCR điện di kiểm chứng ứng cắt enzyme cho kết quả như hình 1. sự có mặt của ORF mã hóa IL-12-p40/linker/ IL-12-p35 từ dịch nổi TB.108Retro @linkerIL-12. Để chắc chắn hơn, chúng tôi tiến hành thu nhận dịch nổi TB 108Retro@linkerIL-12, thực hiện phản ứng phiên mã ngược là khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho IL-12. Giải trình tự đoạn 320 bp nhân lên từ cADN dịch nổi TB 108Retro@linkerIL-12 và thu được một đoạn đọc 189bp có phổ sắc ký như hình 3. Sử dụng trình tự này để blast (blast nucleotide against polypeptide - Translated BLAST), thu được kết quả độ tương đồng 100%. 73
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Hình 3: Kết quả translated BLAST với inquiry là trình tự băng PCR điện di từ c AND dịch nổi TB 108Retro@linkerIL-12. Dòng TB 108Retro@linkerIL-12 do chúng tôi tạo ra thực sự đã bài tiết retrovirut particle mang cấu hình IL-12-p40/linker/IL-12-p35. BÀN LUẬN đổi các đoạn gen lỗi. Một yếu điểm khác Cho đến nay, nhiều hệ biểu hiện gen đã nữa của adenovirut vector đó là nó thường được triển khai để tạo protein IL-12 tái tổ gây các phản ứng miễn dịch rất mạnh, vì thế hợp, nhưng được sử dụng nhiều nhất chính dễ bị thải loại bởi hệ miễn dịch vật chủ. Việc là hệ chuyển gen có nguồn gốc virut bao khó tích hợp ngẫu nhiên các phân tử gồm cả adenovirut và retrovirut. Thông adenovirut vào hệ gen của vật chủ, cũng thường, các plasmid có nguồn gốc đồng nghĩa với việc làm giảm các nguy cơ adenovirut không có khả năng tích hợp vào gây chuyển đoạn nhiễm sắc thể hay các hệ gen của TB vật chủ. Nó chỉ tồn tại tự do biến đổi di truyền học của TB chủ, vì thế TB trong nhân và nồng độ sẽ giảm dần sau mỗi này sẽ ít bị chuyển dạng sang thể TB ác tính chu kỳ phân bào. Hơn nữa, do kích thước khi dung nạp virut. Về lý thuyết, đây cũng là các adenovirut vector thường rất lớn, sẽ khó lý do adenovirut được coi là phương tiện khi tích hợp ngẫu nhiên vào nhiễm sắc thể chuyển gen ít gây ung thư hơn so với của TB chủ. Vì vậy, khó tạo được các dòng retrovirut nếu sử dụng cho liệu pháp gen. TB ổn định cho biểu hiện một protein đích So với adenovirut, khả năng tích hợp thông qua các hệ chuyển gen retrovirut vào hệ gen vật chủ tốt hơn rất adenovirut và khó có thể sử dụng liệu pháp nhiều, làm cho quá trình biểu hiện protein gen cơ bản dựa trên hệ adenovirut cho sửa đích trở nên dễ dàng, mặt khác nó lại có thể 74
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 làm rối loạn khu vực nhiễm sắc thể được tích khu vực nối tiếp hoặc khu vực sợi chromatin hợp. Trong trường hợp retrovirut tích hợp vào dị hợp ngẫu nhiên (facultative heterochromatin). Vì vậy, gen bị bất hoạt các khu vực mã hóa cho gen chÑn ung th• biểu hiện. Chính vì những tính ưu việt đó, hoặc gen ung thư, làm thay đổi tính chất tự chúng tôi đã tiến hành thiết lập hệ retrovirut nhiên của đối tượng này, khơi mào cho sự biểu hiện IL-12 tái tổ hợp này tại Việt Nam. chuyển dạng ác tính của TB vật chủ và vì KẾT LUẬN thế, trên lý thuyết, sẽ gây lo ngại về sự hình Kết quả nghiên cứu chúng tôi đã thiết lập thành công hệ retrovirut biểu hiện IL-12 mức thành các thể bệnh ung thư khi sử dụng độ mARN. retrovirut cho các ứng dụng liệu pháp gen. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tuy nhiên, quan sát thử nghiệm lâm sàng mới nhất vừa được công bố trên tạp chí 1. Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive Science cho thấy không có trường hợp nào immunity. Nat Rev Immunol. 2003, 3 (2), pp.133- được ghi nhận mắc bệnh sau khi sử dụng 146. liệu pháp gen có nguồn retrovirut [8]. Đây 2. Del Vecchio M et al. Interleukin-12: biological properties and clinical application. Clin cũng là báo cáo thống kê đầu tiên ghi nhận Cancer Res. 2007, 13 (16), pp.4677-4685. tính an toàn của retrovirut cho mục đích 3. Eisenring M et al. IL-12 initiates tumor chuyển gen. Trong khi đó, các ứng dụng rejection via lymphoid tissue-inducer cells bearing the natural cytotoxicity receptor NKp46. Nat khác như tạo protein tái tổ hợp ở TB nuôi Immunol. 2010, 11 (11), pp.1030-1038. cấy, retrovirut có ưu thế hơn tất cả các hệ 4. Cohen J. IL-12 deaths: explanation and a biểu hiện gen và chuyển gen mà con người puzzle. Science. 1995, 270 (5238), p.908. ta đã biết trước đây với những lý do sau: 5. Weiss JM et al. Immunotherapy of cancer by IL-12-based cytokine combinations. Expert Opin Thông thường, đoạn gen đích (ví dụ IL-12 Biol Ther. 2007, 7 (11), pp.1705-1721. ORF) sẽ được cài vào giữa 5’ long terminal 6. Rodriguez-Galan MC et al. Coexpression of repeat (LTR) và 3’ long terminal repeat IL-18 strongly attenuates IL-12-induced systemic (LTR) của một retrovirut plasmid, LTR khi đó toxicity through a rapid induction of IL-10 without vừa đóng vai trò là một promoter điều hòa affecting its antitumor capacity. J Immunol. 2009, 183 (1), pp.740-748. biểu hiện của gen đích vừa là một insulator bảo vệ gen đích không bị ảnh hưởng bởi bộ 7. Lieschke GJ et al. Bioactive murine and human interleukin-12 fusion proteins which retain máy phiên mã các gen kề bên. Ngoài ra, quá antitumor activity in vivo. Nat Biotechnol. 1997, 15 trình tích hợp của retrovirut plasmid vào hệ (1), pp.35-40. gen của TB chủ sẽ không còn ngẫu nhiên, 8. Scholler J et al. Decade-long safety and nó diễn ra theo kiểu tái tổ hợp đồng dạng với function of retroviral-modified chimeric antigen đích đến là các đảo retrotransposon của receptor T cells. Sci Transl Med. 2012, 4 (132), nhiễm sắc thể. Bằng cách này loại bỏ được pp.132-153. nguy cơ đoạn gen đích di chuyển đến các 75