Tách chiết, tinh sạch adn từ các mẫu bị phân hủy trong thực nghiệm

Nội dung text: Tách chiết, tinh sạch adn từ các mẫu bị phân hủy trong thực nghiệm

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH ADN TỪ CÁC MẪU BỊ PHÂN HỦY TRONG THỰC NGHIỆM Trần Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang* Nguyễn Minh Hải**; Ngô Trường Giang* TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành trên 16 mẫu máu không bảo quản được xử lý ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian 2 tuần, 4 tuần, 8 tuần và 16 tuần, hoặc đun ở 1000C. Tiến hành tách chiết ADN bằng hạt từ tính, nhân gen GADPH, điện di kiểm tra sản phẩm PCR. Kết quả: các phản ứng PCR cho sản phẩm đặc trưng. Như vậy, tách chiết ADN bằng hạt từ tính, các mẫu ADN bị biến tính một phần có đủ chất lượng ổn định, đủ điều kiện để có thể tiến hành các phân tích tiếp theo. * Từ khoá: Nhận dạng cá thể; Mini STRs; Tách triết, tinh sạch ADN. DNA EXTRACTION AND PURIFICATION FROM EXPERIMENTALLY DEGRADED SAMPLES SUMMARY The study was carried out on 16 blood samples, which were not preserved for different period of time: 2 weeks, 8 weeks and 16 weeks in condition of 370C temperature with 100% humidity, and in boiling water for 30 minutes, 2 hours, 4 hours and 5 hours. DNA was extracted using both normal kit and magnetic particle based DNA IQ, Promega kit. DNA samples were evaluated using Nano Drop 1000. DNA amplification for mini STR analysis was conducted using PowerPlex S5, Promega, USA. Results: all mini STR markers were successfully amplified and informative thus it can be used for individual identification in case of samples partially degraded. * Key words: Individual identification; Mini-STRs; DNA extraction and purification. ĐẶT VẤN ĐỀ thời gian nhất định hoặc bị biến tính do các tác nhân lý hóa khác nhau [3, 4]. Trong lĩnh vực ADN pháp y, nhiều Chính vì vậy, việc tách chiết ADN đóng trường hợp mẫu bị biến tính sau một vai trò quan trọng để thu được mẫu ADN * Học viện Quân y ** Viện Y học Hàng không Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa (tranvankhoa@gmail.com) Ngày nhận bài: 8/10/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 7/11/2013 68
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 có đủ chất lượng và số lượng cho quá 5 mM, Taq polymerase 5 U/µl, nước cất trình phân tích tiếp theo (PCR) [2]. Để khử ion và khử trùng, nhóm hóa chất đánh giá, lựa chọn phương pháp tách dùng cho điện di agarose, đệm TBE, chiết ADN phù hợp, chúng tôi tiến hành ethidium bromide. Nhóm hóa chất dùng xử lý các mẫu máu trong những điều cho phản ứng nhân gen và phân tích kiện và thời gian khác nhau [1]. mini STR: powerplex S5 - promega, POP-4™ polymer (P/N 4352755), Hi- ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ DiTM formamide (P/N 4311320), máy PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ly tâm (Mikro 200 - Hittich, Đức), máy 1. Đối tƣợng nghiên cứu. PCR 9700 (ABI, Mỹ), bộ điện di agarose: 16 mẫu máu nghiên cứu được lấy và nguồn 300V, bể điện di (biorad, Mỹ), buồng thao tác PCR, block gia nhiệt, chống đông bằng EDTA 5 ml/mẫu. Chia máy khuấy từ, máy định lượng Nanodrop, mẫu máu làm 2 lô: có biến tính và không máy điện di mao quản 3130XL. biến tính. Cách thức xử lý như sau: mẫu máu đối chứng: Không xử lý gì, bảo 3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 0 quản ở nhiệt độ -80 C cho đến khi tách * Tách chiết ADN: chiết. Mẫu xử lý: tạo mẫu ADN biến Tách chiết bằng QIAamp ADN blood tính một phần bằng cách để mẫu trong mini kit đối với mẫu không biến tính theo môi trường với thời gian dài (không bảo quy trình của nhà sản xuất. quản). Xử lý tạo mẫu ADN biến tính Tách chiết bằng ADN-IQ system, thực nghiệm theo mô hình của Dixon và promega đối với mẫu biến tính theo quy CS 2006 [3]: để mẫu ở môi trường 370C trình như sau [5]: với độ ẩm 100% trong thời gian 2 tuần, 8 tuần, 16 tuần. Tạo mẫu ADN biến tính + Bước 1: chia nhỏ phần máu cho vào một phần bằng tác nhân nhiệt độ ở 1000C ống nghiệm. trong 30 phút, 2 giờ, 4 giờ và 5 giờ. + Bước 2: thêm lysis buffer, ủ 700C trong 30 phút để hoà tan mẫu. 2. Vật liệu nghiên cứu. + Bước 3: ly tâm để loại bỏ bớt tạp Nhóm hóa chất dùng cho tách chiết ADN: QIAamp ADN blood Mini Kit, chất. ADN-IQ system, promega. Nhóm hóa + Bước 4: thêm hạt từ tính để tạo chất dùng cho PCR: đệm enzyme Taq phức hợp "hạt từ tính-thành phần tích polymerase 10X, MgCl2 25 mM, dNTPs điện (-)". 70
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 + Bước 5: đặt ống nghiệm vào giá từ Thành phần phản ứng PCR: Powerplex tính để lọc lấy phức hợp. S5 5X Master Mix 5 µl, Power Plex S5 10X Primer Pair Mix 2,5 µl, ADN khuôn + Bước 6: rửa nhiều lần bằng wash 0,25 - 0,50 ng, nước cất vừa đủ 25 µl [6]. buffer để thu phức hợp "hạt từ tính - Nhân gen trên máy PCR 9700 (ABI - ADN" Mỹ) theo chu trình nhiệt. + Bước 7: để khô ở nhiệt độ phòng để loại bớt nước. NHIỆT ĐỘ THỜI GIAN SỐ CHU KỲ o + Bước 8: thêm elution buffer và ủ ở 96 C 2 phút 1 chu kỳ 650C trong 5 phút để tách ADN ra khỏi 94oC 30 giây hạt từ tính. 60oC 2 phút 30 chu kỳ + Bước 9: thu dung dịch ADN. 72oC 90 giây Sau khi thu được mẫu ADN, chúng 60oC 45 phút 1 chu kỳ tôi tiến hành định lượng và kiểm tra độ 4oC ∞ 1 chu kỳ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp định lượng trên máy đo quang phổ Điện di mao quản tự động trên hệ thống máy giải trình tự AB 3130XL, Nanodrop. phân tích alen: thêm 1 µl sản phẩm PCR * Phương pháp định tính, định lượng hoặc 1 µl của PowerPlex® S5 Allelic ADN: Ladder Mix. Biến tính 95 trong 3 phút, Sản phẩm ADN thu được sau quá sau đó để ngay trong đá 3 phút trước khi trình tách chiết được định lượng trên tra mẫu điện di. máy Nanodrop ở bước sóng 260/280 nm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ nhằm kiểm tra độ tinh sạch. 5 μl mỗi BÀN LUẬN mẫu ADN sau tách chiết cũng được điện 1. Kết quả tách chiết ADN. di trên gel agarose để kiểm tra chất lượng Đối với lượng máu, do hàm lượng ADN. Những mẫu có nồng độ thấp tiến ADN lớn nên khi tách xong, tiến hành hành nhân gen GADPH và điện đi để kiểm tra nồng độ ADN trên máy Nano đánh giá khả năng nhân gen với cặp mồi Drop, điện di trên gel agarose 0,8%, F-5’CCCCACACACATGCACTTACC-3’; nhuộm trong dung dịch EtBr 10 µg/ml, R-5’CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’. sau đó quan sát dưới ánh sáng tử ngoại * Phản ứng PCR nhân gen mini STR: bước sóng 254 nm. 71
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Bảng 1: Kết quả đo nồng độ và độ Bảng 2: Kết quả đo nồng độ tinh tinh sạch ADN tách từ 16 mẫu máu không sạch ADN tách chiết từ 16 mẫu máu bị biến tính. biến tính do nhiệt độ 1000C trong 5 giờ. NỒNG NỒNG NỒNG NỒNG ĐỘ ĐỘ ĐỘ ĐỘ MẪU A /A MẪU A /A MẪU A260/A280 MẪU A260/A280 ADN 260 280 ADN 260 280 ADN ADN (µg/µl) (µg/µl) (µg/µl) (µg/µl) 1 42,4 1,73 9 47,5 1,73 1 1,57 1,63 9 1,67 1,60 2 52,16 1,72 10 61,1 1,74 2 2,29 1,78 10 2,64 1,66 3 43,4 1,80 11 49,9 1,71 3 3,01 1,76 11 3,39 1,81 4 51,3 1,71 12 47,3 1,70 4 1,48 1,62 12 2,22 1,75 5 51,9 1,69 13 54,0 1,72 5 1,77 1,92 13 1,86 1,81 6 2,89 1,75 14 3,33 1,85 6 60,2 1,79 14 52,5 1,78 7 2,61 1,93 15 1,55 1,64 7 45,6 1,73 15 59,8 1,83 8 2,90 1,90 16 2,23 1,72 8 42,4 1,73 16 40,23 1,61 Mặc dù mẫu bị biến tính thu được Từ kết quả trên ta thấy, nồng độ ADN nồng độ thấp hơn các mẫu không bị biến khá cao, tỷ số A260/A280 là chỉ số để đánh tính, nhưng vẫn đảm bảo tinh sạch. Đối giá độ tinh sạch của ADN, nằm trong với mẫu máu bị biến tính một phần bằng khoảng 1,6 - 1,8: chứng tỏ ADN có độ thực nghiệm, tiến hành tách chiết thu sạch cần thiết cho nghiên cứu phân tích ADN bằng hạt từ tính. Sau tách chiết, điện di gel agarose kiểm tra không thấy tiếp theo. Với các mẫu này, chúng tôi xuất hiện băng. Để đánh giá khả năng cũng điện di agarose kiểm tra cho thấy nhân gen, chúng tôi sử dụng mồi GAPDH kết quả tốt (hình 1). Như vậy, cũng có để nhân gen này, sản phẩm PCR có kích thể đánh giá quy trình tách chiết ADN thước 97 bp. Dưới đây là hình ảnh điện không bị biến tính, có thể khẳng định di kiểm tra sản phẩm sau PCR. dùng kit thông thường hoàn toàn tốt. Hình 1: Ảnh điện di kiểm tra ADN trên gel agarose 0,8% với các mẫu không biến Hình 2: Ảnh điện di mẫu biến tính tách tính được tách bằng kit thông thường. bằng kit thông thường. 72
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Từ trái sang phải: chứng âm, chứng Từ trái sang phải: chứng âm, chứng dương, marker ADN 100 bp, 2 mẫu biến dương, marker ADN 100 bp. Hàng trên: tính 8 tuần: 1 mẫu (+), 1 mẫu (-), mẫu các mẫu biến tính 8 tuần; hàng dưới các biến tính nhiệt 30 phút (+), 3 mẫu biến mẫu biến tính 16 tuần. tính nhiệt 5 giờ đều (-). 2. Kết quả bƣớc đầu xác định kiểu gen của các locus STR trên máy giải trình tự gen. Với các mẫu ADN thu được, tiến hành phản ứng nhân gen để xác định khả năng nhân gen và phân tích mini STR. Sử dụng bộ kit nhân gen Powerplex S5 PCR Amplification kit. Đây là bộ kit cho phép đồng khuếch đại và phát triển 5 locus bao gồm cả D8S1179, D18S51, FGA và TH01. Đối với các mẫu này, sau khi chạy Hình 3: Ảnh điện di mẫu biến tính tách điện di kết quả thu được xử lý bằng phần bằng hạt từ tính. mềm Genemapper ID 3.2. Phần mềm này sẽ so sánh kích thước các băng ADN thu Từ trái sang phải: chứng âm, chứng được ở mẫu nghiên cứu với những băng dương, marker ADN 100 bp. Hàng trên: tương ứng trên thang alen chuẩn và cho các mẫu biến tính 8 tuần và biến tính kết quả chi tiết về kiểu gen của từng locus nhiệt 5 giờ; hàng dưới: các mẫu biến tính như hình minh họa ở hình sau. nhiệt 5 giờ. Hình 4: Ảnh điện di mẫu biến tính tách Hình 5: Hình ảnh điện di của mẫu số 2 bằng hạt từ tính. không bị biến tính. 73
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 được các thang alen đặc trưng cho từng locus ở từng dye khác nhau, đem so sánh với thang alen chuẩn sẽ xác định được kiểu gen. Nhìn vào hình 5 thấy các locus Amello, D18S51, TH01, FGA là dị hợp tử khi thực hiện điện di xuất hiện 2 băng khác nhau, còn locus D8S1179 là đồng hợp tử khi tiến hành điện di xuất hiện một băng duy nhất. Tiến hành điện di tương tự mẫu số 02 bị biến tính do nhiệt độ thể hiện ở hình 6, thấy kích thước của băng điện di thấp hơn so với kích thước điện di của mẫu không bị biến tính nhưng Hình 6: Ảnh điện di của mẫu số 2 bị vẫn có thể xác định được kiểu gen. biến tính một phần do nhiệt độ. Qua phân tích, chúng tôi thu được bảng số liệu gồm kiểu gen các alen của Các locus mang kiểu gen dị hợp tử sẽ từng locus của mẫu không bị biến tính, có hai băng có kích thước khác nhau, bị biến tính do nhiệt độ và bị biến tính còn các locus có kiểu gen đồng hợp tử do môi trường (số liệu trình bày chung thì thu được một băng duy nhất. cho các điều kiện biến tính). Khi tiến hành điện di huỳnh quang với mẫu số 02 không bị biến tính, thu Bảng 3: Kiểu gen dựa trên marker mini STR của 16 mẫu. MẪU AMELLO D18S51 D8S1179 TH01 FGA 1 X Y 15 21 10 12 7 9 21 25 2 X Y 14 18 8 10 6 10 24 27 3 X Y 14 15 12 17 7 10 17 24 4 X Y 15 16 10 13 9 9.3 25 25 5 X Y 16 19 13 13 6 9 18 22.2 6 X Y 15 20 10 14 7 9 21 25 7 X Y 14 16 12 15 7 7 20 21 8 X Y 13 15 12 14 9 9 23 25 9 X Y 14 15 11 15 7 9.3 21 22 10 X Y 12 15 11 15 9 10 17 21 11 X Y 13 21 14 14 6 9 21 23 12 X Y 13 17 10 15 7 8 19 21 74
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) 13 X Y 15 16 10 10 9 10 21 22 14 X Y 14 19 11 16 8 9 19 23 15 X Y 14 15 10 19 7 7 21 24 16 X Y 13 16 13 15 7 8 22 23 7 X Y 14 16 12 15 7 7 20 21 8 X Y 13 15 12 14 9 9 23 25 9 X Y 14 15 11 15 7 9.3 21 22 10 X Y 12 15 11 15 9 10 17 21 11 X Y 13 21 14 14 6 9 21 23 Kết quả nghiên cứu này với mẫu bình thường và mẫu bị biến tính trong những điều kiện khác nhau đều thu được thông tin cần thiết. Như vậy, có thể kết luận phương pháp tách chiết đối với những mẫu bị biến tính hoàn toàn tốt. Một số tác giả đã sử dụng tách bằng hạt từ cũng cho kết quả tốt [1]. Các locus gen có tỷ lệ dị hợp tử cao, bước đầu có thể đánh giá khả năng nhận dạng trên mẫu nghiên cứu. KẾT LUẬN 2. Carracedo A. and Lareu MV. Proceedings Qua tách chiết và đánh giá chất lượng of the ninth international symposium on 16 mẫu ADN bị phân huỷ một phần thực human indentification. Madison WI: Promega nghiệm, chúng tôi rút ra kết luận: sử corporation. 1998, pp.89-107. dụng phương pháp tách chiết bằng hạt từ 3. Dixon LA, Dobbins AE, Pulker HK et al. Analysis of artificially degraded DNA using tính đối với mẫu ADN bị phân huỷ một STRs and SNPs - results of a collaborative phần có thể thu được mẫu ADN đủ điều European (EDNAP) exercise. Forensic Science kiện để cho phân tích mini STR trong International. 2006, 164, pp.33-44. công tác nhận dạng cá thể. 4. Madisen L, Hoar DI, Holroyd CD, TÀI LIỆU THAM KHẢO Crisp M, ADN Hodes ME. DNA Banking: 1. Barbara Haak, Andrea Porsche, Kai the effects of storage of blood and isolated Vollack, Peter Zimmermann, Werner Pflug. DNA on the integrity of DNA. Am Z Med Evaluation of a semi-automated, magnetic Genet. 1987, 27, p.379. bead-based DNA extraction method for genetic 5. Promega. Technical Bullentin for use fingerprinting of forensic casework samples. with DNA IQ. Forensic Science International: Genetics 6. Promega. Technical manual PowerPLexS5 Supplement Series 1. 2008, pp.35-36. System. 75