Tần suất alen mini-str tại 4 locus mini str ở người Việt qua phân tích các mẫu bị biến tính trong thực nghiệm

Nội dung text: Tần suất alen mini-str tại 4 locus mini str ở người Việt qua phân tích các mẫu bị biến tính trong thực nghiệm

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 TẦN SUẤT ALEN MINI-STR TẠI 4 LOCUS MINI STR Ở NGƢỜI VIỆT QUA PHÂN TÍCH CÁC MẪU BỊ BIẾN TÍNH TRONG THỰC NGHIỆM Trần Văn Khoa* TÓM TẮT Tần suất alen từ 66 mẫu ADN không có quan hệ huyết thống bị biến tính ở nhiệt độ 370C, độ ẩm 100% trong các khoảng thời gian 2 tuần, 8 tuần và 16 tuần, đun ở 1000C trong 30 phút, 2 giờ, 4 giờ và 5 giờ. Tần số alen được phân tích tại 4 locus D18S51, D8S1179, THO1 và FGA. Kết quả: các alen mini STR của cá thể đều cho thông tin cần thiết. Tỷ lệ dị hợp tử quan sát dao động từ 0,8305 - 0,9492. Như vậy, phân tích marker mini STR tại các locus mini STR có thể ứng dụng đối với mẫu ADN bị biến tính một phần ứng dụng cho lĩnh vực pháp y. * Từ khoá: Mini STRs; Nhận dạng cá thể. ALLELE FREQUENCY AT 4 AUTOSOMAL MINI STR LOCI IN VIETNAMESE PEOPLE ANALYSED FROM EXPERIMETALLY DEGRADED SAMPLES SUMMARY The allele frequencies were determined for 66 unrelated genomic DNA samples. Which were not preserved for different period time: 2 weeks, 8 weeks and 16 weeks in condition of 370C temperature with 100% humidity, and in boiling water for 30 minutes, 2 hours, 4 hours and 5 hours. The allele frequency distributions were analyzed for four unlinked polymorphic DNA loci: D18S51, D8S1179, THO1 and FGA. Results: All mini STR markers were successfully amplified and informative. The observed heterozygote frequencies of the loci ranged from 0.8305 to 0.9492. Based on the results of testing these four systems can provide a useful tool for forensic applications with degraded samples. * Key words: Mini STRs; Individual identification. ĐẶT VẤN ĐỀ phục sự thất bại khi mẫu ADN bị phân huỷ nặng. Trong thực tế, nếu không có tàng thư gen dựa trên phân tích mini STRs để tham Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, việc chiếu trong trường hợp mẫu ADN bị phân sử dụng phân tích STR trong nhận dạng và huỷ một phần sẽ gây khó khăn cho công tác xác định huyết thống đang phát triển [1]. giám định. Tuy nhiên, thông tin mini STRs Tuy nhiên, việc sử dụng tiểu trình tự lặp lại thu được trong mẫu ADN bị phân huỷ một ngắn trong lĩnh vực này chưa được quan phần có giá trị đến đâu cần được nghiên tâm nghiên cứu ở nước ta. Tiểu trình tự lặp cứu để làm cơ sở cho xây dựng tàng thư lại ngắn là trình tự ADN lặp lại, thiết kế gen mini STRs trước khi tiến hành trên quy nhân lên đoạn ngắn phía trong so với các mô rộng. trình tự lặp lại ngắn thông thường để khắc * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa (tranvankhoa@gmail.com) Ngày nhận bài: 10/10/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/12/2013 Ngày bài báo được đăng: 16/12/2013 63
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm: Bước đầu xác định tần suất một o số alen mini STR ở người Việt, đánh giá 96 C 2 phút 1 chu kỳ khả năng nhận dạng cá thể qua phân tích 94oC 30 giây mini STRs từ các mẫu ADN bị phân huỷ 60oC 2 phút 30 chu kỳ một phần trong thực nghiệm. o 72 C 90 giây ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG 60oC 45 phút 1 chu kỳ PHÁP NGHIÊN CỨU 4oC ∞ 1 chu kỳ 1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu. 66 mẫu máu toàn phần của phi công và Điện di mao quản tự động trên hệ thống tổ lái thu thập tại Viện Y học Hàng không. máy giải trình tự AB 3130XL, phân tích Xử lý mẫu máu thực nghiệm theo mô hình alen: thêm 1 µl sản phẩm PCR hoặc 1 µl of của Dixon và CS 2006 [2]: để mẫu ở môi PowerPlex® S5 Allelic Ladder Mix. Biến trường 370C với độ ẩm 100% trong thời tính 95 trong 3 phút, sau đó để ngay trong gian 2 tuần, 8 tuần, 16 tuần. Tạo mẫu ADN đá 3 phút trước khi tra mẫu điện di. biến tính một phần bằng tác nhân nhiệt độ ở 1000C trong 30 phút, 2 giờ, 4 giờ và 5 giờ. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Hóa chất: kít tách chiết ADN, Qiagen, kit tách chiết ADN bằng hạt từ tính, bộ kÝt ADN 1. Kết quả xác định kiểu gen của locus IQ, Promega. Hóa chất thông thường cho STR trên máy giải trình tự gen. PCR, điện di. Kit phân tích mini STR Sau khi thu được mẫu ADN đạt tiêu chuẩn, PowerPlex® S5 PCR Amplification Kit. Các xác định nồng độ và độ tinh sạch của các hóa chất khác dùng cho điện di mao quản mẫu, chúng tôi tiến hành phản ứng nhân gen tự động trên máy giải trình tự ABI, 3130XL, để xác định đa hình locus mini STR nghiên POP-4™ Polymer, Hi-DiTM Formamide. cứu. Sử dụng bộ kÝt nhân gen Powerplex S5 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. PCR Amplification kit. Đây là bộ kÝt cho phép đồng khuếch đại và phát triển 5 locus, bao * Tách chiết ADN: gồm cả D8S1179, D18S51, FGA và TH01, Tách chiết ADN từ mẫu không bị biến kích thước sản phẩm khuyếch đại mini STR tính bằng kít Qiagen, tách chiết ADN từ các sấp xỉ 100 bp [6]. Đối với các mẫu nghiên mẫu bị biến tính một phần bằng bộ kít ADN cứu, sau khi chạy điện di, kết quả thu được IQ theo nguyên lý hạt từ tính [5]. sẽ xử lý bằng phần mềm Genemapper ID 3.2. Sau khi thu được mẫu ADN, tiến hành Qua phân tích, đối với những mẫu bị định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của sản biến tính cũng như mẫu không bị biến tính, phẩm bằng phương pháp định lượng trên chúng tôi đều thu được thông tin về các loại máy đo quang phổ Nanodrop 1000 (Mỹ). alen thuộc locus gen. * Phản ứng PCR nhân gen mini STR: Với số liệu thu được, tiến hành tính toán Thành phần phản ứng PCR: Powerplex tần suất đồng hợp tử, tần suất dị hợp tử của S5 5X Master Mix 5µl, Power Plex S5 10X những trường hợp trên để bước đầu đánh Primer Pair Mix 2,5 µl, ADN khuôn 0,25 - giá khả năng nhận dạng của mini STRs. 0,50 ng, nước cất vừa đủ 25 µl [6]. Nhân gen trên máy PCR 9700 (ABI, Mỹ) theo chu trình nhiệt (bảng 1). 64
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Bảng 2: Kiểu gen dựa trên marker mini STR của 66 mẫu. Amello D18S51 D8S1179 TH01 FGA KIỂU GEN* 1 X Y 15 21 10 12 7 9 21 25 XY1521101207092125 2 X Y 14 18 8 10 6 10 24 27 XY1418081006102427 3 X Y 14 15 12 17 7 10 17 24 XY1415121707101724 4 X Y 15 16 10 13 9 9.3 25 25 XY15161013099.32525 5 X Y 16 19 13 13 6 9 18 22.2 XY1619131306091822.2 6 X Y 15 20 10 14 7 9 21 25 XY1520101407092125 7 X Y 14 16 12 15 7 7 20 21 XY1416121507072021 8 X Y 13 15 12 14 9 9 23 25 XY1315121409092325 9 X Y 14 15 11 15 7 9.3 21 22 XY14151115079.32122 10 X Y 12 15 11 15 9 10 17 21 XY1215111509101721 11 X Y 13 21 14 14 6 9 21 23 XY1321141406092123 12 X Y 13 17 10 15 7 8 19 21 XY1317101507081921 13 X Y 15 16 10 10 9 10 21 22 XY1516101009102122 14 X Y 14 19 11 16 8 9 19 23 XY1419111608091923 15 X Y 14 15 10 19 7 7 21 24 XY1415101907072124 16 X Y 13 16 13 15 7 8 22 23 XY1316131507082223 17 X Y 12 14 11 12 7 9 19 23 XY1214111207091923 18 X Y 13 15 13 13 9 9 18 24 XY1315131309091824 19 X Y 18 19 14 15 7 9 23 24 XY1819141507092324 20 X Y 15 15 10 12 6 8 22 23 XY1515101206082223 21 X Y 14 15 12 16 9 10 24 25 XY1415121609102425 22 X Y 13 14 10 13 6.3 9 19 22.2 XY131410136.3091922.2 23 X Y 15 16 13 15 6.3 9 20 23 XY1516131507092023 24 X Y 13 22 11 15 9 9.3 22 22 XY13221115099.32222 25 X Y 14 15 10 13 6 7 23 23 XY1415101306072323 26 X Y 13 16 10 15 9 9.3 21 23 XY13161015099.32123 27 X Y 17 18 10 14 6 9 21 23 XY1718101406092123 28 X Y 13 14 13 16 9 9 22 26 XY1314131609092226 29 X Y 16 19 10 15 7 9 24 25 XY1619101507092425 30 X Y 13 18 14 15 7 9 22.2 26 XY13181415070922.226 31 X Y 12 22 13 17 7 9 22 25 XY1222131707092225 32 X Y 14 20 11 13 8 9 22 26 XY1420111308092226 33 X Y 13 20 14 16 8.3 8.3 24 24 XY1320141609092424 34 X Y 13 17 10 11 6 347 22 24 XY1317101106072224 65
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7 (8) (9) (10) (11) (12) 35 X Y 16 17 14 14 6.3 9 23 26 XY161714146.3092326 36 X Y 12 22 10 11 7 9 22 25 XY1222202207092326 37 X Y 16 20 12 16 7 9 21.2 26 XY16201216070921.226 38 X Y 15 15 13 15 6 7 22 23 XY1515131506072223 39 X Y 13 16 14 15 6 8 19 21 XY1316141506081921 40 X Y 15 16 12 16 7 9 21 24 XY1516121607092124 41 X Y 16 17 13 14 6 7 23 26 XY1617131406072326 42 X Y 10 13 11 12 5 7 22 24 XY1013111205072224 43 X Y 13 25 12 17 5 6 24 25 XY1325121705062425 44 X Y 15 15 13 14 9 9 18 23 XY1515131409091823 45 X Y 12 16 13 15 6 9.3 23 23 XY12161315069.32323 46 X Y 15 17 12 14 9 9 22 23 XY1517121409092223 47 X Y 15 18 10 10 7 9 22 24 XY1518101007092224 48 X Y 13 15 15 16 7 9 19 21.2 XY1315151607091921.2 49 X Y 15 16 11 14 9 9 22 22 XY1516111409092222 50 X Y 14 20 11 12 9 9.3 19 26 XY14201112099.31926 51 X Y 13 15 10 13 6 10 18 25 XY1315101306101825 52 X Y 14 15 11 15 8 9 19 25 XY1415111508091925 53 X Y 16 19 11 13 7 9 20 23 XY1619111307092023 54 X Y 12 14 14 15 7 8 23 25 XY1214141507082325 55 X Y 14 15 9 10 8 10 22 23 XY1415091008102223 56 X Y 12 23 10 11 6 8 22 22 XY1223101106082222 57 X Y 13 15 14 15 7 9 18 24 XY1315141507091824 58 X Y 15 15 10 12 7 9 22 25.2 XY1515101207092225.2 66 X Y 14 18 15 15 7 7 20 22 XY1418151507072022 60 X Y 15 15 12 14 7 10 24 25 XY1515121407102425 61 X Y 14 16 10 17 7 9 21 24 XY1416101707092124 62 X Y 16 19 12 15 7 9 21.2 23 XY16191215070921.223 63 X Y 14 16 11 13 7 8 21 22 XY1416111307082122 64 X Y 14 15 10 15 6 7 22 23 XY1415101506072223 65 X Y 15 16 13 15 6 7 21 24 XY1516131506072124 66 X Y 15 15 7 11 9 10 19 21 XY1515071109101921 (* Kiểu gen: Viết liên tục, hai chữ số cho một alen). Ở các mẫu ADN không bị biến tính và bị biến tính một phần, thông tin thu được từ phân tích alen của 5 locus gen đều tốt, không có bất kỳ trường hợp nào trùng nhau về kiểu gen. 66
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 2. Đánh giá khả năng nhận dạng trên các mẫu nghiên cứu. Bảng 3: Tỷ lệ gen đồng hợp và gen dị hợp locus gen của 66 mẫu nghiên cứu. D18S51 4/66 (6,06%) 93,94% D8S1179 6/66 (9,09%) 90,91% TH01 10/66 (15,15%) 84,85% FGA 5/66 (7,58%) 92,62% Các locus gen có tỷ lệ dị hợp tử cao, bước đầu có thể đánh giá khả năng nhận dạng trên mẫu nghiên cứu tốt. Bảng 4: Tần suất xuất hiện các alen (%). 5 1,52 (2/132)* 6 12,12 (16/132) 6.3 2,27 (3/132) 7 0,76 (1/132)* 29,55 (37/132) 8 - 0,76 (1/132)* 8,33 (11/132) 8.3 1,52 (2/132)* 9 - 0,76 (1/132)* 34,85 (46/132)** 9.3 5,08 (6/132) 10 0,76 (1/132)* 18,18 (24/132) 6,82 (9/132) 10.2 - 11 - 12,12 (16/132) - 12 5,30 (7/132) 12,12 (16/132) 12.2 13 13,64 (18/132) 15,15 (20/132) 13.2 - - 14 15,15 (20/132) 13,64 (18/132) 15 27,27 (36/132)** 17,42 (23/132)** 16 15,15 (20/132) 5,30 (7/132) - 17 4,55 (6/132) 3,03 (4/132) 1,69 (2/132) 18 5,30 (7/132) - 3,79 (5/132) 18.2 - 19 4,55 (6/132) 0,76 (1/132)* 6,82 (9/132) 19.2 - 67
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 (1) (2) (3) (4 (5 20 3,79 (5/132) 3,39 (4/132) 20.2 - 21 1,52 (2/132) 12,88 (17/132) 21.2 2,54 (3/132) 22 2,27 (3/132) 18,18 (24/132) 22.2 2,27 (3/132) 23 0,76 (1/132)* 18,18 (24/132)** 23.2 - 24 - 13,64 (18/132) 24.2 - 25 0,76 (1/132)* 11,36 (14/132) 25.2 0,76 (1/132)* 26 - 4,55 (7/132) 27 - 0,76 (1/132)* Tổng alen 14/22 alen (10+1)/12 alen 9/12 alen 14/28 alen (Ghi chú: * alen có tần số thấp nhất; ** alen có tần số cao nhất; (-) alen không thấy xuất hiện). Theo thang alen chuẩn, locus D18S51 (18,18%). 14 alen không phát hiện thấy là: có 22 alen khác nhau. Chúng tôi đã phát 16, 18.2, 19.2, 20.2, 23.2, 24.2, 28, 29, 30, hiện được 14/22 alen. Trong đó, thấp nhất 31.2, 43.2, 44.2, 45.2 và 46.2. là alen 10, 23 và 25 (0,76%), cao nhất là Về mặt lý thuyết, có thể tính toán số kiểu alen 15 (27,27%). 8 alen không phát hiện gen trong quần thể theo công thức. Số kiểu thấy là alen 8, 9, 10.2, 11, 13.2, 24, 26, 27. gen = n (n + 1)/2 [7]. Trong đó, n là số loại Đối với locus D8S1179, phát hiện thấy alen. 11/12 alen khác nhau trong thang chuẩn. - Locus D18S51 nghiên cứu xuất hiện 14 Trong đó, thấp nhất là alen 7, 8 và 9, 19 alen, như vậy có số kiểu gen là 105. (0,76%), cao nhất là alen 15 (17,42%). - Locus D8S1179 nghiên cứu xuất hiện Không thấy alen 18, nhưng lại có alen 11 alen, như vậy có số kiểu gen là 66. không có trong thang alen chuẩn, là alen 19. - Locus TH01 nghiên cứu xuất hiện 9 alen, Đối với locus TH01, phát hiện thấy 9/12 như vậy có số kiểu gen là 45. alen khác nhau trong thang chuẩn. Trong - Locus FGA nghiên cứu xuất hiện 14 đó, thấp nhất là alen 5 và 8.3 (1,52%), cao alen, như vậy có số kiểu gen là 105. nhất là alen 9 (34,85%). 2 alen không phát Tổ hợp 4 locus nói trên có tới 32.744.250 hiện thấy là alen 4, 11 và 13.2. khả năng kiểu gen khác nhau. Đối với locus FGA, đã phát hiện 14/28 Để đánh giá khả năng nhận dạng cá thể, alen khác nhau. Trong đó, thấp nhất là alen chúng ta xem xét độ tin cậy và xác suất 25.2 và 27 (0,76%), cao nhất là alen 23 trùng hợp khi một người có kiểu gen đồng 68
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 hợp tử với 1 alen có tần suất thấp nhất - Xác định được tần suất alen, tần số dị (0,0076 của alen 10 thuộc locus D18S51) hợp tử của locus gen mini STR khảo sát. và 1 alen có tần suất cao nhất (0,3485 của Phát hiện ra một alen mới số 19, không có alen 9 thuộc TH01) trong dữ liệu thu được [7]: trong thang alen chuẩn tại locus D8S1179. Trường hợp 1: nếu một người có kiểu KIẾN NGHỊ gen đồng hợp với tần suất alen 0,0076, độ Tăng số mẫu phân tích trong quần thể tin cậy thu được sẽ là (1 - 0,00762) x 100% khoảng 200 người để có được thông số cho = 99,9943%, khả năng trùng hợp sẽ là việc tính toán độ tin cậy, khả năng phân 1/0,00762, nghĩa là khoảng 1.754 người có biệt, xác suất trùng hợp... 1 người trùng hợp kiểu gen. Tuy nhiên, tỷ lệ Áp dụng phân tích các mini-STR nhận đồng hợp tử nói chung của locus cũng dạng cá thể hoặc xác định huyết thống đối không cao. Trong 66 mẫu nghiên cứu, với các mẫu ADN bị biến tính trong trường chúng tôi chưa gặp trường hợp nào đồng hợp không thu được thông tin khi sử dụng hợp tử alen 10, locus D18S51. marker STR thông thường. Trường hợp 2: nếu một người có kiểu gen đồng hợp với tần suất alen 0,3845, độ TÀI LIỆU THAM KHẢO tin cậy thu được sẽ là (1 - 0,38452) x 100% 1. Carracedo A and Lareu MV. Proceedings = 87,86%, khả năng trùng hợp sẽ là 2 of the ninth international symposium on human 1/0,3845 , nghĩa là khoảng 8 người có 1 indentification. Madison WI: Promega corporation. người trùng hợp kiểu gen. 1998, pp.89-107. Ví dụ, trên phân tích với từng alen riêng 2. Dixon L.A, Dobbins A.E, Pulker H.K. et al. lẻ. Do tỷ lệ kiểu gen đồng hợp tử của các Analysis of artificially degraded DNA using STRs locus gen không cao, khi kết hợp nhiều alen and SNPs-results of a collaborative European với nhau, khả năng phân biệt sẽ cao hơn (EDNAP) exercise. Forensic Science International. nhiều và xác suất trùng hợp rất thấp. 2006,164, pp.33-44. Với số lượng mẫu lớn hơn, khoảng 200 3. John M. Butler. Forensic DNA typing: Biology, Technology, and Genetics of STR Markers. cá thể, việc tính toán khả năng phân biệt, Second edition Academic Press. London. 2005. xác suất trùng lặp của tất cả locus sẽ cho thông tin sát với di truyền quần thể. 4. Matthew B. Hamilton. Population Genetics Wiley-Blackwell. 2009, pp.9-49. Với số lượng mẫu lớn hơn, tổ hợp kiểu 5. Promega. Technical Bullentin for use with gen còn phong phú, đa dạng hơn rất nhiều, DNA IQ. 2011. cho thấy khả năng sử dụng marker mini 6. Promega. Technical manual PowerPLexS5 STR trong nhận dạng cá thể từ các mẫu bị System. 2011. biến tính. 7. Wing Kam Fung and Yue Qing. Statistical KẾT LUẬN DNA forensics. John Wiley Sons and Ltd. 2008. Qua phân tích miniSTR của 66 mẫu máu cá thể được xử lý gây phân huỷ ADN một phần trong thực nghiệm, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: - Đã chuẩn hóa được quy trình phân tích mini-STR từ các mẫu ADN bị biến tính một phần. 69
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 70