Tách và phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ ứng dụng chẩn đoán không can thiệp

Nội dung text: Tách và phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ ứng dụng chẩn đoán không can thiệp

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 TÁCH VÀ PHÂN LẬP TẾ BÀO PHÔI THAI TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA MẸ ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN KHÔNG CAN THIỆP Triệu Tiến Sang*; Trần Văn Khoa*; Đinh Đoàn Long** TÓM TẮT Năm 1893, Schmorl phát hiện tÕ bµo (TB) phôi thai ở phổi của phụ nữ mang thai. Tới nay, sau nhiều nghiên cứu, đã khẳng định sự có mặt của TB phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ. Từ tuần thứ 8 của thai kỳ, đã phát hiện được các TB của thai gồm: trophoblast, bạch cầu, hồng cầu nhân, TB gốc. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: lựa chọn 30 phụ nữ mang thai từ tuần thứ 8 đến tuần thứ 22 của thai kỳ. Sử dụng phức hợp hạt từ và kháng thể đơn dòng CD71 để tách hồng cầu có nhân ra khỏi TB máu ngoại vi của mẹ. Sau khi tách được TB hồng cầu có nhân của con ra khỏi TB máu ngoại vi của mẹ, dùng bộ kít Vysis probes Multicolor MultiVysion PGT nhuộm huỳnh quang nhiễm sắc thể (NST) 13, 18, 21, X và Y. Kết quả: 15 tế bào hồng cầu có nhân bắt màu huỳnh quang với NST X, các NST 13, 18, 21. 13 TB hồng cầu có nhân bắt 48
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 màu huỳnh quang với NST XY, NST 13, 18, 21 bình thường đều có 2 tín hiệu huỳnh quang. Có hai mẫu TB hồng cầu có nhân của con không bắt được tín hiệu. * Từ khóa: Tế bào phôi thai; Máu ngoại vi; Phân lập. EXTRACTION AND ISOLATION OF EMBRYONIC CELL IN MATERNAL PERIPHERAL BLOOD CELL APPLYING IN NON-INTERFERENCE DIAGNOSIS SUMMARY Introduction: the discovery of the existence of fetal cells in maternal peripheral blood has opened up a new direction for the early diagnosis of congenital anomalies by means of non- interference. Objects, chemicals and research methods: we selected 30 pregnant women in the 8th week to the 22th week of pregnancy. CD71 antibodies are associated with chemical biotin magnetic beads were attached to streptavidin. Complex particles from above CD71 binds to red blood cells of the embryo have the principle immune. After extraction of isolated embryonic cells in maternal peripheral blood cells and staining kits using Vysis probes Multicolor MultiVysion PGT probe which binds specifically on the Y chromosome. Results 15 nucleated red blood cells of fetal cells carrying XX chromosomes and 13 of nucleated red blood cells carrying XY chromosomes. In 30 nucleated red blood cells, there are 2 nucleated red blood cells not signal appeared. * Key words: Embryo cells; Peripheral blood; Isolation. * Học viện Quân y ** Đại học Y Dươc - Đại học Quốc Gia Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Triệu Tiến Sang (trieusangk83@yahoo.com.vn) Ngày nhận bài: 28/04/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 28/07/2014 Ngày bài báo được đăng: 08/08/2014 ĐẶT VẤN ĐỀ có sự khác biệt giữa các TB: trophoblast xuất hiện sớm nhất, nhanh bị hủy, không Năm 1893, Schmorl phát hiện sự tån có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu; bạch t¹i cña TB phôi thai ở phổi của phụ nữ cầu phôi thai tồn tại cả sau thai kỳ, không mang thai. Sau nhiều nghiên cứu, đến có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu; hồng nay đã khẳng định sự có mặt của TB phôi cầu nhân xuất hiện sớm và tồn tại trong thai trong máu ngoại vi của mẹ. Từ tuần suốt thai kỳ, có kháng nguyên bề mặt đặc thứ 8 của thai kỳ, đã phát hiện được các hiệu. Do vậy, các nghiên cứu trên thế giới TB của thai gồm: trophoblast, bạch cầu, tập trung vào phân tách hồng cầu nhân. hồng cầu nhân, TB gốc. Số lượng các TB Tách được riêng biệt TB phôi thai trong này rất thấp, nhưng mang vật chất di truyền máu ngoại vi của mẹ đã mở ra một hướng của phôi thai, do vậy rất có ý nghĩa trong mới trong chẩn đoán trước sinh bằng biện chẩn đoán dị tật sớm cho thai. Tuy nhiên, pháp không can thiệp. 49
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 Hình 1: Hình ảnh các TB tồn tại trong máu ngoại vi của thai phụ (©2009 Artenmis Health Inc.). ĐỐI TƢỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ Máy lắc ổn nhiệt (Eppendorf, Đức), máy PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU li tâm cao tốc (Hettich, Đức), pipet man 1. Đối tƣợng nghiên cứu. (Ginson, Mỹ), buồng thao tác PCR (Mỹ), 30 phụ nữ mang thai ở tuần thứ 8 đến giá từ tính (Promega, Mỹ), bể nước ổn nhiệt tuần thứ 22 của thai kỳ. Tất cả được lấy 5 (Mỹ), hệ thống kính hiển vi huỳnh quang (Axio Zeiss, Đức). ml máu toàn phần. 2 mẫu đối chứng âm 4. Phƣơng pháp nghiên cứu. là 2 nữ giới chưa mang thai và chưa quan hệ tình dục lần nào, cũng được lấy 5 ml. Quy trình thực hiện Các mẫu nghiên cứu được lấy tại Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, MÉu m¸u Học viện Quân y. T¹o phøc hîp h¹t tõ - hång cÇu nh©n 2. Hóa chất nghiên cứu. Hạt từ tính đã gắn streptavidin, kháng thể CD71 đã biotin hóa, PBS 1X, ethanol 70%, T¸ch phøc hîp h¹t tõ - hång cÇu nh©n ethanol 100%, proteinase K, nước cất, bộ kít Vysis MultiVysion PGT Multicolor probes, lam kính, lamen, NP40, SSC20X, antifade II, Thu TB hång cÇu nh©n formamide, nước tinh khiết, HCl, methanol, axít acetic. 3. Thiết bị máy móc. Gắn probe huỳnh quang và kiểm tra TB trên hệ thống kính hiển vi huỳnh quang 8
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 nhược trương 0,2% Tween20 in 0,01 M HCl, pH 2,0 bộc lộ nhân TB. Bước 3: rửa lam kÝnh bằng dung dịch * Quy trình tách chiết bằng hạt từ tính: PBS 1X (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, Kháng thể CD71 được biotin hóa gắn 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4) trong với hạt từ tính đã gắn với streptavidin. 5 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa sạch trong Phức hợp hạt từ trên có CD71 gắn với nước cất vô trùng 2 lần. Loại nước bằng hồng cầu nhân của phôi thai theo nguyên dung dịch cồn 70%, 90%, 100% trong 2 phút tắc miễn dịch. ở nhiệt độ phòng và làm khô trong không khí. Cụ thể các bước như sau: Bước 4: thêm 2 µl hỗn hợp probe và phủ lên trên bằng 1 lamen kích thước 9 x + Bước 1: lấy 10 µl kháng thể đã biotin hóa vào ống 1,5 ml. 9 mm. Bao phủ xung quanh bằng lớp nhựa gắn cao su để tránh thoát hơi nước. + Bước 2: thêm 20 µl hạt từ đã gắn streptavidin, ủ ở 40C trong 30 phút. Bước 5: ủ trong block nhiệt 750C trong + Bước 3: thêm 100 µl PBS 1X, lắc nhẹ, 5 phút, sau đó lai từ 16 - 22 giờ trong tủ đặt vào giá từ tính, hút bỏ dịch. ấm 370C. + Bước 4: thêm 100 µl PBS 1X, lắc nhẹ, Bước 6: tách bỏ lamen và keo gắn lam hút hết dịch cho vào ống chứa máu ngoại kính, rửa lam kính trong dung dịch SSC vi của mẹ đã lấy trước đó. Lắc quay tròn 4X/0,05% Tween20 (pH 7,0) ở nhiệt độ phòng. 15 phút ở 40C. Bước 7: rửa nghiêng mặt lam kính bằng + Bước 5: hút từng 1 ml máu cho vào dung dịch 0,4X SSC/0,3% NP40 ở 730C èng 1,5 ml. Đặt lên giá từ tính hút bỏ toàn trong 5 phút. bộ dịch, giữ lại phức hợp hạt từ - hồng cầu nhân đã bị gắn lên trên thành ống Bước 8: rửa lam kính trong dung dịch phía giá từ tính. SSC 2X ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. + Bước 6: thêm 100 µl PBS, lắc đều, Bước 9: lấy lam kính ra đặt trong phòng đặt lên giá từ tính, hút bỏ phần dịch lỏng tối, dùng giấy mềm lau khô. Thêm 3 µl (làm lại 3 lần). antifade II, sau đó đặt lamen lên trên. + Bước 7: thêm 20 µl PBS 1X, Voltex 5 Bước 10: quan sát tín hiệu huỳnh quang giây, lưu mẫu TB trong tủ -200C. của TB phôi trên kính hiển vi huỳnh quang. * Quy trình gắn probe lên TB hồng cầu có nhân: Bước 1: hút dịch TB phôi đã tách được sau khi tách ở quy trình trên đặt lên lam kính. Đánh dấu vị trí đặt TB bằng cách khoanh vùng mặt dưới của lam kính. Bước 2: để khô lam kính trong không khí, sau đó chuyển lam kính vào dung dịch 51
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Sau khi tách chiết phân lập được TB phôi trong máu ngoại vi mẹ và nhuộm TB bằng bộ kít Vysis MultiVysion PGT Multicolor probes, trong đó có probe gắn đặc hiệu trên NST Y. Hình 2: Hình ảnh nhuộm huỳnh quang mẫu TB phôi thai số 555. (NST số 13: phổ màu đỏ, NST số 18: phổ Aqua xanh nước biển, NST số 21: phổ xanh lá cây, NST Y: phổ màu vàng, NST X: phổ màu xanh rêu). Hình ảnh trên cho thấy đây là phôi mang bộ NST 46, XY. Các NST 13, 18, 21 đều có 2 tín hiệu, màu vàng có 1 tín hiệu của NST Y và một tín hiệu màu xanh rêu của NST X. Hình 3: Hình ảnh nhuộm huỳnh quang NST của TB hồng cầu có nhân phôi thai số 556. Kết quả trên TB hồng cầu có nhân của phôi thai ë bệnh nhân nghiên cứu số 556 có 2 NST X và các NST 13, 18, 21 đều có 2 tín hiệu bình thường. Trong tiêu bản này không xuất hiện tín hiệu màu vàng của NST Y. 53
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 Qua phân tích kết quả của 30 phôi thai nghiên cứu, chúng tôi thu được bảng kết quả Karotype của 5 NST 13, 18, 21 và X, Y như sau: STT 1 269 + 46, XY + 2 270 - 46, XX - 3 271 - 46, XX - 4 272 + 46, XY + 5 275 - 46, XX - 6 276 + 46, XY + 7 276 - 46, XX - Không xuất hiện 8 277 + NG + tín hiệu 9 278 + 46, XY + 10 280 - 46, XX - 11 295 - 46, XX - 12 296 + 46, XY + 13 297 + 46, XY + 14 298 + 46, XY + 15 300 - 46, XX - 16 301 + 46, XY + Không xuất hiện 17 303 + NG + tín hiệu 18 307 + 46, XY + 19 308 + 46, XY + 20 309 - 46, XX - 21 310 - 46, XX - 22 311 - 46, XX - 23 312 - 46, XX - 24 313 - 46, XX - 25 314 + 46, XY + 26 315 + 46, XX + 27 316 - 46, XY - 28 317 + 46, XY + 29 318 - 46, XX - 30 319 - 46, XX - 15 TB hồng cầu có nhân của phôi thai mang NST XX và 13 hồng cầu có nhân của phôi mang NST XY. Trong 30 phôi này, 2 phôi không xuất hiện tín hiệu. Có thể những phôi này không phá vỡ màng TB và màng nhân, do vậy các probe không thể gắn được vào NST. Trong 15 phôi được kiểm chứng bằng ADN phôi thai tự do mang NST XY được phân lập từ TB phôi, chúng tôi nhuộm thành công cho 13/15 trường hợp khi nhuộm FISH. Các phôi được kiểm chứng bằng ADN phôi thai tự do mang NST XX được nhuộm FISH đều thấy bộ NST xuất hiện 2 NST X, điều này phù hợp với kết quả của ADN phôi thai tự do và siêu âm sau này. 54
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, chứng minh được trong máu ngoại vi của mẹ từ tuần thứ 8 có xuất hiện TB phôi thai tự do bằng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang đặc hiệu NST Y. Nghiên cứu này góp phần mở ra một hướng mới trong chẩn đoán trước sinh các bất thường NST và bệnh di truyền bằng phương pháp không can thiệp. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bianchi DW, Flint AF, Pizzimenti MF, Knoll JH, Latt SA. Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood. Proc Natl Acad Sci USA. 1990, 87, pp.3279-3283. 2. Bianchi DW, Williams JM, Sullivan LM, Hanson FW, Klinger KW, Shuber AP. PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploid pregnancies. Am J Hum Genet. 1997, 61, pp.822-829. 3. Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, Sylvester S, DeMaria MA. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci USA. 1996, 93, pp.705-708. 4. Livak KJ, Flood SJ, Marmaro J, Giusti W, Deetz K. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods. 1995, 4, pp.357-362. 5. Lo YMD, Fleming KA, Wainscoat JS. Strategies for the detection of autosomal fetal DNA sequence from maternal peripheral blood. Ann N Y Acad Sci. 1994, 731, pp.204-213. 6. Lo YMD, Lo ESF, Watson N, Noakes L, Sargent IL, Thilaganathan B, Wainscoat JS. Two-way cell traffic between mother and fetus: biologic and clinical implications. Blood. 1996, 88, pp.4390-4395. 7. Simpson JL, Elias S. Isolating fetal cells from maternal blood: advances in prenatal diagnosis through molecular technology. JAMA. 1993, 270, pp.2357-2361. 8..Sohda S, Arinami T, Hamada H, Nakauchi H, Hamaguchi H, Kubo T. The proportion of fetal nucleated red blood cells in maternal blood: estimation by FACS analysis. Prenat Diagn. 1997, 17, pp.743-752. 9. Walknowska J, Conte FA, Grumbach MM. Practical and theoretical implications of fetal/maternal lymphocyte transfer. Lancet. 1969, 1, pp.1119-1122. 55