Thiết lập các bộ panel mẫu adn để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng pcr đa mồi phát hiện bacillus anthracis

Nội dung text: Thiết lập các bộ panel mẫu adn để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng pcr đa mồi phát hiện bacillus anthracis

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 THI ẾT L ẬP CÁC B Ộ PANEL M ẪU ADN ĐỂ ĐÁNH GIÁ ĐỘ NH ẠY, ĐỘ ĐẶC HI ỆU C ỦA PH ẢN ỨNG PCR ĐA M ỒI PHÁT HI ỆN BACILLUS ANTHRACIS Nguy n Thái S ơn*; Tr n Danh Kh i**; Đinh Th Thu H ng*** TÓM T ẮT Mục tiêu: thi ết l ập các b ộ panel m ẫu ADN để kh ảo sát độ nh ạy và độ đặc hi ệu c ủa ph ản ứng PCR đa m ồi với 3 c ặp m ồi vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1 xác định B. anthracis . Vật li ệu và ph ươ ng pháp: các b ộ panel m ẫu ADN được thi ết l ập theo h ướng d ẫn c ủa WHO và NIBSC (Vi ện Qu ốc gia các m ẫu chu ẩn sinh h ọc, Anh). Các b ộ m ẫu chu ẩn ADN được t ạo ra là panel ng ưỡng phát hi ện, panel độ nh ạy (s ử d ụng plasmid tái t ổ h ợp ch ứa các gen đích đặc tr ưng và gen độc l ực vrrA , pagA , capA ch ủng B. anthracis Ba1) và panel đặc hi ệu (s ử d ụng ADN ch ủng chu ẩn Bacillus cereus Bc1). Kết qu ả và k ết lu ận: ng ưỡng phát hi ện c ủa ph ản ứng là 5 x 10 1 copies/ph ản ứng cùng độ nh ạy, độ đặc hi ệu đạt 100%. Đây là c ơ s ở cho các th ử nghi ệm trên mẫu th ực địa. * Từ khóa: Vi khu ẩn than; B ộ m ẫu chu ẩn; PCR đa m ồi; Độ đặc hiệu; Độ nh ạy. Establishment the In-House DNA Panels for Validation of Multiplex PCR Assay in Detecting Bacillus Anthracis Summary Objectives: To analyze the sensitivity and specificity of multiplex PCR assay that includes three primer pairs vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1 for B. anthracis identification on the in- house DNA panels. Materials and methods: Since there is no international or national reference standard (panels) for calibration of the anthrax PCR kit, in-house reference standards were created according to WHO and NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control) guidelines. The in-house DNA standards consist of sensitivity panel (using recombinant plasmids containing the full-length sequence of target vrrA gene in bacterial chromosome, pagA and capA genes on the virulence plasmid pXO1 and pXO2, respectively) of B. anthracis strain Ba1 and a specificity panel (using DNA genome of Bacillus cereus strain Bc1). Results and conclusion: The detection limit of this multiplex PCR is 50 copies per reaction, the sensitivity and specificity are 100% on the in-house reference panels. This is a basis for validation of mPCR assay on environment and clinical samples. * Key words: Bacillus anthracis; Panel; Multiplex PCR; Specificity; Sensitivity. * Bệnh vi ện Quân y 103 ** Đại h ọc K ỹ thu ật Y t ế H ải D ươ ng *** Học vi ện Quân y Ng i ph n h i (Corresponding): Đinh Th Thu H ng (hangdinhbio@gmail.com) Ngày nh n bài: 07/10/2016; Ngày ph n bi n đánh giá bài báo: 13/12/2016 Ngày bài báo đc đă ng: 26/12/2016 13
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 ĐẶT V ẤN ĐỀ tạo các b ộ panel m ẫu nội b ộ theo h ướng d n c a WHO và NIBSC ánh giá Bacillus anthracis là loài vi khu ẩn sinh ẫ ủ để đ độ nh y, c hi u c a ph n ng mPCR, bào t ử gây b ệnh than được tìm th ấy ở ạ độ đặ ệ ủ ả ứ làm ti n cho nh ng th nghi m lâm nhi ều qu ốc gia trên kh ắp th ế gi ới và là ưu ề đề ữ ử ệ sàng và phát tri n kít mPCR ch n oán tiên l ựa ch ọn làm v ũ khí sinh h ọc c ủa m ột ể ẩ đ vi khu n than Vi t Nam. số t ổ ch ức kh ủng b ố [8]. Trong m ột v ụ t ấn ẩ ở ệ công nghi ng ờ có v ũ khí sinh h ọc hay VẬT LI ỆU VÀ PH ƯƠ NG PHÁP mẫu môi tr ường có nguy c ơ ti ềm ẩn B. NGHIÊN C ỨU anthracis , vi ệc phát hi ện nhanh và chính xác để k ết lu ận có hay không có B. 1. V ật li ệu nghiên c ứu. anthracis rất quan tr ọng. K ỹ thu ật PCR đa * Vector: các plasmid tái t ổ h ợp pJET1.2- mồi (multiplex PCR - mPCR) v ới 3 c ặp pagA, pJET1.2-capA và pJET1.2-vrrA ch ứa mồi là ch ỉ th ị phân t ử loài vrrA (trên toàn b ộ gen pagA (thu ộc plasmid độc l ực chromosome) và s ự có m ặt c ủa các gen pXO1), capA (thu ộc plasmid độc l ực pXO2) độc l ực pagA (trên plasmid pXO1), capA và vrrA (thu ộc chromosome) ch ủng (trên plasmid pXO2) đã được nhóm B. anthacis Ba1 (ch ủng vi khu ẩn than đầy nghiên c ứu thi ết k ế phát hi ện chính xác B. đủ độc l ực) đã được thi ết l ập trong nghiên anthracis gây b ệnh [1]. M ặt khác, để ứng cứu tr ước đây c ủa nhóm tác gi ả [2]. phó hi ệu qu ả v ới m ột cu ộc t ấn công b ằng * Ch ủng vi khu ẩn: ch ủng Bacillus cereus vũ khí sinh h ọc, c ần phát hi ện tác nhân vi Bc1 đặt mua t ừ Hãng Microbiologics (M ỹ) khu ẩn than v ới độ nh ạy, độ đặc hi ệu cao được s ử d ụng để ki ểm tra ph ản ứng chéo trong các m ẫu ph ức t ạp. Nh ư v ậy, để kít với B. anthacis trong ph ản ứng mPCR. PCR đa m ồi được đư a vào s ử d ụng trong ch ẩn đoán lâm sàng, điều ki ện tiên quy ết 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. là ph ải được th ử nghi ệm trên các b ộ m ẫu * Tách chi ết ADN và mPCR: chu ẩn (panel) v ới nh ững tiêu chí quan Ch ủng vi khu ẩn được b ất ho ạt ở điều tr ọng nh ất là độ nh ạy và độ đặc hi ệu [7]. ki ện 121 oC/20 phút, sau đó tách ADN Các b ộ m ẫu chu ẩn qu ốc t ế dùng trong tổng s ố theo quy trình c ủa nhà s ản xu ất ki ểm định sinh ph ẩm ch ẩn đoán phân t ử (QIAamp ADN Mini kit). Ph ản ứng mPCR có th ể tìm trong danh m ục c ủa WHO và với ba c ặp m ồi xác định các gen vrrA, NIBSC (Vi ện Qu ốc gia các m ẫu chu ẩn pagA, capA ch ẩn đoán B. anthracis gây sinh h ọc) [6]. Tuy nhiên, panel m ẫu cho bệnh có thành ph ần nh ư sau: 1,2X các đối t ượng vi sinh v ật hi ện nay v ẫn Dream Taq Buffer; 2,5 U Dream Taq còn h ạn ch ế. B. anthracis là loài vi khu ẩn Polymerases; dNTPs 0,25 mM m ỗi lo ại đặc bi ệt nguy hi ểm, v ẫn ch ưa có panel (Thermo scientific); 0,6 µM m ồi xuôi, m ồi mẫu qu ốc t ế c ũng nh ư qu ốc gia dùng cho ng ược m ỗi lo ại (IDT, M ỹ), 5 µl ADN ki ểm định kít ch ẩn đoán. Do đó, trong khuôn, điều ch ỉnh H 2O đủ th ể tích 25 µl công trình này, nhóm nghiên c ứu đã ch ế (Thermo scientific). 14
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 Chu trình mPCR: bi ến tính 94 oC/5 hay 10 5 x 2 9 copies/ µl m ỗi lo ại, ti ến hành phút, ti ếp theo là 32 chu k ỳ (94 oC/1 phút; pha loãng thành 50 m ức n ồng độ trong o o 56 C/45 giây; 72 C/50 giây), sau đó hoàn nước kh ử ion. C ụ th ể: chu ẩn b ị 10 hàng x thành kéo dài chu ỗi ở 72º trong 10 phút. 5 ống. Hàng đầu tiên gồm 5 ống có n ồng Ph ản ứng được th ực hi ện trên máy PCR độ gi ảm d ần từ 10 5 x 2 9 đến 10 1 x 2 9 hay Eppendorf Mastercycler proS ( Đức). S ản 5.120 copies/ µl. T ừ m ỗi c ột, l ần l ượt pha ph ẩm mPCR được điện di ki ểm tra trên loãng ADN gi ảm d ần gi ữa các hàng theo gel agarose 1,5% TBE 0,5X, nhu ộm hệ s ố 2. Ống th ứ 50 có n ồng độ th ấp nh ất ethidium bromide và ch ụp ảnh d ưới ánh chính b ằng ng ưỡng phát hi ện. Ghi chép sáng t ử ngo ại (UVP Eppendorf). dải n ồng độ cho k ết qu ả t ốt nh ất. ạ ộ ẫ ẩ * T o các b m u chu n: Th ử nghi ệm: Se = [số test (+)/t ổng s ố Lần l ượt t ạo các panel ng ưỡng phát mẫu (+) ] x 100%. hi ện, panel độ nh ạy và panel độ đặc hi ệu * Panel độ đặ c hi ệu: để kh ảo sát ph ản ứng mPCR phát hi ện B. anthracis . Tách và tinh s ạch ADN từ m ẫu đối ch ứng chéo g ần loài (ch ủng chu ẩn B. * Panel ng ưỡng phát hi ện: cereus Bc1), pha loãng thành 50 m ức Hỗn h ợp ADN plasmid tái t ổ h ợp nồng độ t ươ ng t ự panel độ nh ạy. pJET1.2-pagA, pJET1.2-capA và pJET1.2- Th nghi m: Sp = [s test (-)/t ng s vrrA được t ạo ra v ới nồng độ gốc 170, ử ệ ố ổ ố 140 và 120 ng/µl m ỗi lo ại (h ỗn h ợp ADN mẫu (-)] x 100%. plasmid t ạo ra ch ứa t ươ ng đươ ng kho ảng Tất c ả các th ử nghi ệm trên panel ng ưỡng 10 10 copies/ µl m ỗi lo ại plasmid [10]) pha phát hi ện, panel độ nh ạy và panel độ đặc loãng d ần t ừ n ồng độ ban đầu theo h ệ s ố hi ệu đều được th ực hi ện l ặp l ại 5 l ần v ới 10 trong n ước kh ử ion để t ạo n ồng độ cùng điều ki ện để ki ểm tra độ l ặp. gi ảm d ần). Th ực hi ện mPCR tìm n ồng độ ADN th ấp nh ất mà ph ản ứng còn cho k ết KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU qu ả d ươ ng tính rõ, xác định giá tr ị ng ưỡng. 1. Gi ới h ạn phát hi ện c ủa mPCR. Ki ểm tra trên và d ưới ng ưỡng m ột b ậc Ph ản ứng mPCR cho s ản ph ẩm là pha loãng ( đến giá tr ị này, ti ến hành pha 3 band đặc tr ưng có kích th ước l ần lượt loãng theo h ệ s ố th ấp h ơn để xác định là 222, 751 và 610 bp v ới m ẫu B. anthracis chính xác ng ưỡng phát hi ện). Xác định l ại có đầy đủ độc l ực. Để đánh giá ph ản ứng 5 l ần v ới giá tr ị ng ưỡng . Từ n ồng độ ng ưỡng mPCR này, chúng tôi l ần l ượt kh ảo sát thích h ợp t ạo nhi ều ống nh ỏ l ưu tr ữ l ạnh, trên các b ộ m ẫu chu ẩn, bao g ồm panel dán nhãn. ng ưỡng phát hi ện, panel độ nh ạy và panel * Panel độ nh ạy: độ đặc hi ệu. Gi ới h ạn phát hi ện c ủa mPCR Từ hỗn h ợp ADN plasmid tái t ổ h ợp trên panel ng ưỡng phát hi ện là giá tr ị pJET1.2-pagA, pJET1.2-capA và pJET1.2-vrrA cần xác định đầu tiên tr ước khi t ạo panel với nồng độ ban đầu kho ảng 512 x 10 5 độ nh ạy. 15
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 Hình 1: Kh ảo sát ph ản ứng mPCR ch ẩn đoán B. anthracis trên panel ng ưỡng phát hi ện. (M: thang ADN chu ẩn 100 bp [Thermo Scientific]; 1 - 8: các m ẫu ADN trong b ộ panel tươ ng ứng t ừ n ồng độ 5 x 10 6 đến 5 x 10 -1copies/ph ản ứng; 9: đối ch ứng âm; 10: Blank) Nồng độ ADN c ủa h ỗn h ợp plasmid tái t ổ h ợp pJET1.2-pagA, pJET1.2-capA và pJET1.2-vrrA được pha loãng gi ảm d ần th ể hi ện t ừ đường ch ạy s ố 1 - 8 trên b ản gel điện di. Đường ch ạy s ố 1 t ươ ng ứng v ới n ồng độ ADN là 5 x 10 6 copies/ph ản ứng (s ử dụng 5 µl h ỗn h ợp 10 6 copies/ µl trong ph ản ứng mPCR) v ới 3 band rõ nét đặc tr ưng của B. anthracis . T ại các n ồng độ pha loãng gi ảm d ần t ừ đường ch ạy s ố 1 - 7, độ nét của band c ũng gi ảm tuy ến tính. Trên đường ch ạy s ố 7, t ươ ng ứng v ới n ồng độ 5 x 10 0 copies/ph ản ứng, k ết qu ả r ất khó xác định. Ti ếp theo, không còn xu ất hi ện b ất k ỳ band sản ph ẩm nào ở n ồng độ th ấp h ơn ( đường ch ạy s ố 8). Nh ư v ậy, ng ưỡng phát hi ện c ủa mPCR được xác định là 5 x 10 1 copies/ph ản ứng. Đây là n ồng độ ADN th ấp nh ất cho kết qu ả mPCR d ươ ng tính rõ và ổn định ở t ất c ả nh ững l ần ki ểm tra l ặp l ại. 2. Độ nh ạy, độ đặc hi ệu c ủa ph ản ứng mPCR. Hình 2: Kh ảo sát ph ản ứng mPCR ch ẩn đoán B. anthracis trên panel độ nh ạy. (M: thang ADN chu ẩn 100 bp [Thermo Scientific]; 1 - 10: m ẫu ADN trong b ộ panel tươ ng ứng các n ồng độ 5 x 10 2 x 2 9 [2,56 x 10 5] đến 5 x 10 2 x 2 0 [5 x 10 2] copies/ph ản ứng) 16
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 Panel độ nh ạy được kh ảo sát cho k ết qu ả d ươ ng tính v ới 3 band đặc tr ưng c ủa B. anthracis trên toàn b ộ 50 m ẫu. Ngoài ra, khi kh ảo sát trên panel độ nh ạy, n ồng độ ADN được pha loãng v ới h ệ s ố th ấp h ơn (h ệ s ố 2) t ừ n ồng độ ban đầu, nên độ bi ến thiên nồng độ di ễn ra t ừ t ừ (trên đường ch ạy s ố 1 - 10) và có th ể xác định được giá tr ị n ồng độ ADN cho k ết qu ả ph ản ứng t ốt nh ất là 5 x 10 2 x 2 7 hay 10 3 copies/ph ản ứng ( đường ch ạy s ố 3). Độ nh ạy c ủa mPCR được đánh giá trên panel 100%. Hình 3: Kh ảo sát ph ản ứng mPCR ch ẩn đoán B. anthracis trên panel độ đặc hi ệu. (M: thang ADN chu ẩn 50 bp [Thermo Scientific]; 1 - 10: các m ẫu ADN panel đặc hi ệu) Đánh giá độ đặc hi ệu c ủa mPCR ch ẩn đoán B. anthracis bằng ki ểm tra ph ản ứng chéo v ới các loài có quan h ệ g ần g ũi, loài g ần nh ất v ới B. anthracis được l ựa ch ọn là vi khu ẩn B. cereus . K ết qu ả, 100% m ẫu không xu ất hi ện các gen độc l ực (thu ộc plasmid pXO1, pXO2 đặc tr ưng c ủa B. anthracis gây b ệnh), nh ưng d ươ ng tính v ới gen vrrA chung cho chi Bacillus . BÀN LU ẬN với s ố l ượng đủ l ớn, b ảo qu ản đúng quy định [6]. M ặt khác, v ới vi khu ẩn than gây Trong nghiên c ứu này, gi ới h ạn phát bệnh, c ần có m ặt đầy đủ hai plasmid độc hi ện, độ nh ạy và độ đặc hi ệu c ủa ph ản lực pXO1 và pXO2. Để xác định chính ứng mPCR xác định vi khu ẩn than được xác vi khu ẩn than gây b ệnh c ũng nh ư kh ảo sát trên các b ộ panel m ẫu n ội b ộ. phân bi ệt v ới ch ủng không độc, trong Vi ệc kh ảo sát trên b ộ panel m ẫu là điều nghiên c ứu tr ước, chúng tôi đã s ử d ụng ki ện tiên quy ết cho b ất k ỳ b ộ kít ch ẩn ph ản ứng mPCR v ới 3 c ặp m ồi đặc hi ệu đoán nào tr ước khi đư a ra th ử nghi ệm với gen đích là vrrA , pagA và capA . Ch ỉ th ực địa. Các b ộ m ẫu chu ẩn qu ốc t ế ho ặc nh ững m ẫu d ươ ng tính v ới c ả 3 gen này qu ốc gia được s ử d ụng để ki ểm định kít mới được xác định là B. anthracis gây ch ẩn đoán lý t ưởng nh ất. Tuy nhiên, khi bệnh [1]. Do đó, bộ panel ADN m ẫu cần không có các lo ại trên, vi ệc thi ết l ập b ộ ph ải ch ứa đầy đủ các gen đích trên. mẫu chu ẩn n ội b ộ là c ần thi ết [4]. Các b ộ mẫu chu ẩn ph ải được thi ết l ập theo Để t ạo panel ng ưỡng phát hi ện và nguyên t ắc t ạo panel c ủa WHO và NIBSC panel độ nh ạy, tách chi ết ADN t ổng s ố 17
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 của vi khu ẩn B. anthracis t ừ ch ủng thu ần kh ẳng đị nh là vi khu ẩn than gây b ệnh có th ể s ử d ụng. Tuy nhiên, trong nghiên (Anthrax). Để kh ẳng đị nh vi khu ẩn than cứu này, chúng tôi s ử d ụng plasmid tái t ổ gây b ệnh c ần có m ặt đủ c ả 3 gen là vrrA hợp ch ứa gen đích ch ẩn đoán để t ạo trên chromosome và pagA, capA trên panel (trên c ơ s ở đã có s ẵn các plasmid plasmid pXO1, pXO2. Kết qu ả này c ũng ch ứa toàn b ộ trình t ự gen đích là pagA, minh ch ứng cho yêu c ầu ph ải ki ểm đị nh capA và vrrA ) [2]. Theo cách này, panel trên panel m ẫu v ới t ất c ả kít th ươ ng m ại có độ đồng nh ất cao và có th ể pha loãng tr ước khi đưa ra th ị tr ường. thành n ồng độ chính xác, c ũng là h ướng Nh ư v ậy, v ới các b ộ panel m ẫu được khuy ến cáo c ủa WHO. Chia nh ỏ được thi ết l ập nh ư trên để đánh giá ph ản mẫu ADN plasmid thành nhi ều ống, m ỗi ứng mPCR ch ẩn đoán vi khu ẩn than đã ống ch ứa ADN đủ dùng cho 10 ph ản ứng, đạt được yêu c ầu theo nguyên t ắc t ạo o bảo qu ản -20 C, m ỗi l ần dùng 1 ống, panel. Các b ộ panel m ẫu này là công c ụ tránh hi ện t ượng rã đông nhi ều l ần làm hi ệu qu ả để ki ểm đị nh tiêu chu ẩn c ủa m ột sai l ệch k ết qu ả. Giá tr ị ng ưỡng phát hi ện bộ kít PCR ch ẩn đoán vi khu ẩn than trên là 5 x 10 1 copies/ph ản ứng, t ươ ng đươ ng cơ s ở xác đị nh các gen đích vrrA , pagA với k ết qu ả c ủa m ột s ố công b ố tr ước đây và capA . [3, 9], độ nh ạy 100%, đạt tiêu chu ẩn c ơ KẾT LU ẬN sở c ủa b ộ kít. ã thi t l p c các b panel ADN Với panel độ đặc hi ệu, m ẫu ch ứng âm Đ ế ậ đượ ộ để đánh giá ph ản ứng mPCR ch ẩn đoán được t ạo t ừ các ch ủng có v ật ch ất di vi khu ẩn than d ựa trên phát hi ện s ự có truy ền g ần nh ất đối v ới ch ủng nghiên c ứu mặt các gen đích vrrA , pagA và capA. để đánh giá kh ả n ăng ph ản ứng chéo. Ph ản ứng mPCR thi ết k ế đạt độ nh ạy và Kết qu ả cho th ấy, n ếu ch ỉ s ử d ụng m ột độ đặc hi ệu v ới gen độc l ực pagA , capA gen trên chromsome ( vrrA hay Ba831 ) là 100%, v ới ng ưỡng phát hi ện 5 x 10 1 nh ư m ột s ố tác gi ả tr ước đã công b ố, có copies/ph ản ứng. Ch ỉ nh ững m ẫu có k ết th ể ch ẩn đoán nh ầm gi ữa B. anthracis và qu ả d ươ ng tính đồng th ời v ới c ả ba gen B. cereus [5]. M t khác, n u ch d a vào ặ ế ỉ ự đích trên khi th ực hi ện mPCR m ới được m t gen c hi u trên plasmid, nguy c ộ đặ ệ ơ kh ẳng định là B. anthracis gây b ệnh. dẫn đến âm tính gi ả v ới ch ủng m ất m ột Li c m ơn: Công trình này được trong các plasmid độc. hoàn thành nh ờ s ự tài tr ợ kinh phí c ủa Tr ở l ại v ới k ết qu ả 100% m ẫu cho Ch ươ ng trình Công ngh ệ Sinh h ọc ph ục dươ ng tính khi kh ảo sát b ằng c ặp m ồi vụ an ninh, qu ốc phòng do B ộ Qu ốc phòng vrrA, chúng tôi nh ận th ấy, khi k ết qu ả ch ỉ ch ủ qu ản thông qua nhi ệm v ụ “Nghiên c ứu cho d ươ ng tính v ới gen vrrA mà không ch ế t ạo kít PCR đa m ồi xác định nhanh th ấy 2 gen độ c l ực xu ất hi ện trên plasmid, đồng th ời hai tác nhân vi khu ẩn than và ch ỉ có th ể xác đị nh đó là loài thu ộc chi dịch h ạch”. Mã s ố: 2013.75.58, H ọc vi ện Bacillus, nhóm “B. cereus”, không th ể Quân y ch ủ trì. 18
7. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 TÀI LI ỆU THAM KH ẢO sequence of Bacillus anthracis . J Clin Microbiol. 2004, 42 (12), pp.5825-5831. 1. Nguy ễn V ăn An, Nguy ễn Thái S ơn, Đinh 6. Bunk DM . Reference materials and Th ị Thu H ằng . Thi ết k ế và t ối ưu hóa ph ản ứng multiplex PCR ch ẩn đoán đồng th ời vi reference measurement procedures: an khu ẩn than và vi khu ẩn d ịch h ạch. T ạp chí Y - overview from a national metrology institute. Dược h ọc Quân s ự. 2015, 40 (4), tr 67-73. Clin Biochem Rev. 2007, 28 (4), pp.131-137. 2. Đinh Th ị Thu H ằng, Nguy ễn Thái S ơn, 7. Burd EM . Validation of laboratory- Nghiêm Ng ọc Minh và CS. Trì nh t ự một s ố developed molecular assays for infectious gen tiêu bi ểu củ a vi khu ẩn Bacillus anthracis diseases. Clin Microbiol Rev. 2010, 23 (3), phân l ập ở Vi ệt Nam. T ạp chí Công ngh ệ Sinh pp.550-576. h c. 2015, 13 (4), tr.1177-1184. ọ 8. Girault G, Blouin Y, Vergnaud G et al. 3. Batra SA, Krupanidhi S, Tuteja U . A High-throughput sequencing of Bacillus anthracis sensitive & specific multiplex PCR assay for in France: investigating genome diversity and simultaneous detection of Bacillus anthracis, population structure using whole-genome Yersinia pestis, Burkholderia pseudomallei & SNP discovery. BMC Genomics. 2014, 15, Brucella species . Indian J Med Res. 2013, pp.288-288. 138, pp.111-116. 9. Heinz Ellerbrok, Herbert Nattermann, 4. Belak S, Thoren P . Molecular diagnosis of animal diseases: some experiences over Muhsin Ozel et al. Rapid and sensitive the past decade. Expert Rev Mol Diagn. 2001, identi¢cation of pathogenic and apathogenic 1 (4), pp.434-443. Bacillus anthracis by real-time PCR. FEMS Microbiology Letters. 2002, 214, pp.51-59. 5. Bode E, Hurtle W, Norwood D . Real- time PCR assay for a unique chromosomal 10. 19