Tăng sinh tế bào gốc trong gan trên chuột fischer dưới tác dụng của acetylaminofluorene kết hợp với phẫu thuật cắt 2/3 gan

Nội dung text: Tăng sinh tế bào gốc trong gan trên chuột fischer dưới tác dụng của acetylaminofluorene kết hợp với phẫu thuật cắt 2/3 gan

1. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC TRONG GAN TRÊN CHUỘT FISCHER DƯỚI TÁC DỤNG CỦA ACETYLAMINOFLUORENE KẾT HỢP VỚI PHẪU THUẬT CẮT 2/3 GAN Phạm Văn Trân* TÓM TẮT Nghiên cứu ức chế sự tăng sinh của tế bào gan bằng cách nuôi chuột với chế độ ăn có chứa 2- acetylaminofluorene (AAF) đồng thời tiến hành phẫu thuật cắt 2/3 gan nhằm kích thích sự tăng sinh của tế bào gốc (TBG) (mô hình AAF/PT) nhằm xây dựng mô hình làm tăng sinh TBG trên chuột cống Fisher F344. Kết quả: TBG tăng sinh mạnh và đạt cực đại vào ngày thứ 9 - 14 sau phẫu thuật. Tiếp tục cho chuột ăn doxycycline làm tăng số lượng TBG bằng cách ngăn cản TBG biệt hóa. Nghiên cứu cho thấy TBG tăng sinh mạnh trên chuột cống Fisher F344 bằng chế độ ăn có chứa AAF kết hợp với phẫu thuật cắt 2/3 gan, đồng thời có thể ngăn cản sự biệt hóa TBG trong gan bằng doxycyclin. * Từ khóa: Gan; Tế bào gốc; 2-acetylaminofluorene; Phẫu thuật cắt gan. Proliferation of hepatic oval cells in rats due to the effect of acetylaminofluorene combined with 2/3 partial hepatectomy SUMMARY Study was carried out to perfect the model of hepatic oval cell proliferation in rats. Regeneration was induced by treating rats with 2-acetylaminofluorene followed by partial hepatectomy. Results: Oval cell proliferated and number reached with a peak at day 9 - 14 after 2/3 partial hepatectomy. Administration of doxycycline, a MMP inhibitor, increased oval cell accumulation, an effect that might be explained by an inhibition of their differentiation into hepatocytes. These data suggested that (a) hepatic regeneration from oval cells can be perfected with 2-acetylaminofluorene followed by partial hepatectomy, (b) doxycycline inhibit oval cell differentiation. * Key words: Liver; Stem cells; 2-acetylaminofluorene; Hepatectomy. ĐẶT VẤN ĐỀ “ổ TBG - stem cell niche”). Ổ TBG nằm rải rác ở khắp các mô và cơ quan trong cơ thể. Tế bào gốc là tế bào có khả năng biệt Từ đây, các tế bào đều đặn (hoặc tăng tốc hoá thành nhiều loại tế bào khác để thay độ khi có nhu cầu như sau nhiễm trùng hay thế cho các tế bào bị mất đi do già và chết chấn thương) tăng sinh và biệt hoá, cung tự nhiên hay do chấn thương vì nhiều nguyên cấp nguồn tế bào mới để tái tạo mô và giữ cho nhân khác nhau. Trong cơ thể, TBG được cất giữ tại những vị trí đặc biệt, được gọi là * Bệnh viện 103 Người phản hồi (Corresponding): Phạm Văn Trân phamvantran@yahoo.fr
2. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 cơ thể luôn ở trạng thái cân bằng. Chính các Để ngăn cản sự biệt hóa TBG, một nhóm TBG là lực lượng dự trữ được huy động để chuột được điều trị sau phẫu thuật bằng tái tạo tế bào bị tổn thương đó. Vì thế, điều doxycyclin và giết mổ 21 ngày sau phẫu trị bằng TBG chính là bổ sung nguồn tế bào thuật. Gan chuột sau khi giết mổ, chia thành non trẻ, có thể tạo ra loại tế bào mới, mô mới, 3 phần: một phần cố định trong PFA 4%, bổ sung hoặc thay thế cho các tế bào và mô sau đó chuyển đúc parafin để làm tiêu bản cơ quan bị tổn thương hay mất chức năng. nhuộm hematoxylin và hóa miễn dịch DAB. Trong điều kiện bình thường, tế bào gan Cắt đông lạnh một phÇn, sau đó cố định có khả năng tăng sinh gần như vô hạn. Tuy bằng etanol 98% trong 10 phút. Bảo quản nhiên, trong các bệnh gan mạn tính như xơ tiêu bản ở nhiệt độ -20oC. Một phần gan gan, ung thư gan khi sự tăng sinh của tế bảo quản ở -80oC, phục vụ cho tách chiết bào gan bị ức chế, gan sẽ được tái sinh nhờ protein và t¸ch chiết ARN tổng số. các TBG tăng sinh và biệt hóa [1]. Chúng * Kỹ thuật nhuộm hóa miễn dịch huỳnh tồn tại ở người trưởng thành trong các kênh quang: dẫn Hering và có khả năng biệt hóa thành Để làm hóa miễn dịch huỳnh quang, rửa tế bào gan và tế bào biểu mô đường mật tiêu bản bằng dung dịch đệm phosphat. [2]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự Ủ tiêu bản với kháng thể thứ nhất kháng hiện diện của TBG ở BN mắc bệnh gan nặng cytokeratin 19 - dấu ấn của TBG trong gan. như teo gan vàng cấp, xơ gan. Vì vậy, Kháng thể thứ hai được gắn với chất huỳnh chúng tôi thực hiện đề tài với mục tiêu: Xây quang. Quan sát tế bào và chụp hình ảnh dựng mô hình gây tăng sinh TBG thực trên kính hiển vi huỳnh quang. Tế bào dương nghiệm trên chuột nhằm làm cơ sở để tính hiển thị màu xanh lá nếu kháng thể thứ nghiên cứu cơ chế phân tử của quá trình hai gắn với FITC (Fluorescein này. Đồng thời, đánh giá khả năng tăng isothiocyanate), hiển thị màu đỏ nếu kháng sinh và biệt hóa của TBG trưởng thành sẵn thể thứ hai gắn với CY3 (Indocarbocyanine). có trong gan. Xác định bán định lượng TBG bằng phần ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP mềm Imagequant, so sánh với nhóm NGHIÊN CỨU chứng. 1. Mô hình thực nghiệm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Nghiên cứu tái sinh gan từ TBG thực hiện 1. TBG tăng sinh trong quá trình tái theo mô hình AAF/PT trên chuột Fischer sinh gan từ TBG. F-344 (170 g), 7 tuần tuổi được tiến hành tại đơn vị nghiên cứu 841 thuộc Viện Nghiên cứu Quốc gia, Cộng hòa Pháp (INSERM) và Trung tâm nghiên cứu Y - Dược học quân sự, Học viện Quân y. Chuột được nuôi bằng dinh dưỡng có bổ sung AAF 0,02% trong 12 ngày, thực hiện phẫu thuật cắt 2/3 gan sau 7 ngày của chế độ ăn này. Giết chuột và lấy sinh phẩm trước điều trị (ngày -7), trong ngày phẫu thuật (ngày 0), hoặc ngày 1, 5, 9, 14 và 21 sau phẫu thuật.
3. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 l•îng) TÕ bµo gèc bµo TÕ TÕ bµo gèc bµo TÕ (B¸n ®Þnh l•îng) ®Þnh (B¸n (B¸n ®Þnh ®Þnh (B¸n N1 N5 N9 N114 N21 Ngµy sau phÉu thuËt Hình 1: Sự tăng sinh của TBG trong gan. A. Hình ảnh TBG tăng sinh tại khoảng cửa nhuộm hóa miễn dịch huỳnh quang CK-19. B. Nhuộm hematoxylin, TBG hình Hình 2: Tác dụng của doxycyclin lên tăng tròn nhỏ, nhân bắt màu base đậm (mũi tên). sinh TBG và tế bào gan trong quá trình tái sinh C. Bán định lượng TBG: số lượng TBG đạt gan từ TBG (mô hình AAF/PH). (a,b) Nhuộm cực đại sau 9 - 14 ngày, sau đó giảm dần HE tiêu bản gan chuột không điều trị (a) và theo thời gian. điều trị bằng doxycyclin (b) (độ phóng đại Trong mô hình nghiên cứu AAF/PT (7), 100X). (c, d) nhuộm hóa miễn dịch cytokeratin rất ít TBG xuất hiện ở vùng khoảng cửa 19 tiêu bản gan chuột không điều trị (c) và ngày thứ nhất sau phẫu thuật, sau đó, số điều trị bằng doxycyclin (d) (độ phóng đại lượng của chúng tăng dần theo thời gian. 100X). Số lượng TBG cao nhất ngày thứ 9 và 14, Bảng 1: Tác dụng của doxycyclin trong hình thành cấu trúc các đường dẫn mật liên quá trình tái sinh gan từ TBG trên chuột. tiểu thùy. KHÔNG ĐƯỢC 2. Tác dụng của doxycyclin trên quá ĐIỀU TRỊ ĐIỀU TRỊ trình tăng sinh và biệt hóa của TBG. Số lượng TBG (điểm) 2,5 ± 0,6 4,5 ± 0,3* Để chứng minh TBG biệt hóa thành tế bào gan và không còn biểu hiện dấu ấn CK- Trọng lượng gan (g) 5,4 ± 0,3 5,6 ± 0,1 19, chuột được điều trị tiếp bằng Trọng lượng gan/trọng 2,75 ± 0,04 2,75 ± 0,08 doxycyclin hydrochlorid, một chất ức chế lượng cơ thể (g/100 g) không đặc hiệu của MMP, đồng thời có tác dụng chống tăng sinh và tăng khả năng chết (*p < 0,05 so với chuột không được theo chương trình của tế bào [10]. điều trị). Kết quả cho thấy, số lượng TBG tăng có ý nghĩa trên chuột được điều trị bằng doxycyclin. Số lượng TBG ngày thứ 21 (N21) trên tiêu bản gan chuột được điều trị tăng cao hơn (4,5 ± 0,3) so với chuột không điều
4. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 trị (2,5 ± 0,6, p < 0,05). Kết quả tương tự đường mật. Kết quả nghiên cứu của chúng như khi nhuộm TBG bằng cytokeratin 19 tôi khẳng định điều này. (hình 2c, d). Bên cạnh đó, trọng lượng gan Để khẳng định hiệu quả của mô hình tái và tỷ lệ của nó so với trọng lượng cơ thể sinh gan từ TBG, chuột được điều trị bằng không khác nhau có ý nghĩa trên chuột không doxycyclin để thay cho các chất ức chế nội được điều trị và điều trị bằng doxycyclin. sinh tư nhiên. Giả thiết rằng, sau giai đoạn tăng sinh, TBG sẽ biệt hóa hoàn toàn thành BÀN LUẬN tế bào gan và tế bào biểu mô đường mật để Trên mô hình nghiên cứu AAF/PH, TBG thay thế phần gan đã bị cắt bỏ, ngược lại, xuất hiện thời gian ngắn sau phẫu thuật cắt việc duy trì sự tồn tại của nó bằng doxycyclin gan, đạt số lượng lớn nhất trong khoảng sẽ ngăn cản quá trình này và làm tăng số thời gian từ ngày thứ 9 tới ngày thứ 14, sau lượng TBG trong gan. Thực nghiệm đã chứng đó biến mất khi chúng biệt hóa hoàn toàn minh điều này, số lượng TBG tăng có ý nghĩa thành tế bào gan. TBG tiếp xúc trực tiếp với trên chuột được điều trị bằng doxycyclin so các nguyên bào sợi và được bao bọc bởi với nhóm chứng. Kết quả không thể lý giải màng cơ bản có thành phần chủ yếu là bằng tác dụng của kháng sinh kích thích laminin, collagen IV, sắp sếp xen kẽ tạo cấu tăng sinh cũng như giảm chết theo chương trúc đặc biệt [3, 4]. Gan có khả năng tăng trình TBG, vì bản thân doxycyclin vốn có tác sinh gần như vô hạn. Vì vậy, trong điều kiện dụng chống tăng sinh và làm tăng chết theo bình thường, khi phẫu thuật cắt 2/3 gan ở chương trình của tế bào [10]. Đặc biệt, số chuột cống trắng Fisher, sau 3 tuần, tế bào lượng tế bào gan đang phân chia trên chuột gan sẽ tăng sinh bù lại toàn bộ phần gan đã được điều trị bằng doxycyclin lớn hơn so bị cắt bỏ. Ở người, khi phẫu thuật cắt gan, với nhóm chứng và trọng lượng gan không tế bào gan cũng tăng sinh nhanh chóng để khác nhau có ý nghĩa ở hai nhóm này. Kết hồi phục toàn bộ phần thương tổn. AAF là quả trên chỉ có thể giải thích: TBG ngăn cản một trong những chất hóa học có tác dụng biệt hóa dẫn đến việc tăng sinh tế bào gan ức chế tăng sinh của tế bào gan. Vì vậy, khi mới biệt hóa để bù lại phần gan bị mất đi. cho chuột ăn chế độ ăn có chứa AAF trước và sau phẫu thuật, khả năng tăng sinh của KẾT LUẬN tế bào gan bị ức chế. Thay vào đó là TBG Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể gây trưởng thành sẵn có trong gan tăng sinh. tái sinh gan từ TBG trên chuột cống Fisher Các tế bào này vẫn luôn tồn tại ở trong thực nghiệm bằng cách cho ăn thức ăn chứa kênh dẫn Hering, phần chuyển tiếp giữa tế AFF kết hợp với phẫu thuật cắt 2/3 gan. bào gan và tế bào biểu mô đường mật [1]. Khi tế bào gan tăng sinh bị ức chế, các TÀI LIỆU THAM KHẢO TBG sẽ tăng sinh trong khoảng cửa về phía tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy, sau đó biệt 1. Fausto N. Liver regeneration and repair: hepatocytes, progenitor cells, and stem cells. hóa thành tế bào gan và tế bào biểu mô Hepatology. 2004, 39, pp.1477-1487.
5. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 2. Hu Z, Evarts R P, Fujio K, Marsden ER, Thorgeirsson SS. Expression of hepatocyte growth factor and c-met genes during hepatic differentiation and liver development in the rat. Am J Pathol 1993, 142, pp.1423-1830. 3. Bustos M, Sangro B, Alzuguren P, Gil AG, Ruiz J, Beraza N, Qian C et al. Liver damage using suicide genes. A model for oval cell activation. Am J Pathol. 2000,157, pp.549-559. 4. Park DY, Suh KS. Transforming growth factor-beta1 protein, proliferation and apoptosis of oval cells in acetylaminofluorene-induced rat liver regeneration. J Korean Med Sci. 1999, 14, pp.531-538. 5. Martinez-Hernandez A, Amenta PS. The hepatic extracellular matrix. I. Components and 9. Winwood P J, Schuppan D, Iredale J P, distribution in normal liver. Virchows Arch A Kawser CA, Docherty AJ, Arthur MJ. Kupffer cell- Pathol Anat Histopathol. 1993, 423, pp.1-11. derived 95-kd type IV collagenase/gelatinase B: 6. Sternlicht MD, Werb Z. How matrix characterization and expression in cultured cells. metalloproteinases regulate cell behavior. Annu Hepatology. 1995, 22, pp.304-315. Rev Cell Dev Biol. 2001, 17, pp.463-516. 10. Liu J, Kuszynski CA, Baxter BT. Doxycycline 7. Mavier P, Martin N, Couchie D, Preaux induces Fas/Fas ligand-mediated apoptosis in AM, Laperche Y, Zafrani ES. Expression of Jurkat T lymphocytes. Biochem Biophys Res Commun stromal cell-derived factor-1 and of its receptor 1999, 260, pp.562-567. CXCR4 in liver regeneration from oval cells in rat. Am J Pathol. 2004;165; pp.1969-1977. 8. Serandour AL, Loyer P, Garnier D, Courselaud B, Theret N, Glaise D, Guguen-Guillouzo C et al. TNFalpha-mediated extracellular matrix remodeling is required for multiple division cycles in rat hepatocytes. Hepatology. 2005, 41, pp.478-486. Ngày nhận bài: 2/4/2013 Ngày phản biện đánh giá bài báo: 8/5/2013 Ngày bài báo được đăng: 23/5/2013
6. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013