Thẩm định phương pháp định lượng amphotericin B trong thuốc tiêm đông hô liposome amphotericin B bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Thẩm định phương pháp định lượng amphotericin B trong thuốc tiêm đông hô liposome amphotericin B bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AMPHOTERICIN B TRONG THUỐC TIÊM ĐÔNG HÔ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Thái Sơn**; Phạm Thị Minh Huệ*** TÓM TẮT Mục tiêu: thẩm định phương pháp định lượng amphotericin B (AmB) trong thuốc tiêm đông khô liposome amphotericin B bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm. Đối tượng và phương pháp: thuốc tiêm đông khô liposome AmB được bào chế tại Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội. Tiến hành phân tích AmB bằng phương pháp HPLC với cột: Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), detector PDA, bước sóng 407 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, pha động: acetonitrile - natri acetat 10 mM pH 4,0 (theo gradient thể tích). Kết quả: phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng, độ chính xác và có khoảng xác định từ 15 - 25 µg/ml. Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng AmB trong thuốc tiêm đông khô liposome AmB là 50,07 ± 0,51 mg/lọ (100,15 ± 1,02% so với hàm lượng ghi trên nhãn). Kết luận: phương pháp định lượng đảm bảo các yêu cầu và có thể sử dụng để định lượng AmB trong thuốc tiêm đông khô liposome AmB. * Từ khóa: Amphotericin B; Liposome; Thuốc tiêm đông khô; Sắc ký lỏng hiệu năng cao. Validation of an Analytical Assay Method for Amphotericin B in Amphotericin B Liposomal Lyophilized Powder for Injection by High Performance Liquid Chromatography Summary Objectives: To validate the analytical assay method for amphotericin B in amphotericin B liposomal lyophilized powder for injection by high performance liquid chromatography (HPLC) aiming to standardize the quality of the products. Participants and methodology: Amphotericin B liposomal lyophilized powder for injection produced by Department of Pharmaceutics, Hanoi University of Pharmacy is analyzed using the HPLC system with the column Phenomenex C18 (250 x 4.6 mm, 5 µm), detector PDA, the wave length of 407 nm, the water flow speed of 1.0 ml/min, injection volume of 10 µl, a mixture of acetonitrile - natri actetate 10 mM pH 4.0 (gradient volume) as mobile phase. Results: The method ensures the specificity, compatibility, linearity, propriety, accuracy and is approximately determined from 15 µg/ml to 25 µg/ml. As a result, the amount of amphotericin B measured in amphotericin B liposomal lyophilized powder for injection is 50.07 ± 0.51 (mg/vial) * Học viện Quân y ** Bệnh viện Quân y 103 *** Đại học Dược Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (dsquang2000@yahoo.com) Ngày nhận bài: 24/01/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/02/2016 Ngày bài báo được đăng: 01/03/2016 13
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 (100.15 ± 1.02% of the amount written on the label). Conclusion: The method meets all the requirements and can be used to measure the amount of amphotericin B in amphotericin B liposomal lyophilized powder for injection. * Key words: Amphotericin B; Liposome; Lyophilized powder for injection; High performance liquid chromatography. ĐẶT VẤN ĐỀ NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG Amphotericin B là một kháng sinh chống PHÁP NGHIÊN CỨU nấm, phổ rộng, đã được sử dụng từ rất 1. Nguyên liệu và thiết bị. lâu chủ yếu dưới dạng tiêm tĩnh mạch - Thuốc tiêm đông khô liposome AmB trong trường hợp nhi m nấm hệ thống. được bào chế tại Bộ môn Bào chế, Trường Tuy nhiên, hạn chế của dược chất này là Đại học Dược Hà Nội, số lô NC 0315, hạn không tan trong nước, nên sinh khả dụng sử dụng 03 - 2017. không cao và gây nhiều tác dụng phụ, - Hóa chất: acetonitril, methanol, axít đặc biệt gây độc cho thận [1, 3]. Việc acetic, natri acetat trihydrat, nước cất pha nghiên cứu đưa hoạt chất AmB vào hệ mang thuốc liposome để cải thiện sinh tiêm đạt tiêu chuẩn cho HPLC; chất chuẩn khả dụng và làm giảm độc tính trên thận AmB (Dr. Ehrenstorfer, Đức, 95%); các hóa của AmB là vấn đề có ý nghĩa khoa học chất dung môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết và thực ti n cao. Thuốc tiêm đông khô phân tích. liposome AmB đã được bào chế thành - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao công ở quy mô 30 lọ/mẻ với các chỉ tiêu Water e2695 (Mỹ) gồm hệ bơm 4 kênh vật lý đạt yêu cầu của hệ mang thuốc nano. dung môi, autosampler, detector PDA, cột Việc nghiên cứu định lượng AmB trong phenomenex C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). thuốc tiêm đông khô liposome AmB là rất - Dụng cụ: cân phân tích Mettler toledo quan trọng, góp phần xây dựng công thức (độ chính xác 0,1 mg) và các dụng cụ bào chế, cũng như tiêu chuẩn hóa chất phân tích khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm. lượng sản phẩm. Để định lượng AmB, có thể sử dụng phương pháp quang phổ hấp 2. Phƣơ g pháp ghi cứu. phụ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) hay xác - Điều kiện sắc ký: định hoạt lực thuốc kháng sinh bằng phương + Cột: Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; pháp thử vi sinh vật [2]. Tuy nhiên, các 5 µm). phương pháp này hoặc có độ chính xác + Detector UV tại bước sóng: 407 nm. không cao hoặc yêu cầu điều kiện thí + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. nghiệm rất nghiêm ngặt. Vì vậy, trong bài báo này chúng tôi: Thông báo kết quả + Thể tích tiêm: 10 µl. thẩm định phương pháp định lượng AmB + Pha động: acetonitrile - natri acetat trong thuốc tiêm đông khô liposome AmB 10 mM pH 4,0 (theo gradient thể tích) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. [4, 5]. 14
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Thời gian Tốc độ % đệm % Tính hàm lượng (%) AmB trong chế phẩm (phút) dòng natri acetonitril theo công thức: (ml/phút) acetat St * ft * mc * HLc 0,01 1,00 70,0 30,0 H (%) = x 100% Sc * fc * Mn 4,00 1,00 40,0 60,0 Trong đó: 8,00 1,00 20,0 80,0 H (%): hàm lượng % AmB trong chế 9,00 1,00 60,0 40,0 phẩm. * Dung dịch natri acetat 10 mM pH 4,0: St, Sc: diện tích píc của mẫu thử và mẫu chuẩn. cân chính xác 0,2014 g natri acetat trihydrat và 0,5111 g axít acetic bằng hòa tan trong ft, fc: hệ số pha loãng của mẫu thử, 1.000 ml nước cất. Điều chỉnh dung dịch về mẫu chuẩn. pH 4 (nếu cần), lọc qua màng lọc 0,45 µm. mc: khối lượng chất chuẩn (mg). - Phương pháp xử lý mẫu: HLc: hàm lượng tinh khiết của chất chuẩn (%). + Mẫu chuẩn: cân chính xác 10,0 mg AmB chuẩn hòa tan trong bình định mức Mn: hàm lượng hoạt chất ghi trên nhãn (mg). 100 ml bằng methanol. Hút chính xác 2 ml dung dịch trên cho vào bình định mức - Thẩm định phương pháp: với các tiêu 10 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch, chí về tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. thống, tuyến tính, độ đúng, độ chính xác và khoảng xác định [4]. + Mẫu thử: lấy 1 lọ chế phẩm thêm 10 ml nước cất vô khuẩn để pha tiêm, lắc KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN đều để thu được hỗn dịch liposome. Chuyển . Tí h đặc hiệu. sang bình định mức 250 ml, thêm 50 ml Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử hỗn hợp dung môi methanol-cloroform và mẫu trắng. Sắc ký đồ của các mẫu (3/1, tt/tt), tiếp tục pha loãng đến vạch, lắc trên được thể hiện ở hình 1, hình 2 và đều. Hút chính xác 1 ml dung dịch trên cho hình 3. Kết quả trên sắc ký đồ (SKĐ) cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol thấy: mẫu thử cho píc của AmB có thời vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng gian lưu tương ứng với thời gian lưu của lọc 0,45 µm. píc AmB trong mẫu chuẩn. Píc của AmB + Mẫu trắng (placebo): lấy 1 lọ placebo trong mẫu thử cân đối, tách hoàn toàn thêm 10 ml nước cất vô khuẩn để pha tiêm, khỏi píc tạp. Hệ số chồng phổ UV của píc lắc đều. Chuyển sang bình định mức 250 ml, AmB thu được trong SKĐ của dung dịch thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanol- thử và phổ UV của píc tương ứng trong cloroform (3/1, tt/tt), tiếp tục pha loãng SKĐ của dung dịch chuẩn xấp xỉ bằng 1 đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 1 ml dung (hệ số chồng phổ = 0,9999). Đồng thời, dịch trên cho vào bình định mức 10 ml, mẫu trắng không thấy xuất hiện píc có thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu Lọc qua màng lọc 0,45 µm. của AmB trong mẫu chuẩn và mẫu thử. 15
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Diện tích píc (mAU.s) Thời gian Hình 1: SKĐ của mẫu trắng. (phút) Diện tích píc (mAU.s) Thời gian Hình 2: (phút) SKĐ của mẫu chuẩn AmB. Diện tích píc (mAU.s) Thời gian (phút) Thời gian Hình 3: SKĐ của AmB trong mẫu thử. (phút) 16
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 2. Tính thích hợp. Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch AmB chuẩn có nồng độ khoảng 25 µg/ml vào hệ thống sắc ký. Bảng 1: Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký. Stt Thời gia ƣu của píc (s) Diện tích píc (mAU.s) Hệ số đối xứng Số đĩa ý thu ết 1. 5,606 1309969 1,18 45987 2. 5,588 1309678 1,21 44845 3. 5,594 1309601 1,18 42653 4. 5,582 1296938 1,19 44628 5. 5,589 1299925 1,21 43620 6. 5,591 1301446 1,20 43413 Trung bình 5,592 1304593 1,20 44191 RSD % 0,14 0,45 Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích píc của các mẫu chuẩn AmB lần lượt là 0,14% và 0,45%. Hệ số đối xứng của píc AmB là 1,20 (đạt yêu cầu < 2), số đĩa lý thuyết là 44141 (đạt yêu cầu không dưới 1000). Như vậy, phương pháp phân tích hoàn toàn phù hợp với hệ thống sắc ký. 3. Tính tuyến tính. Pha 1 dãy các dung dịch AmB chuẩn trong pha động có nồng độ từ 10 - 40 µg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch theo điều kiện sắc ký đã nêu. Bảng 2: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của phương pháp định lượng AmB. Stt Nồ g độ AmB (µg/ml) Diện tích píc (mAU.s) 1 10 535148 2 15 793702 3 20 1055328 4 25 1309969 5 30 1583122 6 35 1863179 7 40 2104649 Phương trình hồi quy: y = 52680x + 3719. Hệ số tương quan (r): 0,999 Hệ số góc: 52680 Hệ số chắn: 3719 %Y: 0,352 17
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Diện tích píc (mAU.s) Nồng độ AmB (µg/ml) Hình 4: Đồ thị biểu di n tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc AmB. Trong khoảng nồng độ khảo sát, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ AmB và diện tích píc với hệ số tương quan r ≈ 1. Tỷ lệ (%) hệ số chắn Y tại nồng độ 20 µg/ml là 0,352% (đạt yêu cầu < 2%). 4. Độ đú g. Tiến hành bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu trắng để thu được các dung dịch mẫu tự tạo có lượng AmB chuẩn tương ứng 75%, 100% và 125% hàm lượng ghi trên nhãn (37,5 mg; 50 mg và 62,5 mg). Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu tự tạo (tại mỗi mức nồng độ, thực hiện 3 mẫu độc lập) và mẫu chuẩn có nồng độ tương ứng, mỗi mẫu tiêm 01 lần. Ghi lại sắc ký đồ, đáp ứng của píc và xác định tỷ lệ (%) AmB thu hồi. Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng AmB. Tỷ lệ so với Tỷ lệ Mẫu trắng Lƣợng chuẩn AmB Diện tích píc Lƣợng AmB Stt đị h ƣợng thu hồi (lọ) thêm vào (mg) (mAU.s) tìm lại (mg) (%) (%) 1 75 1 36,20 676541 36,53 100,94 2 75 1 36,20 679798 36,71 101,42 3 75 1 36,20 678665 36,65 101,26 Diện tích píc chuẩn (mAU.s): 676848 TB: 101,21 RSD (%): 0,24 4 100 1 48,26 911535 48,25 99,97 5 100 1 48,26 924120 48,91 101,35 6 100 1 48,26 922721 48,84 101,20 18
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Diện tích píc chuẩn (mAU.s): 920755 TB: 100,84 RSD (%): 0,75 7 125 1 60,33 1184609 60,15 99,72 8 125 1 60,33 1201927 61,03 101,17 9. 125 1 60,33 1195221 60,69 100,61 Diện tích píc chuẩn (mAU.s): 1199666 TB: 100,50 RSD (%): 0,73 X (%) (n = 9): 100,85 RSD (%) (n = 9): 0,62 Phương pháp có độ thu hồi AmB ở mỗi mức nồng độ đều nằm trong giới hạn cho phép là 98 - 102%, với RSD của 9 kết quả là 0,62% (nằm trong giới hạn < 2%). Do đó, phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng. 5. Độ chính xác. * Độ lặp lại: Độ lặp lại của phương pháp định lượng được xác định khi định lượng 6 lần của một mẫu thử ở điều kiện sắc ký đã nêu với diện tích píc của mẫu chuẩn là 1055328. Bảng 4: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng AmB (n = 6). Lọ Diện tích píc (mAU.s) Kết quả đị h ƣợng (%) 1 1063779 100,55 2 1078622 101,95 3 1060442 100,23 4 1050567 99,30 5 1051289 99,37 6 1052519 99,48 X 100,15 RSD % 1,02 Phương pháp có độ lặp lại cao với giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,02% (đạt yêu cầu < 2%). * Độ chính xác trung gian: Độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng được xác định như độ lặp lại, nhưng được tiến hành khác ngày và không cùng kiểm nghiệm viên. 19
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Bảng 5: Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng AmB. Kiểm nghiệm viên 1 Kiểm nghiệm viên 2 Diện tích píc chuẩn: 1055328 Diện tích píc chuẩn: 1005747 Stt Diện tích píc Kết quả định lượng Diện tích píc Kết quả định lượng (mAU.s) (%) (mAU.s) (%) 1 1063779 100,55 1049223 100,10 2 1078622 101,95 1050606 100,23 3 1060442 100,23 1051256 100,29 4 1050567 99,30 1040455 99,26 5 1051289 99,37 1060356 101,16 6 1052519 99,48 1054064 100,56 Trung bình 100,15 100,27 RSD % 1,02 0,62 Kết quả (%) định lượng trung bình (n = 12): 100,21 RSD (%) (n = 12): 0,80 6. Khoả g xác định. phân tích, khoảng xác định từ 15 - 25 µg/ml. Trong phần xác định độ đúng, độ tuyến Hàm lượng AmB trong thuốc tiêm đông tính ở các mức nồng độ 75%, 100% và 125% khô liposome AmB là 50,07 ± 0,51 (mg/lọ) so với hàm lượng AmB ghi trên nhãn đảm (đạt 100,15 ± 1,02% so với hàm lượng bảo độ đúng, độ lặp lại và độ tuyến tính. ghi trên nhãn). Vì vậy, khoảng xác định của phương pháp định lượng từ 15 - 25 µg/ml. TÀI LIỆU THAM KHẢO 7. Kết quả đị h ƣợng AmB trong 1. Bộ môn Hóa dược, Trường Đại học Dược thuốc ti m đô g hô liposome-AmB. Hà Nội. Hóa dược - tập 2. NXB Y học. 2007, tr.195-196. Từ phương pháp đã thẩm định, tiến hành xác định hàm lượng AmB trong 2. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam IV. NXB Y học. 2009, tr.91-92. thuốc tiêm đông khô liposome AmB. Kết quả cho thấy: hàm lượng AmB trong 3. Bộ Y tế. Dược thư Quốc gia Việt Nam. thuốc tiêm đông khô liposome AmB là NXB Y học. 2002, tr.146-148. 50,07 ± 0,51 (mg/lọ) (n = 6). 4. Nguyễn Minh Đức. Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và KẾT LUẬN hợp chất tự nhiên. NXB Y học Thành phố Đã thẩm định được phương pháp định Hồ Chí Minh. 2006, tr.138,148-149. lượng AmB trong thuốc tiêm đông khô 5. Italia JL et al. High-performance liquid liposome AmB bằng HPLC. Phương pháp chromatographic analysis of amphotericin B in có tính đặc hiệu và tính thích hợp cao với rat plasma using α-naphthol as an internal hệ thống sắc ký, đảm bảo tính tuyến tính, standard. Analytica Chimica Acta. 2009, 634 (1), độ đúng và độ chính xác theo yêu cầu pp.110-114. 20